Name: Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, Nicotiana benthamiana yapraklarında geçici ifade ile triterpen üretimi için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem. Agrobacterium ko-infiltrasyonu ile çoklu enzim kombinasyonları kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser bir Norwich araştırma Park öğrencilik (JR) tarafından desteklenen, ortak mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi/Biotechnological ve OpenPlant Sentetik Biyoloji Araştırma Merkezi Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi BBSRC tarafından finanse edilen hibe (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); John Innes merkezi bilgi değişimi ve ticarileştirme vermek (BB/KEC1740/1) (BB); ve BBSRC Enstitüsü Stratejik programı Grant 'Molekülleri doğadan' (1/P012523/BB) ve John Innes Vakfı (Ao). George pEAQ vektörler sağlamak için Lomonossoff ve Andrew Davis Fotoğrafçılık için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triterpene+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li>
<li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P450s+and+UGTs%3A+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li>
<li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limonoids%3A+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li>
<li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra02784a">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li>
<li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+oleanane+triterpenoids%3A+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li>
<li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li>
<li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenosides+chemistry%2C+biosynthesis%2C+analysis%2C+and+potential+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Food+and+Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li>
<li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li>
<li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pEAQ+vector+series%3A+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li>
<li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pEAQ%3A+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li>
<li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li>
<li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li>
<li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li>
<li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+extraction+techniques+for+natural+products%3A+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li>
<li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li>
<li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li>
<li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li>
<li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li>
<li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li>
<li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yerine aracılığıyla yüksek vakum infiltrasyon rutin olarak bizim laboratuvar olarak çeşitli aşağı akım uygulamaları için ilgi triterpen bileşiklerin partiye hazırlık üretimi için kullanılan için bu iletişim kurallarını sağlar. Burada açıklanan vakum infiltrasyon aparatı kolayca çoğaltılır. Ayrıca vakum baraj gölünün sadece infiltrasyon odası olarak değiştirilmemiş bir vakum fırını repurpose mümkündür ancak gerekli vakum çekmek için gereken süreyi azaltmak için tavsiye edilir. Vakum Pompası uygun bir kondansatör ilavesi ile korumak teorik olarak mantıklı değil, ama bizim laboratuvarda bunun gereksiz olduğunu bulduk.
Yaprakları tamamen infiltrasyon süspansiyon dalmış değil eğer infiltrasyon kapsama güvenilir değil. Bu sorun süspansiyon seviyesi üst yüzeyi bitki sahibinin ulaşır ve bitki sahibi infiltrasyon banyo için sıkı bir seçimdir sağlayarak küçültülür. Şekil 2 ' den bitki sahibinin üst yüzeyi içinde yer ne zaman infiltrasyon banyo için gömme olduğunu unutmayın. Bu paneller infiltrasyon banyo üst bağlantı noktasını oluşturan orta kenarları sahibinin tarafından sağlanır. İnfiltrasyon süspansiyon süspansiyon düzeyde tutmak için dönemsel eklemeler gerektirir. Bu en iyi OD600 kademeli azaltma büyük bir batch-wise infiltrasyon boyunca önlemek için aşırı infiltrasyon süspansiyon eklenmesiyle elde edilir. Bu soruşturma quantitively henüz rağmen ancak, bizim ellerimizde ikame su için partiye hazırlık bir ölçekte, göze çarpan etkisi beklenen verimi için görünmüyor. Kaç bitkiler infiltrasyon süspansiyon bir toplu işleminden sızmış hala açık bir soru var. Biz düzenli olarak tek bir toplu iş infiltrasyon süspansiyon, 100 ve 200 bitkilerle arasında sızmak. Buna ek olarak, bazı toprak sızma süspansiyon infiltrasyon işlemi boyunca leach normaldir. Bu infiltrasyon etkinliği üzerinde fark edilebilir bir etkisi için bulunamamıştır.
Hasat sırasında tavsiye (ama kritik değil) sadece sızmış yaprakları toplamaya (biraz yaprak sonrası infiltrasyon büyüdü). Seçici hasat ile Aksi takdirde endojen kirleri göre bileşik faiz oranını artıracak verimsiz doku seyreltme engeller. Bu aşağı akım arıtma kolaylığı nominal bir etkisi vardır ve bu işlemlerin ölçeğini artırır. THMGR habercisi kaynağı artırmak için kullanırken, necrosed bir fenotip sonrası infiltrasyon büyüme döneminde geliştirmek için sık sık görülmektedir. Bu normaldir ve aslında seçici hasat ve aşağı akım kurutma işlemi yardımcı olur. Kurutulmuş yaprak toz genellikle serin, Kuru ve karanlık bir yerde, ama ideal bir desiccator vakum altında kapalı bir kap içinde saklanır. Bu bileşik baktılar istikrar üzerinde bağlıdır. -80 ° C buzlukta saklamak için tercih eğer dikkatli olun. Kurutulmuş sağlamak yapraklar su geçirmez bir kap içinde ve kaldırma depolama, oda sıcaklığında açılış öncesinde ısıtmak için bu kapsayıcıdaki izin. Aksi halde aşağı-stream işleme engelleyen yaprakları, rewetting neden olur.
Bu iletişim kuralı hasat sonrası adımlarda görsel amacıyla sağlanmaktadır ve yardım etmek için pratik Kimya sınırlı olabilir bu araştırmacılar deneyim. Onlar birçok diğer doğal ürün çıkarma/arıtma teknik yedek olabilir. Ayrıntılı olarak giriş, PSE pek çok avantajı vardır, ancak sermaye piyasada bulunan PSE cihazları mal engelleyici olabilir ve gerekli değil. Temel iyon değiştirme reçine tedavi geleneksel sabunlaşma sıvı/sıvı bölümleme tarafından takip değiştirmek için çok uygun bir yöntemdir. Ancak, karboksilik asit grubu veya esterleri gibi temel koşullar altında hidrolize fonksiyonel gruplar içeren ürünler için uygun değildir. Bu ürünler üzerinde temel iyon değiştirme reçine korunabilmesi için beklenir. Ancak, bu bir yakalama için yararlanmak ve yordam (burada belgelenen değil) serbest bırakmak için potansiyel olduğunu. Geleneksel sabunlaşma uygun olacağını nerede temel iyon değiştirme reçine tedavi uygun bir alternatif hizmet vermektedir. Adım 9, açıklanan Kromatografi yöntemi Şekil 3' te açıklanan bileşikler için genelleştirilebilir olmak bulunmuştur. Ancak, artan polarite bileşikleri uzun bir % 100 etil asetat elüsyon süre gerektirebilir. Adım 9.2, referansla aşağı akım iyi arıtma tamamen bileşik özeldir ve aynı zamanda ölçekte bağlıdır. En iyi duruma getirilmiş degradelerle daha küçük ölçekli flash Kromatografi tekrarlanan tur bir saflık NMR analizi için uygun ulaşmak için genellikle yeterli. Daha büyük ölçeklerde kristalizasyon kez uygun bir alternatiftir. Zor durumlarda, partiye hazırlık veya yarı partiye hazırlık yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) izole bileşik istenen miktarı bağlı olarak istihdam edilebilir. Aşağı akım arıtma işlemleri için temsilci bileşikleri bir dizi örnekleri8başka bir yerde bulunabilir.
Geçerli protokol, burada anlatılan gibi bizim laboratuarda rutin olarak kullanılan ve yardımcı programı kanıtlamıştır. Ancak, daha fazla en iyi duruma getirme ifade platformu için hala önemli kapsam vardır. Nasıl daha fazla yolu mühendislik araştırmak için bizim laboratuvar çalışmalar sürmektedir ve protein ifade düzeyleri fark kontrolünü toksisite konak hücreleri için arabuluculuk sırasında triterpen üretim daha da artırabilirsiniz. Ayrıca hücre içi taşıma sistemleri20,21manipülasyon ve enzimler artırabilirsiniz yolları farklı hücresel kompartmanlarda22,23, yönünü araştırmak için potansiyel mevcuttur birden çok oksidasyon olayı verimliliği. Anahtar organelleri temel morfolojisi değiştirme için potansiyel yararları da keşfedilmeyi. Örneğin, Arabidopsis thaliana HMGR membran etki alanının overexpression bitkiler24endoplazmik retikulum hipertrofisi ikna etmek için gözlenen; CYP450 etkinliği için önemli bir site. Bu iletişim kuralı ideal miligram triterpen ürünler miktarlarda gram-ölçek için üretimi için uygundur ve bir araştırma ortamda bileşikleri aşağı akım çalışma (Örneğin, sistematik araştırma yapısı-faaliyet için erişmek için istihdam edilecek ilişkiler ve farmakokinetik ve farmakodinamik özellikleri için ön soruşturma kurşun bileşikleri klinik ilgi). Ancak, doğrusal bir platformdur ve güvenilir bir şekilde ölçeklenebilir yeterlidir numarası kullanılan bitkilerin ve agroinfiltration üzerinden geçici ifade pratiklik artırarak ilaç proteinleri için endüstriyel ölçekte gösterilmiştir 14, böylece orada potansiyel yüksek değerli triterpeneler ticari üretimi için genişletilmesi bu platform için. Alternatif olarak, kesinleşmiş arzu multigene biyosentetik yol gidiyorsun, toplu işleme izin sağlam transformants üretim hayal etmek mümkün ve devam eden 'Transgenik i. benthamiana Tarım' da suşları ticari değeri farklı bileşikler üreten.

Triterpeneler en büyük ve bitki doğal ürünlerin çoğu yapısal olarak farklı aileler vardır. Onların büyük çeşitlilik rağmen tüm triterpen doğal ürünler aynı doğrusal habercisi 2,3-oxidosqualene, bitkilerde mevalonate yolun bir ürün türetilen inanılıyor. 2,3-oxidosqualene cyclization başlatılan ve bir aile oxidosqualene cyclases (OSCs) olarak adlandırılan enzimler tarafından kontrol edilir. Bu cyclization adım doğa1' den bildirilen farklı triterpen iskele yüzlerce çeşitlendirme, ilk düzeyini temsil eder. Bu iskele daha da dahil ancak bununla sınırlı olmamak üzere, sitokrom p450s (CYP450s)1,2enzimler uyarlayarak çeşitlendirilmiş. Biyosentetik böyle yolları bazen üst triterpen zar zor tanınabilir olan son ürünleri sonuçlanan büyük karmaşıklık yol açabilir. Örneğin, güçlü böcek ve antifeedant limonoid azadirachtin karmaşık yapısını tirucallane tür3bir tetracyclic triterpen türetmek için inanılır.
Birçok triterpen elde edilen doğal ürünler, nispeten değiştirilmemiş üst iskele, hatta olanlar medicinally ilgili biyolojik etkinlik4,5,6,7sahip gösterilmiştir. Ancak, şu ana kadar bu potansiyeli triterpen türevi ilaçlar klinikte bir bolluk içine çevrilmiş olmayışıdır. Belki bu (en azından kısmen) sınırlı pratik sentetik erişim için bu sınıfa bileşik bir sonucu yapısı-etkinlik ilişkiler keşif ve gelişimi bastırmak bir sorun kurşun, adaylar tarafından geleneksel tıbbi Kimya iş akışları.
İ. benthamiana yaprakları diğer bitki tür triterpen biyosentetik enzimlerin geçici ifade 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri (Şekil 1) doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Bu işlem işlevsel olarak karakterize aday enzimler ve önemli doğal olarak meydana gelen metabolitleri biyosentetik yolları yeniden oluşturmak için kullanılabilir. Aynı şekilde, o da birleşimsel biyosentetik yaklaşımlar roman triterpen ürünler, yapısal olarak ilgili analogları, sistematik araştırma yapısı-aktivite ilişkileri izin kitaplıklarda neden olabilir bir strateji üretmek için yararlanılabilir 8,9biyolojik olarak aktif kurşun bileşikleri.
Agroinfiltration i. benthamiana yaprakları geçici ifade ulaşmada etkin ve basit bir yoludur. İşlem yaprakları infiltrasyonu ile ikili ifade construct(s) ilgi taşıyan A. tumefaciens süspansiyon içerir. Bu hücreler arası uzayda Hava yerinden ve eski yerine koymak o ile A. tumefaciens süspansiyon stoma bantlı yoluyla sıvı zorlar basınç uygulanması yoluyla elde edilir. Bakteri ilgili T-DNA'lar bitki hücrelerinin infiltre yaprak doku ifadede yerelleştirilmiş ve geçici protein sonuçlanan iç transfer.
Transgenik bitkiler üretme geçici ifade için istihdam için herhangi bir ikili vektör uygun biz börülce mozaik virüsü CPMV elde edilen Hypertranslational (HT) protein ifade sistem10, kullanmak 11. bu sistemde faiz gen çevrilmeyen bölgeler (UTR) CPMV RNA-2 üzerinden tarafından çevrili olduğunu. 5' UTR viral çoğaltma12üzerinde hiçbir güven ile protein çeviri çok yüksek düzeyde kaynaklanan değişiklikler içerir. Bu teknik siteye özgü rekombinasyon Protokolü uyumlu yapıları (pEAQ -HT- DEST)10,11klonlama içerir kolay ve hızlı (pEAQ) ikili vektör serisi geliştirilmiştir. Çoğu pEAQ vektörler de bir domates gür dublör virüs kaynaklı P19 silencing baskılayıcı gen13 ayrı bir P19 taşıyan yük coinfiltrate gerek kaçınmanızı sağlar ve çok affords ifade kaset T-DNA bölümü içinde içerir üst düzey protein ifade ana bitki hücre10,11.
İ. benthamiana bir ifade ana bitki biyosentetik yolları ile çalışırken belirli avantajları olduğu gibi kullanın. Hücre mimarisi özünde uygun mRNA ve protein işleme ve ek olarak gerekli Co enzim, redüktaz (için CYP450s) ve metabolik değişimler haiz uygun bölmelere destekler. Fotosentez karbon kaynağıdır; Böylece, bitkiler sadece kaliteli kompost, sadece su, CO2 (havadan) ve güneş ışığı girişleri gerektiren içinde yetiştirilen olabilir. Bu uysalca büyük multigene ifade oluşturmak gerek inkâr A. tumefaciens, farklı suşları Co infiltrasyonu tarafından elde edilebilir gibi platform da son derece farklı kombinasyonlar proteinlerin, ortak ifade için uygundur kaset. Ayrıca, süreç sürekli ve güvenilir bir şekilde yalnızca denemede kullanılan bitkiler sayısını artırarak ölçeklendirilebilir.
Önceki bizim laboratuvar çalışmalarında yardımcı programı bu platformun partiye hazırlık ölçekli deneyler için göstermiştir. Bu roman triterpeneler hazırlık bioactivity deneyleri ve ölçek için kadar izole ürün gram miktarda elde etmek için dahil. Ayrıca, hànzú triterpen ürünlerin birikimi arttı birkaç bir redüktaz (tHMGR), hızı sınırlaması bir N-terminal-kesme, geribildirim-duyarlı şeklinde 3-hidroksi, 3-methyglutary-koenzim ortak ifade tarafından katlayın ters yönde enzim mevalonate yolu8.
Yetenek kolayca yukarı ölçekli infiltrasyon işlemi tür hazırlık ölçekli deneyler anahtarıdır. Tipik bir deneyde, onlarca yüzlerce bitkilerin izole ürünün hedef miktarını elde etmek için gerekli olabilir. Tek tek yaprakları elle infiltre (gereksiz kullanarak) operasyonel zorlu ve genellikle çok zaman alıcı, bu yöntem rutin ölçek-up için pratik oluşturma. Operatör beceri seviyesine bağlı değildir ve yaprak yüzeyinde daha büyük bir alanı infiltrasyonu sağlar gibi vakum infiltrasyon el infiltrasyon, avantaj sunar. Bu yordam ticari ilaç proteinler14büyük ölçekli üretim için kullanılır. Bu iletişim kuralı piyasada bulunan parçalar inşa edilebilir bir kolayca yinelenebilir vakum infiltrasyon aparat kullanır. Bu 4 bitkiler, hızlı ve pratik batch-wise infiltrasyonu bitkiler yüzlerce kısa bir süre içinde saglayan eşzamanlı infiltrasyonu sağlar (Şekil 2a -2b). Vakum infiltrasyon aparatı infiltrasyon odası (Şekil 2f) formları bir vakum fırından oluşur. Fırın bir pompa vakum su deposu üzerinden bağlanır. Bu büyük ölçüde infiltrasyon odası istenen boşlukta ulaşmak için gereken süreyi azaltır. Bitki bir ısmarlama sahibi güvenli ve A. tumefaciens süspansiyon ile dolu bir 10 L paslanmaz çelik su banyosu içine ters (Şekil 2a -2 c). Bitkiler hava parçaların komple daldırma için verimli infiltrasyon önemlidir. Su banyosu sonra infiltrasyon odası içinde yerleştirilir (Şekil 2B -2e) ve hava yaprak interstisyel alanlarda dışarı çekmek için uygulanan vakum. Basınç 880 mbar (yaklaşık 1 dakika sürer bir işlem) tarafından düşürülmüştür bir kez infiltrasyon odası hızlı bir şekilde geri atmosfer basıncı getirdi bunun üzerine sızma tamamlandıktan fırın giriş vana açarak 20-30 s.
Beş gün sonra infiltrasyon bitki materyali toplama ve sonraki çıkarma ve izole edilmesi istenen ürün (ler) için hazırdır. Bu noktadan sonra sadece bir doğal ürün çıkarma ve arıtma yaprak malzeme, herhangi bir doğal ürün kimyager aşina olan bir iş akışının işlemidir. İlk çıkarma ve sonraki arıtma için birçok farklı yöntem15adlı biri yok. En uygun seçimi yöntemleri ve kullanılan kesin şartlar bahçedeki ilgi yanı sıra beceri ve/veya ekipman kullanılabilirliğini belirli kimyasal özellikleri son derece bağlıdır. Bu protokol için hasat bitki yaprak malzeme körü körüne herhangi bir faiz triterpen ürün için takip edilebilir izole ürün için aşağı akım işlenmesi için bir tam genelleştirilebilir, adım adım yöntemi dahil etmek mümkün değildir, ne de çok olur Bunu yapmak denemek uygun. Ancak, bu iletişim kuralı, bizim laboratuvar ve deneyimlerimize en oksijenli aglycone triterpen ürünler için genelleştirilebilir kanıtladık işleminin, erken aşamaları için bazı yöntemler kullanılan temel iş akışı genel bakış sağlar. Bu iki nispeten nadir teknikleri, yani, basınçlı Solvent Ekstraksiyon (PSE) ve güçlü temel iyon değiştirme reçine kullanarak klorofil kaldırma için uygun hànzú faz yöntemi içerir.
PSE katı matrisleri küçük organik moleküllerin çıkarılması için son derece etkili bir tekniktir. Çekimi (ca. 100-200 bar) basınç altında gerçekleştirilir, kaynama aşan hafifletilmiş sıcaklıklar kullanabilme olmanın en büyük avantajı ayıklama solvent gelin. Bu önemli ölçüde zaman ve solvent ayrıntılı bir emme, basit refluxing veya Soxhlet çekimi16gibi diğer sıcak solvent teknikleri karşılaştırıldığında elde etmek için gerekli miktarı azaltabilir. Ticari tezgah üstü PSE aletleri are elde edilebilir, hangi değiştirilebilir ayıklama hücre ve taşıma, Isıtma ve izleme otomatik çözücü kullanmak. Bu bu teknik son derece elverişli hale getirir. Belki daha az tehlikeli, özellikle sınırlı pratik Kimya deneyime sahip operatörler için de.
Sabunlaşma ham yaprak özler reflü sıvı/sıvı bölümleme tarafından takip altında chlorophylls sonraki arıtma veya analiz önce toplu kaldırılması için ortak bir tekniktir. Ancak, bu kez operasyonel daha büyük ölçeklerde rağbet görebilir. Ayrıca, algılama arabirimi veya ürün kaybı emülsiyonlar oluşumu nedeniyle sorunlu olabilir. Hànzú faz hidroliz gerçekleştirmek için güçlü temel iyon değiştirme reçineler kullanımı uygun bir alternatif hizmet verebilir. Hydrolyzed klorofil pigmentli bölümünü reçine için yapıştırılan kalır ve sadece filtrasyon tarafından kaldırılabilir. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan temel iyon değiştirme reçine istihdam daha önce raporlanmış analitik prosedür17 partiye hazırlık ölçek uyarlaması kullanır.
Aşağıda bu bitki tabanlı platformu kullanan triterpeneler partiye hazırlık ölçekli üretim için detaylı ve hızlı iletişim kuralı tanımlar. Bu iletişim kuralı onlarca yüzlerce izole triterpen ürün miligram uygulamalar için yapısal bir karakterizasyonu nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi tarafından hazırlamak ve/veya daha fazla fonksiyonel olarak çalışması için düzenli olarak bizim laboratuvar olarak kullanılır deneyleri.

<table><tbody><tr><td>GC-MS cihazı</td>, <td>PCR</td> reaksiyonlarını gerçekleştirmek için uygun herhangi bir <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Termodöngüleyici</td>, <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforez cihazı</td>, <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ayarlanabilir hava deplasmanlı mikropipetler (Boyutlar: 1000 ve mikro; L, 200 ve mikro; L, 100 ve mikro; L, 20 ve mikro; L, 10 ve mikro; L ve 2 &mikro; L)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Geniş üst sıvı nitrojen taşıyıcı (boyut: 2 L)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü mikrosantrifüj (Kapasite: 24 x 1.5 / 2mL, Maks. hız: =/> 15000 rpm)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj (Kapasite: 20 x 50 mL, Maks. hız: =/> 4000 rpm)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Yerde duran santrifüj (Kapasite: 4 x 1L, Maks. hız: =/> 4000 rpm)</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ayakta inkübatör</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama inkübatörü (Şişe Kelepçesi boyutları: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td> <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj şişesi (1 L)</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vakum infiltrasyon aparatı</td><td>ısmarlama</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm bitki saksıları</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dondurarak kurutma aparatı (=/> 8 litre kondenser kapasitesi)</td><td></td> 120 mL ekstraksiyon hücreli herhangi bir <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 (PSE cihazı)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Döner buharlaştırıcı aparatı</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buharlaştırma şişesi (Boyutlar: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran şişesi (Boyutlar: 1 L, 10 L)</td><td>herhangi bir</td><td>n/ a</td><td></td></tr><tr><td>Konik şişeler (Boyutlar 100 mL, 2 L)</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatula (çeşitli boyutlar)</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analitik terazi (5 rakam)</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Terazi (2 rakam)</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ölçüm silindiri (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 dondurucu</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>250 mL toplama rafı ve şişeleri olan Biotage Isolera cihazı (otomatik flaş kromatografi cihazı</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr>, <tr><td>Güvenlik gözlükleri</td>, <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar önlüğü</td>, <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td>,</tr><tr><td>Otoklav</td>, <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Sarf Malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet uçları (Boyutlar: 1000 & mikro; L, 200 ve mikro; L, 100 ve mikro; L, 20 ve mikro; L, 10 ve mikro; L ve 2 &mikro; L)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü (Boyut: 2 mL)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü (Boyutlar: 15 mL, 50 mL)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Transfer pipeti (boyut 2 mL)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (Boyut: 100 mL)</td> <td>herhangi bir</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; SNAP KP-SIL 100 g flaş kartuşları</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC şişeleri (1 mL), flakon ekleri ve kapakları</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık mor nitril eldiven</td><td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>E-914 için üst filtre, selüloz</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>E-916 / 914 için alt filtre, cam elyaf</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td><güçlü> Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuvars kumu, 0,3 - 0,9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diyatomlu toprak)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silika jel 60 (0,040 -0,0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2- (N-morfolino) -etansülfonik asit</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3 ' 5'-dimetoksi-4'-asetofenon (asetosiringon)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>MP biyomedikaller</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz LE jel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB suyu Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&reg; &nbsp; 900 hidroksit (bazik iyon değişim reçinesi)</td> <td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hekzan</td><td>Fisher</td><td>H / 0406 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Fisher</td><td>E / 0900 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Fisher</td><td>D / 1852 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>M / 4056 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q su</td>, <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Kompost</td>, <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Kompost</td>, <td>herhangi bir</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti (Plazmid saflaştırma kiti).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Yetkili E. coli</td><td>Tedarikçi New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vektör</td><td>Lomonossoff laboratuvarı John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR KLONAZ (tm) II ENZİM KARIŞIMI (bölgeye özgü rekombinasyon klonlama protokolü)</td> <td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP KLONAZ (tm) II ENZIM KARIŞIMI (bölgeye özgü rekombinasyon klonlama protokolü)</td> <td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 YEŞİL MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION YÜKSEK SADAKAT DNA POLIMERAZ</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY TESİSİ MİNİ KİTİ</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE İÇERMEYEN DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III Birinci İplikli Sentez Sistemi</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotiana Benthamiana Tohumları</td><td>Herhangi Bir Saygın Tedarikçi</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

partiye hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici nicotiana benthamiana ifadede bırakır

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Triterpeneler en büyük ve bitki doğal ürünlerin çoğu yapısal olarak farklı aileler vardır. Birçok triterpen türevleri medicinally ilgili biyolojik aktivitesi sahip gösterilmiştir. Ancak, şu ana kadar bu potansiyeli triterpen türevi ilaçlar klinikte bir bolluk içine çevrilmiş olmayışıdır. Belki bu (en azından kısmen) sınırlı pratik sentetik erişim için bu sınıfa bileşik bir sonucu yapısı-etkinlik ilişkiler keşif ve gelişimi bastırmak bir sorun kurşun, adaylar tarafından geleneksel tıbbi Kimya iş akışları. Onların büyük çeşitlilik rağmen triterpeneler tüm tek bir doğrusal habercisi türetilmiştir 2,3-oxidosqualene. İ. benthamiana biyosentetik enzimlerin geçici Contegra ifade 2,3-oxidosqualene, doğal olarak bu ana makine tarafından üretilen değil yeni yüksek değerli triterpen ürünlerin üretimi doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Agro-infiltrasyon geçici i. benthamianaifadede ulaşmada etkin ve basit bir yoludur. İşlem bitki yaprakları infiltrasyonu Agrobacterium tumefaciens ilgi ifade construct(s) taşıyan bir süspansiyon ile içerir. Ortak bir ek A. tumefaciens infiltrasyonu zorlanma habercisi kaynağı önemli ölçüde artırır bir enzim artar bir ifade yapısı kodlama verimleri taşıyan. Beş günlük bir süre sonra infiltre yaprak malzeme hasat ve elde etmek ve elde edilen triterpen ürün (ler) izole işlenebilir. Bu yalnızca denemede kullanılan bitkiler sayısını artırarak ölçeklenebilir, güvenilir ve sürekli bir süreçtir. Burada olan bu bitki tabanlı platformu kullanan triterpeneler hızlı hazırlık-ölçekli üretim için bir protokol açıklanan. Protokol dört bitkiler, bitkiler yüzlerce batch-wise infiltrasyon kısa bir süre içinde etkinleştirme aynı anda infiltrasyonu sağlar bir kolayca yinelenebilir vakum infiltrasyon aparat kullanır.

Tipik izole verimleri enzim/enzim kasanın soruşturma, hedef bahçedeki kimyasal kararlılık ve arıtma süreci zorlu nasıldı altında bağlı. Biz daha önce β-amyrin izole verimi bildirdin 0,12 3.87 mg-gram arasında değişen bizim Kombinatorik biyosentezi deneyler gelen türevleri i. benthamiana yaprak tozu kuru. Bu bileşiklerin yaygın oksidasyon düzeyi arasında değişiyordu ve doğal olmayan enzimler (Şekil 3)8kombinasyonları dahil. Bu iletişim kuralı düzenli olarak bizim laboratuvarda onlarca veya yüzlerce miligram yapısal karakterizasyon için saflaştırılmış ürün üretmek için NMR spektroskopisi ve aşağı akım fonksiyonel deneyleri tarafından kullanılır. Biz de bu platform partiye hazırlık programı triterpen iskele β-amyrin % 98'den büyük bir saflık, 0.8 g üreterek göstermiştir. Bu deney 459 bitkiler kullanılan ve 3.3 mg kuru gram başına izole bir verim temsil eden i. benthamiana yaprak tozu8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Şekil 1: Şematik Özeti. 2,3-oxidosqualene partiye hazırlık ürünler imalatı, yeni yüksek değerli triterpen doğru endojen malzemeleri aktarmak için i. benthamiana varak biyosentetik enzimlerin geçici ifade istismar işlem şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Şekil 2: Vakum yaklaşıyor İnşaat ve işlem bir) Fabrika sahibi bir kanat müstakil ısmarlama. b) Bespoke tesisi sahibi kanatları bağlı. c) inversiyon ve bitkilerin batma. d) infiltrasyon Bath ekleme. e) infiltrasyon banyoda infiltrasyon odası içinde yer. f) komple vakum yaklaşıyor: (1) vakum pompası (2) bağlantısından vakum pompası vakum rezervuar (3) vakum rezervuar yalıtım Vana vakum rezervuar ve infiltrasyon odası (5) basınç göstergesi (6) hava emme valfi (7) arasında bağlantı (4) İnfiltrasyon odası (8) vakum rezervuar. g) temsilcisi bir bitki yeşil flüoresan protein (GFP) için bir ifade yapısı ile infiltre beş gün sonrası infiltrasyon büyüme sonra bırakır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Şekil 3: daha önce bu iletişim kuralı8kullanarak β-amyrin türevlerinin partiye hazırlık üretim için temsilcisi sonuçları rapor. Bu tablo tarafından izole verimleri emredilmiştir. Sütunları koşullu olarak göreli değeri renk göstergesi ile biçimlendirilir. Kırmızı Yüksek, yeşil = düşük (yine de ara sarı) =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Bu protokol, yapısal karakterizasyon veya tıbbi olarak ilgili biyolojik aktivitenin sona ermesi gibi sonraki çalışmalarda kullanım için triterpen bileşiklerine uygun hazırlayıcı ölçekli erişim sağlar. Protokol hızlı, ölçeklenebilir ve enzim kombinasyonlarının farklı Agrobacterium suşlarının birlikte sızmasıyla basitçe kullanılmasına izin vererek, büyük çok genli vektörler oluşturma ihtiyacını ortadan kaldırır. Başlamak için, seçici bir LB agar plakasını, gliserol stok kültürlerinden istenen Agrobacterium tumefaciens suşlarının çizgileri ile aşılayın.Plakayı gece boyunca 28 santigrat derecede ayakta duran bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, 50 mililitre seçici LB ortamını her bir Agrobacterium tumefaciens suşunun bir örneği ile ayrı ayrı aşılayın. Kültürü gece boyunca 28 santigrat derecede 200 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.50 mililitrelik kültürleri ayrı ayrı 1.000 mililitre seçici LB ortamına aktarın ve 200 rpm'de çalkalama inkübatöründe 28 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, Agrobacterium tumefaciens'i sıvı kültürlerden 4.000 kez g'da santrifüjleme ile ayrı ayrı peletleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peletleri 50 mililitre taze hazırlanmış MMA tamponunda ayrı ayrı yeniden süspanse edin.Yeniden süspanse edilmiş peletleri oda sıcaklığında karanlıkta bir saat inkübe edin. Şimdi, 10 litrelik toplam nihai hacimde en az 0,2'lik bir nihai OD 600 üretmek için her bir Agrobacterium tumefaciens MMA süspansiyonunun uygun hacmini belirleyin. Her süspansiyonun belirlenen hacimlerini birleştirin.Şimdi, vakum sızması için hemen kullanılmak üzere bir litrelik son hacme kadar kombine süspansiyonlara ek MMA tamponu ekleyin. Bir litre infiltrasyon süspansiyonunu ve bir litre 10x mukavemetli MMA tamponunu infiltrasyon banyosuna aktarın, ardından sekiz litre daha su ekleyin. Ismarlama bitki tutucunun çıkarılabilir kanatlarını çıkarın.Metin protokolünde açıklandığı gibi yetiştirilen dört beş haftalık bitkiyi yerleştirin ve kanatları yeniden takın. Yapraklar sızma süspansiyonuna tamamen daldırılmazsa sızma kapsamı tehlikeye girer. Bu sorun, vakum işleminden önce süspansiyon seviyesinin bitki tutucunun üst yüzeyine ulaşmasını sağlayarak en aza indirilir.Tutucuyu ters çevirin ve yaprakları sızma süspansiyonuna batırmak için sızma banyosunun üzerine yerleştirin. Batık bitkilerin bulunduğu sızma banyosunu sızma odasına aktarın ve kapıyı kapatın. Sızıntı üzerindeki hava giriş valfinin kapalı olduğundan emin olun.Vakum pompasını açtıktan sonra, sızma odasındaki vakum giriş valfini açın. Sızma odasındaki basınç 880 milibar düştüğünde, vakum giriş valfini kapatın ve hava giriş valfini açın. Atmosferik basınca döndükten sonra kapıyı açın ve sızma banyosunu çıkarın.Şimdi, bitkiler artık sızma süspansiyonuna batırılmayana kadar bitki tutucusunu kaldırın. Ardından, fazla süspansiyonun yapraklardan akmasına ve sızma banyosuna geri dönmesine izin vermek için tutucuyu hafifçe sallayın. Son olarak, tutucuyu dik konuma getirin, çıkarılabilir kanatları çıkarın ve bitkileri çıkarın.Sızan bitkileri günlük sulama ile günde 16 saat ışıkta 25 santigrat derecede beş gün boyunca büyütün. Beş günlük büyümeden sonra, yaprakları hasat edin ve ardından metin protokolünde açıklandığı gibi kurutun. Kurutulmuş yaprakları, ev tipi bir mutfak robotu kullanmak veya yaprakları bir torba içindeyken manuel olarak ezmek gibi uygun bir yöntemle kaba bir toz haline getirin.Yaprak tozunu uygun bir kapta kuvars kumu ile karıştırın. Bu, bir dağıtıcı görevi görür ve ekstraksiyon işleminin verimliliğini artırır. Şimdi, önce ters çevirerek doldurmak için dört ekstraksiyon hücresi hazırlayın.Ardından, cam elyaf filtreyi, ardından metal frit ve tutma tapasını takın. Ekstraksiyon hücrelerini dik konuma getirin ve bir santimetre derinliğinde bir kuvars kumu tabakası ekleyin. Ekstraksiyon hücrelerini hazırlanan yaprak tozu ile doldurma çizgisine kadar doldurun.Gerekirse, her bir ekstraksiyon hücresine daha fazla miktarda eklenmesini kolaylaştırmak için bu işlem sırasında tozu hafifçe sıkıştırın. Şimdi, paketlenmiş tozun üstüne küçük bir tabaka kuvars kumu ekleyin ve üst selüloz filtreyi yerleştirin. Paketlenmiş ekstraksiyon hücrelerini basınçlı solvent ekstraksiyon cihazına yerleştirin ve istenen yöntemi çalıştırın.Yöntem tamamlandıktan sonra, birleşik ekstraksiyon likörünü, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, vakum altında döner buharlaştırma yoluyla kuruyana kadar konsantre edin. Koyu yeşil bir bulamacın beklenen çıktısını kontrol edin. Klorofilleri çıkarmak için, bazik iyon değişim reçinesi kullanarak, önce ham ekstraktı minimum hacimde etanol içinde çözün.Elde edilen çözeltiye 50 mililitre bazik iyon değiştirici reçine boncukları ekleyin. Ardından oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayın. Reaksiyon tamamlanana kadar her 30 dakikada bir 50 mililitre ilave bazik iyon değiştirici reçine boncukları ekleyin.İlk başta, temel iyon değiştirici reçine boncukları pembe renktedir ve sıvı faz yeşildir. Reaksiyon ilerledikçe, ölçeğe bağlı olarak reçine boncukları yeşile ve sıvı faz turuncuya veya bulanık kahverengi bir renge dönüşür. Reaksiyon karışımını, basınç uygulamak için el körüklerini kullanarak, bir cam flaş kromatografi sütunu aracılığıyla kısa bir diyatomlu toprak sütunundan süzün.Toplanan reçine boncuklarını etanol ile durulayın, ardından bire bir etanol ile hekzana ve son olarak hekzan ile durulayın. Diyatomlu toprak sütununun üstündeki boncukları yeniden süspanse etmek için yeterli bir durulama hacmi kullanın. Son olarak, süzüntüyü, durulamaları ve konsantreyi vakum altında döner buharlaştırma ile kuruyana kadar birleştirin.Burada, infiltrasyon büyümesinden beş gün sonra floresan protein GFP için bir ekspresyon yapısı ile sızan bir bitkinin yapraklarının bir görüntüsü gösterilmektedir. Bu, beklenebilecek sızıntı kapsamının kapsamını gösterir. Yapraklar, bitki üzerindeki orijinal yüksekliklerine göre azalan sırada görüntünün sol üst köşesinden sağ alt köşesine doğru düzenlenir.Bu görüntü, %98'den daha saf olan bu protokol kullanılarak üretilen 0,8 gram beta-amirini temsil eder. Deney 459 bitki ölçeğinde gerçekleştirildi ve kuru yaprak materyalinin gramı başına 3.3 miligramlık izole bir verimi temsil ediyor. Bu protokolü denerken, yalnızca sızan yaprakların ilgilendiğiniz bileşimi üreteceğini hatırlamak önemlidir.Bu nedenle, numunenizin verimsiz doku ile seyreltilmesini önlemek için mümkün olduğunda bu yaprakları seçici olarak hasat etmek avantajlıdır. Bu protokoldeki hasat sonrası adımlar açıklama amacıyla verilmiştir. Kurumunuzdaki uzmanlığın ve/veya tesislerin mevcudiyetine bağlı olarak diğer doğal ürün ekstraksiyon saflaştırma tekniklerinin yerine kullanılabilirler.Bu protokolde sunulan temel iyon değiştirici reçine muamelesinin, daha geleneksel sabunlaştırmaya ve ardından klorofillerin daha büyük ölçeklerde uzaklaştırılması için sıvı/sıvı bölümlemeye uygun bir alternatif olduğunu bulduk. Bu protokolü izlemeden önce, kullanılan tüm maddeler için malzeme güvenlik verilerini öğrenmeli ve uygun güvenlik önlemlerini almalısınız. Uygun muhafaza prosedürlerinin izlenmesi de dahil olmak üzere, transgenik materyalle çalışmaya ilişkin yerel mevzuat kontrol edilmeli ve bunlara uyulmalıdır.

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım...

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Bu bitkilerde monoklonal antikorlar ve raportör proteinlerin geçici transgen ifadesi üzerindeki düzenleyici elemanlar, bitki büyüme ve gelişme parametreleri ve inkübasyon koşullarının etkisini belirlemek ve modellemek için kullanılabilecek deneyler yaklaşımın bir tasarımını tarif eder.

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Burada, bir sözlü aşı adayı karşı tip 1 diyabet bir yenilebilir bitki üretmek için bir protokol mevcut.

Kırmızı pancar biyofarmasotik aday aşısı geçici ifadede tip 1 diyabet için

Burada Üretmek ve Escherichia coli veya Nicotiana benthamianabiyosentetik enzimlerin kombinatoryal ekspresyonu ile diterpenoid metabolitleri arındırıcı için kolay kullanılan protokoller salıyoruz , kromatografik ürün takip Arıtma. Ortaya çıkan metabolitler moleküler yapı karakterizasyonu, enzim fonksiyonel çalışmaları ve biyoaktivite testleri gibi çeşitli çalışmalar için uygundur.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

Öğrenin, Nicotiana benthamiana yapraklarında geçici ifade ile triterpen üretimi için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem. Agrobacterium ko-infiltrasyonu ile çoklu enzim kombinasyonları kullanılabilir.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Daha fazla video keşfet