Name: Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Öğrenin in vitro hipopigmentasyon aktivitesini B16-F10 melanositlerinde tirozinaz aktivitesi, melanin içeriği ve hücre boyama yöntemleriyle değerlendirmeyi. Bu yöntemler fonksiyonel kozmetik geliştirme araştırmaları için hızlı ve güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Kore Enstitüsü planlama ve değerlendirme için gıda, tarım ve Ormancılık (IPET) Tarım Bakanlığı, gıda ve kırsal işleri (MAFRA tarafından finanse edilen ağrı-Bioindustry teknoloji geliştirme programı aracılığıyla teknolojisi tarafından desteklenen ) (116159-02-2-WT011) ve okul Yaşam Bilimleri ve biyoteknoloji BK21 Plus, Kore Üniversitesi.

1. orta, bileşikler ve Kimyasalları hazırlanması
<ol><li>B16F10 büyüme tam orta hazırlayın. Ek Dulbecco'nın kartal orta (DMEM) ile % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin (zararlı) değiştiren.<ol>
<li>500 mL tam orta yapmak için Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 445 mL 50 mL FBS ve haşere 1 L steril cam şişede 5 mL ile karıştırın. Hafifçe karıştırdıktan sonra orta yeni steril cam şişe ve 4 ° C'de sonra mağaza 0.2 µm şişe-üst filtre ile filtre uygulama Dikkat: Tüm hücre kültürü teknikleri Mikrobiyolojik Güvenlik kısırlık sağlamak için aseptik teknik kullanılarak kabine yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lizis arabellek hazırlamak: % 0,1 Triton X-100 (v/v) arabellek (pH HCl ile düzeltilmiş) pH 7.5 içeren 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane. Bu arabellek-ebilmek var olmak kullanılmış için 3 ay (RT) oda sıcaklığında saklandığında. Proteaz inhibitörleri lizis arabellek kullanmadan önce ekleyin.</li>
	<li>Tirozinaz inhibitörü tahlil arabellek hazırlayın. 1 M NaH2PO4 (yem mono) ve 1 M Na2HPO4 (dibasic) stok çözümleri hazırlayın. 46.3 mL Na2HPO4 ve 53.7 mL 0.1 M sodyum fosfat tampon (pH 6.8) son hacmi hazırlamak için NaH2PO4 karıştırın.<ol>
<li>1 L (son hacim) elde edilen karışıma H2O. ayarlama 6,8 için nihai çözüm pH sulandırmak. Bu arabellek-ebilmek var olmak kullanılmış için 1 ay 4 ° C'de saklandığında</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tirozinaz substrat çözeltisi hazırlamak: %0,1 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (BASINCIN, w/v) çözünmüş Tirozinaz inhibitörü tahlil arabellekte (Adım 1.3 için bakınız). Dikkat: buz kullanımda iken tutun.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, 100 U/mL mantar Tirozinaz hazırlayın. Lyophilized mantar Tirozinaz Tirozinaz inhibitörü tahlil arabelleği geçiyoruz. Bu eriyik-ebilmek var olmak kullanılmış için 2 ay –20 ° C'de saklandığında Mantar Tirozinaz etkinlik hem de hücresel Tirozinaz etkinliği hücre malzemeleri huzurunda hesaplanır. Dikkat: böylece donma donma ve çözdürme önlenebilir tekrar önce bölünmemeli çözümdür. Çözüm buz kullanımda iken üzerinde tutun.</li>
	<li>1 N NaOH çözüm hazırlamak. Volumetric flask NaOH 4 g tartmak ve distile su 100 mL yapmak geçiyoruz.</li>
	<li>Fiksasyon çözüm (% 10 formalin) hazırlayın. 73 mL distile su ile % 37 formaldehit 27 mL seyreltik. Taze günlük hazırlayın.</li>
	<li>Ammoniacal gümüş hisse senedi çözüm hazırlamak. 5 mL % 10 gümüş nitrat çözeltisi içinde volumetric flask hazırlayın. Amonyum hidroksit çözüm dropwise, çökelti tamamen eriyene kadar ekleyin. Gümüş nitrat çözümü (% 10) 200 μL ekleyin. Belgili tanımlık eriyik-ecek var olmak biraz bulutlu. Dikkat: iletişim ve inhalasyon önlemek. Bir duman başlığı kullan.</li>
	<li>Ammoniacal gümüş çalışma çözüm hazırlamak. Ammoniacal gümüş hisse senedi çözüm 2.5 mL 7,5 mL distile su ile sulandırmak. Bir kez kullanabilir ve sonra atın. Dikkat: iletişim ve inhalasyon önlemek. Bir duman başlığı kullan.</li>
	<li>%0,1 altın klorür hazırlayın. 1 mL % 10 altın klorür hazırlamak ve 99 mL distile su içinde volumetric flask ekleyin. Taze günlük hazırlayın.</li>
	<li>Fosfat tampon serum (PBS) hazırlayın. NaCl, 8 g 0.2 gram KCl, 1.44 g Na2HPO4 ve KH2PO4 800 mL distile su içinde 0,24 g ekleyin. HCl. Dilute 1 M'ye (son hacim) elde edilen karışımı ile distile su ile pH 7.4 için ayarlayın.</li>
	<li>%5 (w/v) sodyum thiosulfate çözeltisi distile suda hazırlayın.</li>
</ol>2. hücre kültür ve tedavi
<ol><li>Piyasada bulunan B16F10 hücreler kullanın. B16F10 hücreleri tam ortamda korumak. Oksijen, hücre kültürü şişeyi tutmak % 5 CO2 atmosfer kuluçka 37 ° C'de</li>
	<li>Test bileşikleri, inhibitörü pozitif kontrol ve negatif kontrol örnekleri hazır olun.<ol>
<li>Uygun çözücüler olarak test bileşikler geçiyoruz. Suda çözünen bileşikler çift distile suda çözülür. Uygun organik çözücü, örneğinsu çözünmez bileşikler geçiyoruz., DMSO.</li>
		<li>Burada, çift distile suda (125 μg/mL) çözünmüş arbutin test bileşikleri veya bir negatif kontrol ile karşılaştırıldığında hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için olumlu bir denetim olarak kullanın. Negatif bir denetim (Denetim araç tedavi) çözümler veya kullanılan test örneği, örneğin, çift distile su, DMSO, içinde arabellekleri kullanmak etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre tohum ve tedavi<ol>
<li>Tohum B16F10 hücreleri 5 × 104 hücreleri/24-şey kültür levha tam orta kullanarak iyi ve CO2 kuluçka 24 h için kuluçkaya. Kuluçka sonra tam orta Aspire edin.</li>
		<li>(Olmadan FBS ve % 1 penisilin/streptomisin) DMEM orta test bileşikleri, inhibitörü kumanda veya CO2 kuluçka 72 h. onay hücreler mikroskop altında her 24 saat için bir negatif kontrol içeren hücreleri kuluçkaya. Bu adımdan sonra adım 3-5 daha fazla deneyler için gidin. Dikkat: Bu test madde ve DMEM orta karışımı 0,2 mikron filtre ile filtre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ölçme hücresel Tirozinaz etkinliği
<ol><li>2. adımda açıklanan yöntemi kullanarak, medyayı çıkarın ve soğuk PBS 300 μL iki kez hücrelerle durulayın.</li>
	<li>Hücre kültür plaka Buza koyun. 300 μL lizis arabelleği ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. Sonra hücreyi bir hücre kazıyıcı kullanarak lysate toplamak ve lysate hücre 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.</li>
	<li>14.500 devirde 2 için bir hücre homogenizer ile cep lysate homojenize s, hücre içi Tirozinaz elde etmek için 3 kez buz üzerinde. Homogenizer için en uygun koşul özel kullanın.</li>
	<li>12.000 × g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve hücre süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Buz kullanımda iken üzerinde tutun.</li>
	<li>70 μL süpernatant ile bir 96-şey açık polistren Mikroplaka aktarın.</li>
	<li>140 μL Tirozinaz substrat (BASINCIN) bir 96-şey açık polistren Mikroplaka için içeren bir çözüm eklemek, yavaşça sallayın ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	<li>İsteğe bağlı, her şey için 70 μL 100 U/mL mantar Tirozinaz çözüm ekleyin ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	<li>Bir dalga boyu 475 adresindeki Tirozinaz etkinliği ölçmek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.</li>
	<li>Her örnek protein konsantrasyonu Tirozinaz faaliyete normalleştirmek. Her örnek protein konsantrasyonu tarafından Bradford tahlil ölçmek.</li>
</ol>4. ölçüm Melanin içeriği
<ol><li>2. adımda açıklanan yöntemi kullanarak, medyayı çıkarın ve soğuk PBS 300 μL iki kez hücrelerle durulayın.</li>
	<li>Hücre kültür plaka Buza koyun. 300 μL lizis arabelleği ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. Sonra hücreyi bir hücre kazıyıcı kullanarak lysate toplamak ve lysate hücre 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.</li>
	<li>Santrifüj için 12.000 × g 4 ° C'de 10 dakika</li>
	<li>Süpernatant normalleştirme için yeni bir tüp ve ölçü toplam protein konsantrasyonu aktarın. Her örnek protein konsantrasyonu tarafından Bradford tahlil ölçmek.</li>
	<li>1 N NaOH 300 μL her Pelet ekleyin ve 1 h için 60 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Çözünmüş çözüm için 12.000 × g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	<li>200 μL süpernatant, 96-şey Mikroplaka aktarın.</li>
	<li>400 bir dalga boyu melanin içeriği ölçmek nm.</li>
	<li>Protein konsantrasyonu melanin içindekilere normalleştirmek.</li>
</ol>5. Fontana-Masson boyama
<ol><li>Fontana-Masson boyama<ol>
<li>Hücreleri iki kez soğuk PBS 300 μL ile yıkayın.</li>
		<li>Her şey için % 10 formalin 200 μL ekleyin ve 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
		<li>Distile su ile durulayın.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış ammoniacal gümüş çözüm çalışma 200 μL ekleyin ve 1 h 37 ° C'de veya hücreleri sarı/kahverengi renkte olana için kuluçkaya. Dikkat: Taze karıştırılmış ammoniacal gümüş çalışma çözüm bir 58 – 60 ° C su banyosunda yerleştirin ve equilibrate sıcaklık için yeterli zaman sağlar.</li>
		<li>Ammoniacal gümüş çözüm çalışma kaldırmak ve distile su ile durulayın.</li>
		<li>Distile su kaldırın. %0,1 altın klorür 200 μL ekleyin ve RT. 2 min için kuluçkaya</li>
		<li>% 0.1 altın klorür çözümü kaldırmak ve distile su ile durulayın.</li>
		<li>Distile su kaldırın. Sodyum thiosulfate çözüm (%5, w/v) 200 μL ekleyin ve 2 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Sodyum thiosulfate çözümü kaldırmak ve distile su ile durulayın.</li>
		<li>Distile su kaldırın. Nükleer hızlı kırmızı 200 μL ekleyin ve 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Nükleer hızlı kırmızı kaldırmak ve musluk suyuyla durulayın.</li>
		<li>Musluk suyu çıkarın ve lekeli hücreler mikroskopla gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fontana-Masson (eşik analizi kullanarak ImageJ) Boyama Not: Ek malzemeler ImageJ yazılımını kullanarak görüntü analiz yordamı örneği görüntülenir.<ol>
<li>ImageJ programını açın.</li>
		<li>Dosyayı seçin | Açık | Mikroskop görüntü.</li>
		<li>Görüntü seçin | Ayarlamak | Renk eşiği.
</li>
		<li>Fontana-Masson ile lekeli alan ölçmek için parlaklık parametre çubuğu sıfır olarak ayarlayın ve hangi tüm lekeli hücreleri (siyah veya koyu kahverengi) dahil edilir noktası bulmak için parlaklık çubuğu ayarlayın.</li>
		<li>Seçin analiz | Parçacıklar analiz. Analiz parçacıkları penceresini özetleme kutusunda onay kutusunu seçin ve Tamam'ıtıklatın. Özet sonuçları elde etmek ve bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz. Not: Elde edilen kutusu parametrelerin açıklaması aşağıdaki gibidir: Dilim: Her resmin adını Sayısı: Lekeli hücre sayısı Toplam alan: Toplam alan sınırlı sayıda hücre Ortalama boyutu: Toplam alan sayısı / % Alanı: alan/Toplam alan lekeli × %100; Toplam alan otomatik olarak hesaplanır.</li>
		<li>Göreli hesaplamak alan Toplam alan değerini kullanarak melanin ile lekeli. Göreli melanin lekeli alan (%) = test örnek/ortalama Toplam alan denetimi × 100, Yani, toplam hücresel alan değeri
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li>
<li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li>
<li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li>
<li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+whitening+cosmetics%3A+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners%5BTitle%5D)+AND+%22Cosmetics%22%5BJournal%5D)">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36(2016).</li>
<li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li>
<li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li>
<li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cosmetic+Science%22%5BJournal%5D)">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li>
<li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+inhibitions+of+lemon+balm+%28Melissa+officinalis%29+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes%3A+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+inhibition+of+%CE%B3-oryzanol+on+cellular+melanogenesis%3A+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li>
<li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li>
<li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li>
<li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).</li>
<li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li>
<li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144(2016).</li>
<li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage%3A+interactions+between+KIT+and+MITF%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li>
<li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li>
<li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li>
<li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamaları rapor var.

Biz kültürlü melanosit kullanarak test bileşiklerin hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için protokol sundu. Temsil edici sonuçlar arbutin, Tirozinaz etkinlik ve hücresel melanin içerik inhibe bir Tirozinaz inhibitörü hipopigmentasyon etkisini gösterdi. Bu yöntemler anti-melanogenic aktivite araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu deneyleri kullanarak, biz de başarıyla geçmişte melanogenesis B16F10 hücreleri üzerinde inhibitör etkisi olduğu birçok biyoaktif bileşikler belirledik on yıl...

Melanin fizyolojisi, patoloji ve toksikoloji cilt, göz ve beyin1de dahil olmak üzere çeşitli organlarının kritik bir rol oynamaktadır. Büyük melanin fotoğraf-tarama ve biyokimyasal etkileri işlevlerdir. Melanin ultraviyole radyasyon, ışığın daha kısa dalga boyları artan emme oranları ile yanı sıra yakın kızılötesi ve görünür ışık emer; Böylece, melanin görünür ışık veya UV radyasyon2neden hasar dokuları korur. Melanin bir antioksidan ve metaller ve diğer toksik kimyasal maddeler için bir ilgi vardır; Bu nedenle, o-ebilmek korumak dokulara kimyasal ve oksidatif stres3. Ancak, aşırı melanin üretimini dermatolojik sorunlarına neden olur.
Miktar ve kalite melanin deride ve iris Iris ve cilt rengini en önemli belirleyicileri vardır. Bireyler farklı cilt renk tercihleri olabilir; diğerleri daha açık cilt renkleri lehine iken bazı tabaklanmış deri, iyilik. Bu tüketici profilleri bağlı olarak hipopigmentasyon kozmetik bireysel pazarlar için tercih cilt renkleri4karşılamak için geliştirilmiştir. Buna göre bilimsel ve pratik çalışmalar hipopigmentasyon ve anti-melanogenic aktivitesinin önemlidir.
Melanogenesis melanin biyosentezi melanosit vücudunda kimyasal reaksiyonlar enzimatik ve spontan bir dizi karmaşık işlemidir. Bir melanosit yaklaşık 36 lenfositi tarafından çevrilidir ve melanosit komşu lenfositi onların ürün dağıtmak melanin sentezini fabrikaları vardır. Deride, üretilen ve melanosit melanosomal bölümünde depolanan melanin dendrites epidermis ile komşu lenfositi için taşınır.
L-tirozin 3,4-dihydroxyphenylalanine (BASINCIN) ve sonra dopaquinone içine dönüştürmek iki ardışık tepkileri melanogenesis ve enzim Tirozinaz için ilk substrat tromboksan L-Tyrosine hizmet vermektedir. Bu tepkiler melanogenesis5,6hızı sınırlaması adım vardır. Buna göre hipopigmentasyon etkinlik ilk doğrudan hücresel Tirozinaz etkinliğini değerlendirmek tarafından ölçülebilir. Bunu yapmak için melanosit özleri içeren Tirozinaz BASINCIN ile inkübe ve örnekleri üretilen dopaquinone spectrophotometry, 475 tarafından ölçülebilir nm. Değerleri örnekleri ve hipopigmentasyon faaliyet sonucu denetimleri ile karşılaştırıldığında daha az dopaquinone oluşumunda maddelerle protein konsantrasyonları tarafından normalleştirilmiş.
İkinci olarak, hipopigmentasyon etkinlik melanin kültürlü melanosit içinde doğrudan ölçerek sayısal. Test materyalini hücrelerle tedavi sonra melanin alkali koşullarda elde edilir ve melanin içerik spectrophotometry 400 tarafından sayısal nm. Hipopigmentasyon Ajan daha düşük bir melanin içerik denetimleri7daha neden olur.
Son olarak, hipopigmentasyon etkinlik Fontana-Masson melanin boyama ve sonraki görüntü analizi tarafından sayısal. Fontana-Masson boyama, melanin granülleri amonyak-gümüş nitrat görünür bir siyah metalik durumuna azaltmak ve hücrelerin mikroskobik görüntüler siyah alanlar melanin miktarı gösterir.
Hipopigmentasyon Aracısı genellikle hangi madde etkinliği geçerli olduğunu doğrular Bu üç yöntem ile tutarlı ve benzer sonuçlar verir. Alternatif olarak, bu ifade anahtar genler ve proteinler arasında melanogenesis yanıt hipopigmentasyon etkinliğini incelemek için bir test madde olarak ölçmek yararlı olabilir. Tirozinaz yanı sıra, Tirozinaz kaynaklı proteinler (TRP-1) ve dopachrome tautomerase (TRP-2) kritik melanogenesis8enzimlerdir. Transkripsiyon faktörü mikroftalmia ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF) melanogenesis ve miktar onun gen/protein ifade düzeylerinin ana bir düzenleyicisidir veya bir organizatörü etkinliği tahlil hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>3,4-Dihidroksi-l-fenilalanin</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit çözeltisi</td><td>Sigma</td> <td># 320145</td><td></td></tr><tr><td>Arbutin</td><td>Fluka</td> <td># 10960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Yakuri Saf Kimyasallar</td> <td># 16223</td><td>% 37</td></tr><tr><td>Altın klorür</td><td>Amerikan MasterTech</td><td>AHG0226</td><td>% 0.10</td></tr> <tr><td>HCl</td><td>Samchun kimyasal</td><td>H0255</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bio basic Canada Inc.</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>#60218</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>JTBaker</td><td>#3817-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duksan saf kimyasallar</td><td>#81</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer hızlı kırmızı</td><td>Merck</td><td>100121</td><td>Nükleer hızlı kırmızı %0.1 alüminyumda %5 Sülfat.</td></tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin çözeltisi</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş nitrat</td><td>Dükkan Saf Kimyasallar</td> <td># 900</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4)</td> <td>JT Baker</td> <td># 3817-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik (Na2HPO4)</td> <td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum tiyosülfat pentahidrat</td><td>Duksan Saf Kimyasallar</td> <td># 2163</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan</td><td>Bio Basic Canada</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Union Carbide</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>mantardan tirozinaz</td><td>Sigma</td><td>T3824</td><td>25 KU</td></tr></tbody></table>

miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in vitro

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Bu çalışmada miktar hipopigmentasyon faaliyet tüp bebek için laboratuvar yöntemleri sunar. Melanin, melanosit, büyük pigment birden çok hücresel ve çevresel faktörler cevaben sentezlenir. Melanin cilt hücrelerini ultraviyole zararlardan korur, ama aynı zamanda biyofiziksel ve biyokimyasal işlevleri vardır. Aşırı üretimi veya melanosit melanin birikimi çiller, siyah noktaları, melazma ve benler gibi dermatolojik sorunlara neden olabilir. Bu nedenle, hipopigmentasyon ajanlar ile melanogenesis kontrolünü klinik veya kozmetik ihtiyaçları olan bireylerde önemlidir. Melanin öncelikle melanosit etkilenir melanogenesis dışsal olarak adlandırılan karmaşık biyokimyasal bir süreç ve hormonlar, iltihap, yaş ve ultraviyole ışık pozlama gibi Intrinsic faktörler melanosomes sentezlenir. Biz, kimyasal madde veya melanosit doğal maddelerin hipopigmentasyon etkinliğini belirlemek için üç yöntem tarif: 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve görüntü ile 3) Boyama ve sayısal hücresel melanin ölçüm analiz.
Melanogenesis, L-tirozin 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ve sonra dopaquinone içine dönüştürür hızı sınırlaması adım Tirozinaz tromboksan. Bu nedenle, Tirozinaz inhibisyonu bir birincil hipopigmentasyon mekanizmadır. Kültürlü melanosit içinde Tirozinaz etkinlik L-DOPA bir substrat ekleyerek ve dopaquinone üretim spectrophotometry tarafından ölçme sayısal. Melanogenesis da melanin içerik miktarının ölçmek. Melanin içeren hücresel kesir NaOH ile elde edilir ve melanin spectrophotometrically sayılabilir. Son olarak, melanin içerik Fontana-Masson melanin boyama aşağıdaki görüntü analizi tarafından sayılabilir. Her ne kadar bu tüp bebek deneyleri sonuçlarını insan cilt her zaman yeniden değil, bu yöntemler melanogenesis araştırma, potansiyel hipopigmentasyon etkinliği tanımlamak için özellikle ilk adımı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemler, melanosit etkinlik, büyüme ve farklılaşma değerlendirmek için de kullanılabilir. Üç farklı yöntem tutarlı sonuçlar etkileri geçerliliğini sağlamak.

Arbutin, bir anti-melanogenic temsilcisi sonuçları hipopigmentasyon etkinliği için melanosit aşağıda gösterilmektedir B16F10 bileşik. Şekil 1A o arbutin, önemli ölçüde araç tedavi denetimi ile karşılaştırıldığında hücresel Tirozinaz etkinlik bastırılmış gösterir. Benzer şekilde, hücre arbutin ile uyarılan melanin içerik önemli ölçüde denetimleri (şekil 1B) ile karşılaştırıldığında düşürüldü. Mikroskobik görüntüleri ile Fontana-Ma...

Biz kimyasallar tüp bebek hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için üç deneysel yöntemleri tarif: miktar 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve 3) melanin hücresel melanin boyama ve görüntü analizi tarafından ölçümü.

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Bu yöntem, anti-melanojenik faaliyetleri ile fonksiyonel kozmetik ve cilt ajan gelişiminde yararlı olabilir. Bu gerçekleştirmek için var ve sonuç hızlı bir şekilde elde edilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem etkileri veya bileşikleri tanımlamak veya araştırmak veya antimelanogenic veya promelanojenik faaliyetleri araştırmak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir.Tyrosinaz aktivitesi ölçmek için b16-F10 Melanicides beş kez 10 bir hücre kültürü kuluçka için tam ortamda 24 iyi plaka konsantrasyonu kuyu başına dördüncü hücrelere tohumlama ile başlar. Ertesi gün, yeni hazırlanmış test bileşiği ve inhibitör kontrolü veya negatif kontrol ile desteklenen DMEM ile her kuyuda supernatant değiştirin ve başka bir 72 saat için kuvöz plaka dönmek. Tedavi nin sonunda kuyuları kuyu başına 300 mikrolitre soğuk pb ile iki kez durulayın ve plakayı buza yerleştirin.Sonraki beş dakika sonra hücre lysates toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak her iyi lysis tampon 300 mikrolitre ekleyin. Ortaya çıkan hücre parçacık süspansiyonlarını tek tek 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Ve lisatları 14,500 rpm'de iki saniye boyunca üç kez homojenize edin ve hücreler arası Tyrosinaz'ı serbest bırakın.Santrifüj ile hücre enkaz pelet ve buz üzerinde bireysel 1.5 mililitrelik santrifüj tüpler için supernatants aktarın. Her bir süpernatantın 70 mikrolitresini 96 kuyunun tek tek kuyularına ayırın ve her bir süpernatant kuyuya 140 mikrolitre Tyrosinase substrat çözeltisi ekleyin. Iyi içeriğini karıştırmak için plaka nazik sallayarak.Sonra plakayı 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Ve bir mikroplaka okuyucu üzerinde 475 nanometre de Tyrosinaz aktivitesi ölçmek. Tedavi edilen hücrelerin lysate'sini topladıktan sonra hücrelerin melanin içeriğini ölçmek için.Santrifüj ile lysates toplamak ve yeni tüpler için supernatants aktarın. 60 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için her pelet için normal bir sodyum hidroksit 300 mikrolitre ekleyin. Ardından çözünmüş hücre süspansiyonlarının santrifüjü.Daha sonra 200 mikrolitre süpernatantı 96 kuyunun her kuyuya aktarın. Ve 400 nanometre dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu üzerinde melanin içeriğini ölçmek. Fontana-Masson Boyama için, tedavi edilen hücreleri 300 mikrolitre soğuk pbs ile iki kez yıkayın ve hücreleri 4 santigrat derecede bir saat boyunca %10 formalin 200 mikrolitre ile düzeltin.Kalın hücreleri distile suyla durulayın ve her kuyuya 58 ila 68 santigrat derece Amonyak gümüşçalışma çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derecede bir saat kuluçka ya da hücreler sarı-kahverengi renge dönüşene kadar. Lekeli hücreleri distile suyla durulayın ve ardından oda sıcaklığında %0,1 altın klorür içinde iki dakikalık kuluçka makinesi.Altın klorür işlenmiş hücreleri distile suyla durulayın ve hücrelere 200 mikrolitre sodyum tiyosülfat çözeltisi ekleyin. İki dakika sonra hücreleri tekrar durulayın. Ve hücreleri beş dakika boyunca her kuyuda 200 mikrolitre nükleer hızlı kırmızı ile etiketleyin.Daha sonra bir ışık mikroskobu altında görüntüleme önce musluk suyu ile lekeli hücreleri yıkayın. Eşik çözümlemesi için, Resim J'deki görüntüleri açın ve görüntüyü seçin, ayarlayın ve Renk Eşiği'ni seçin. Fontana Masson ile boyanmış alanı ölçmek için parlaklık parametre çubuğunu sıfıra ayarlayın ve parlaklığı siyah veya kahverengi lekeli hücrelerin tümünün dahil edildiği noktaya ayarlayın.Parçacıkları Analiz Et ve Analiz Et'i seçin ve Parçacıkları Analiz Et penceresinde özet kutusunu işaretleyin ve sonuçların bir özetini almak için tamam'ı tıklatın ve verileri elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın. Arbutin tedavisi önemli ölçüde kontrol aracı tedavi hücreleri ile karşılaştırıldığında hücresel Tyrosinaz aktivitesini bastırır. Benzer şekilde Arbutin ile uyarılan hücrelerin melanin içeriği kontrollere göre önemli ölçüde azalır.Hücreler tedavi grupları arasında morfolojik olarak benzer olmasına rağmen, Arbutin kontrol tedavi hücreleri ile karşılaştırıldığında siyah pigment alanını azaltır. Bu yöntem, bileşik kitaplığımızı kullanarak tarama faaliyetleri için yararlıdır. Hızlı bir şekilde test edilmesi gereken yüzlerce örnek vardır.Ayrıca bu yöntem melanogenez içeren mekanizmayı araştırmak için de kullanılabilir. Biyoaktif adaylar bileşikler tespit edildikten sonra, biyolojik mekanizmalar veya ticari uygulamalar çalışma onların tanıklığı için.

quantification-of-hypopigmentation-activity-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Neonatal hipoksi-iskemi biyokimyasal belirteçler ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yaklaşım, yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ve Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi (GC / MS) kullanmaktadır.

Yenidoğan Hipoksi Biyokimyasal Ölçüm

Fotodinamik tedavi (PDT), akciğer kanseri tedavisi için non-invaziv ve cerrahi olmayan bir yöntemdir. Işığa duyarlılaştırıcılar seçici olarak tümör dokusunda birikir ve oksijen ve uygun dalga boyundaki ışığın varlığında tümör hücresi ölümüne yol açar. Bu protokol videosunda, akciğer kanseri hücrelerinde potansiyel bir ışığa duyarlılaştırıcının fototoksik potansiyelini değerlendirmek için PDT tabanlı yöntem kullanılmıştır.

İn Vitro Fototoksisite Deneyi: Akciğer Kanseri Hücrelerinde Bir Fotosensitizörün Fototoksik Potansiyelini Değerlendirmek için PDT Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, insan derisini taklit eden bir fare modeli olan insanlaştırılmış bir fare modelinde UV duyarlılığını ölçmeye yönelik bir yöntem açıklanmaktadır. Ciltte kızarıklık veya ödem oluşturabilecek UV radyasyonunun minimum eritematöz dozunu (MED) belirliyoruz. Yöntem, UV duyarlılığını azaltmak için kullanılan ilaçların etkinliğini bulmaya yardımcı olabilir.

Minimum Eritematöz Doz Deneyi: Fare Modellerinde UV Duyarlılığını Ölçmek İçin Bir Yöntem

Epidermal melanin tenli UV duyarlı insan bir fare modelinde forskolin topik uygulanmasıyla elde edilir. En az eritematöz doz (MED) deneyi ile ölçüldüğü gibi güçlü bir UV aracılı enflamasyonun (güneş yanığı) karşı koruma koyulaşması deri ve epidermal cAMP düzeyleri farmakolojik manipülasyonu.

Bir Insanlaşmış Fare Modeli epidermal melanin ve Karşı Koruma yanığı Farmakolojik İndüksiyon

Bu makale, Y-27632'nin TIVA ortamına eklenmesinin yetişkin cilt dokularından melanosit lerin verimini önemli ölçüde artırabileceğini bildiriyor.

Y-27632 Yetişkin Cilt Dokularından İnsan Melanositlerin Verimini Zenginleştirir

Bu protokol, bu tür bileşiklerin klinik öncesi taramasında kullanılabilecek fotoanahtarlanabilir antikanser peptitlerinin değerlendirilmesi için benimsenen bir dizi deney sunmaktadır. Bu, 2D ve 3D hücre kültürlerinde sitotoksisite değerlendirmesini, ex vivo (model doku) fotoizomerizasyon etkinliğinin değerlendirilmesini ve in vivo etkinliği içerir.

Fotokontrollü Biyolojik Olarak Aktif Bileşiklerin İn Vitro ve İn Vito Değerlendirilmesi - Kanser Fotofarmakolojisi için Potansiyel İlaç Adayları

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

Gözün retina pigment epitel tabakasını etkileyen dejeneratif göz hastalıkları monogenik ve poligenik kökenlidir. Çeşitli hastalık modelleri ve bir yazılım uygulaması olan LipidUNet, hastalık mekanizmalarını ve potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek için geliştirilmiştir.

LipidUNet-Machine Learning Tabanlı iPSC Kaynaklı Retinal Pigment Epiteli Kullanılarak Lipid Birikintilerinin Karakterizasyonu ve Nicelleştirilmesi Yöntemi

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Öğrenin in vitro hipopigmentasyon aktivitesini B16-F10 melanositlerinde tirozinaz aktivitesi, melanin içeriği ve hücre boyama yöntemleriyle değerlendirmeyi. Bu yöntemler fonksiyonel kozmetik geliştirme araştırmaları için hızlı ve güvenilir sonuçlar sunar.

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

Daha fazla video keşfet