Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Bu yöntem, protein etkileşimlerinde tek bir proteinin ne kadar güçlü olduğu gibi biyofiziksel alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok çeşitli farklı biyomolekülleri hareketsiz hale getirmek için kullanılabilmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, atomik kuvvet mikroskobu konsol probunun kullanımı ve atomik kuvvet mikroskobunun kendisinin çalışması zor olabileceğinden mücadele edebilir.

Başlamak için aside dayanıklı eldivenler, koruyucu gözlükler ve laboratuvar önlüğü giyin. Çeker ocak altında, tüy bırakmayan hassas mendillerde izopropanol kullanın. Birkaç cam slayttaki kaba tozu ve kirleri temizleyin.

Temiz slaytları, iki kat damıtılmış su ile seyreltilmiş hidroklorik asitle doldurulmuş ayakta duran bir kavanoza aktarın. Kavanozu uygun bir kapakla kapatın ve oda sıcaklığında 90 dakika boyunca ultrasonik banyoya koyun. Ardından, silisyum nitrür AFM konsol problarını, ucu yukarı bakacak şekilde temiz bir cam kızağa aktarın.

Slaytı UV ışığı geçirimsiz bir odaya aktarın ve slaytı en az 90 dakika boyunca yukarıdan ultraviyole ışıkla ışınlayın. Bundan sonra, boyama kavanozundaki hidroklorik asidi iki kat damıtılmış suyla değiştirin ve cam yüzeyin kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Kavanozu kapakla kapatın ve 10 dakika daha ultrasonik banyoya geri koyun.

Bu arada, Etoksi silan polietilen glikol asidini etanol ve iki kez damıtılmış su karışımında mililitre başına 0.1 miligramlık bir nihai konsantrasyona kadar çözün. Etanolün buharlaşmasını önlemek için bu çözeltiyi hava geçirmez şekilde kapatın. Hazır olduğunda, silan çözeltisini iki ayrı Petri kabına dökün.

Temiz cam slaytları bir Petri kabına ve konsolu diğerine yerleştirin. Parafilm kullanarak, etanolün buharlaşmasını önlemek için her iki plakayı da hava geçirmez şekilde kapatın. Sabit plakaları oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin.

Bundan sonra, hem konsolu hem de cam kızakları yıkamak için saf etanol içeren üç ardışık beher kullanın. Yıkanmış konsolu temiz bir cam sürgün üzerine yerleştirin. İşlevselleştirilmiş cam slaytları boyama kavanozuna aktarın.

Her ikisini de 110 derecelik bir fırında 30 dakika kürleyin. Ardından, silanize cam numuneleri ve konsolu bir haftaya kadar vakumlu desikatörde saklayın. Proteinlerin rastgele immobilizasyonuna başlamaya hazır olduğunuzda, metin protokolünde belirtildiği gibi standart fosfat tamponlu salin içinde EDC ve NHS içeren bir çözelti hazırlayın.

Silan kaplı cam slaytları bu solüsyonla örtün. Sililanize konsol problarını bir damla ECD/NHS çözeltisine yerleştirin. Her ikisini de oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Ardından, fazla EDC/NHS'yi tamamen yıkamak için hem konsolu hem de kızakları art arda üç beherde durulayın. Aktif cam slaytları ıslak bir doku ile donatılmış bir Petri kabına aktarın. Cam slaytların EDC / NHS ile aktive edilen alanına istenen protein çözeltisinden bir damla ekleyin ve Petri kabını parafilm kullanarak kapatın ve probları oda sıcaklığında inkübe edin.

Islak bir doku ile donatılmış konsol kutusuna istenen protein çözeltisinden bir damla ekleyin. Ardından, konsol problarını PBS ile iyice yıkayın. Probları kutudaki damlacığa yerleştirin ve kutuyu kapatın.

Probları oda sıcaklığında inkübe edin. Bundan sonra, cam slaytların arka tarafındaki protein damlacığı alanını işaretleyin. Hem cam kızakları hem de konsol problarını PBS ile doldurulmuş üç ardışık beher kullanarak iyice yıkayın.

Yıkanmış probları oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Tris tamponlu salin içeren bir kaba yerleştirin. Ardından, cam kızakları ve konsol problarını PBS ile iyice yıkayın. Kullanıma hazır olana kadar PBS ile kaplı ayrı Petri kaplarında saklayın.

Yeni temizlenmiş bir cam sürgüyü AFM numune tutucusuna sabitleyin ve PBS tamponu ile kapatın. Ardından, hazırlanan konsol probunu konsol tutucusuna sabitleyin ve AFM kafasına yerleştirin. Konsolu bir damla PBS tamponu ile dikkatlice ıslatın.

Konsol PBS tamponuna tamamen daldırılana kadar, ancak yine de kalibrasyon yüzeyinden uzağa gidene kadar konsolu yavaşça kalibrasyon yüzeyine doğru hareket ettirin. Lazeri konsolun arka tarafına yerleştirmek için AFM'nin üstten görünüm optik mikroskobunu veya ters çevrilmiş mikroskobunu kullanın. Lazer noktasını konsolun ucuna, ucun bulunduğu yere yakın bir yere yerleştirin ve AFM'nin dört kadranlı dedektör fotodiyotundaki konumu, yansıyan lazer ışını fotodiyotun merkezine yerleştirilecek şekilde ayarlayın.

Ardından, AFM yazılımında kalibrasyon yöneticisini açın. Konsol hassasiyetini ve yay sabitini kalibre etmeye başlamak için, alt tabaka yüzeyine dikkatlice yaklaşın ve bir kuvvet mesafesi eğrisi kaydedin. Optik kol hassasiyetini belirlemek için, ucun alt tabaka yüzeyiyle temas halinde olduğu geri çekme kuvveti eğrisinin en dik kısmına düz bir çizgi yerleştirin.

Konsolu numune yüzeyinden geri çekin ve konsol yüzeyden en az 100 mikron uzakta olacak şekilde birkaç termal gürültü spektrumu kaydedin ve konsolun yay sabitini belirlemek için AFM yazılımı tarafından sağlanan harmonik bir osilatörü termal gürültü spektrumlarına takın. Bundan sonra, konsolu yavaşça geri çekin ve çözeltiden çekin. Konsol kalibrasyonu için kullanılan cam yüzeyi çıkarın ve hareketsiz hale getirilmiş proteinleri içeren numune yüzeyi ile değiştirin.

Nemli konsolu yavaşça hareket ettirinamples yüzeye doğru hareket ettirinample, konsol tamamen PBS tamponu ile kaplanana kadar, ancak yine de alt tabaka yüzeyinden uzağa kadar. Yüzeye yaklaşın ve 250 pikonewton'luk bir temas kuvveti, bir saniyelik bir temas süresi, iki mikrometrelik bir geri çekme uzunluğu ve saniyede bir mikrometrelik bir geri çekme hızı ile numune yüzeyinin farklı konumlarında çoklu kuvvet mesafesi eğrilerini kaydedin. Veri işleme yazılımında, ölçülen kuvvet eğrisi dosyalarını açmak için Open batch of Force Scan'i seçin.

Konsol sapmasını doğru orantılı kuvvete dönüştürmek için Yay Sabiti'nde Hassasiyeti Ayarlayarak V Sapmasını Yeniden Kalibre Et'i seçin. Ardından, kuvvet eğrisinin yüzeyden uzak bir bölgesindeki geri çekme kanalının taban çizgisini çıkarmak için Taban Çizgisi Çıkarma'simgesini seçin, bu aynı zamanda sıfır kuvvet seviyesini de ayarlar. Ucun numune ile temas ettiği noktayı tanımlamak için Temas Noktası Belirleme' simgesini seçin.

Yükseklik sinyalini uç numune ayrımına dönüştürmek için Uç Numune Ayrımı'simgesini seçin. Temas noktası konumunun çıkarılmasına ek olarak, bu, alt tabaka yüzeyi ile AFM ucu arasındaki mesafeyi hesaplamak için konsol bükülmesini çıkarır. 70 nanometrenin üzerindeki kopma uzunluklarında meydana gelen kuvvet tepe noktaları için kuvvet mesafesi izlerini taramak için Fit a Polymer Chain Model'simgesini seçin ve Extensible Worm-like Chain'modelini seçin.

Spesifik olmayan etkileşimleri sıralayın ve genişletilebilir solucan benzeri zincir modelini seçilen tepe noktalarına uygulayın. Bu çalışmada, proteinler, erişilebilir birincil aminleri aracılığıyla rastgele oryantasyon ile kovalent olarak immobilize edilir. Sililanize polimer tabakasının bir AFM görüntüsü, yükseklikleri yaklaşık iki ila beş nanometre arasında değişen yalnızca küçük yüzey oluklarını gösterir.

Bununla birlikte, fibronektin ile işlevselleştirilen yüzeyin yaklaşık 10 nanometre yüksekliğinde fibronektin moleküllerine sahip olduğu görülmektedir. Daha yakından incelendiğinde, moleküllerin dimerik yapısının tanınabileceği ortaya çıkar. Bu moleküller, PEG yüzey kaplamasının üzerinde dört ila beş nanometre yüksekliğe ve yaklaşık 120 nanometre uzunluğa sahip kompakt görünmektedir.

RRGA'nın fibronektin ile etkileşim kuvvetleri daha sonra araştırılır. Saniyede bir mikronluk bir kutup hızında kaydedilen temsili uçlu numune ayırma eğrileri, düşük arka plan etkileşimi ve iyi şekillendirilmiş etkileşim olayları gösterdi ve bunlar daha sonra genişletilebilir bir solucan benzeri zincir modeli kullanılarak takıldı. Bu uyumun sonuçlarının çizilmesi, PEG bağlayıcılarının gerilmesinde spesifik olmayan yüzey etkileşimlerinin üstesinden geldikten sonra, kuvvet eğrilerinin %19'una kadarının, RRGA fibronektin etkileşimi için ortalama 52 pikonewton kopma kuvveti ile ve yaklaşık 100 nanometrelik bir uç numune mesafesinde kopma olaylarına sahip olduğunu göstermektedir.

Bu prosedürü denerken, temas süresi veya geri çekme hızı gibi ayarlara bağlı olarak, tek molekül kuvvet spektroskopisi verilerinin birden fazla bilgi içerdiğini ve bu protokolün yalnızca tam veri analizine yönelik ilk adım olabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu yöntem, tek molekül etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilirken, tek hücre düzeyindeki etkileşimleri incelemek için de kullanılabilir. Bu prosedürü takiben, tüm hücrelerin protein kaplı yüzeylerle nasıl etkileşime girdiği gibi ek soruları yanıtlamak için tek hücre kuvvet spektroskopisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Asitler ve UV ışığı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken aside dayanıklı eldivenler ve UV ışığı geçirimsiz oda gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.