Name: Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae kullanarak solunum ve fermantatif metabolizmayı yüksek verimli tarama yöntemiyle analiz etmeyi. Bu protokol, biyoteknoloji ve biyomedikal araştırmalarda metabolik mühendislik için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje desteklenmiştir göre Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (grant numarası 293940) ve Fundación TELMEX-TELCEL (grant sayı 162005585), IKOM için her ikisi de verir.

1. Kültür Medya ve Inoculum hazırlık
<ol><li>100 mL % 2 maya özü-pepton-Dekstroz (YPD) sıvı orta hazırlamak (1 gr maya ekstresi, kazein pepton, 2 g ve 2 g glikoz için 100 mL distile su ekleyin). Medya 3 mL 15 mL edilemezler konik tüpler içine dağıtmak. Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için medya. Not: Medya bir ay 4-8 ° C'de depolanabilir</li>
	<li>Serin steril % 2 YPD et suyu 3 mL gliserol-20 ° C'de korunmuş S. cerevisiae hücre 250 μL ile dolu bir konik tüp aşılamak Gecede 200 devirde ajitasyon ile bir orbital Shaker-30 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Petri kabına (60 x 15 mm2) steril % 2 YPD agar ile dolu çizgi (10 g maya ekstresi, kazein pepton, 20 g glikoz, 20 g ve 20 g bakteriyolojik agar için 1000 mL distile su ekleyin) bir kısır döngü kullanarak konik tüp içinde yetiştirilen hücreleri ile. İzole kolonilerin gelişim göstermek kadar 30 ° C'de Petri kabına kuluçkaya.</li>
	<li>10 mL serin steril % 2 YPD et suyu ile dolu bir konik tüp içine izole bir koloni aşı öncesi inoculum hazırlamak ve bu gecede 200 devirde sürekli ajitasyon ile 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>2. Kültür Medya ve Mikroplaka büyüme eğrileri
<ol><li>10 mL % 1'ypd suyu hazırlamak (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 0.1 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin), % 2 YPD suyu 10 mL (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 0.2 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin) ve 10 mL % 10 YPD suyu (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 1 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin). Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için bu büyüme ortamları. Not: Kültür medya fermantatif büyüme bir denetim olarak hizmet vermektedir.</li>
	<li>10 mL % 2 maya özü-pepton-etanol (türü) suyu ve 10 mL % 2 maya özü-pepton-gliserol (YPG) suyu hazırlayın. % 2 türü: 0.1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 10 mL etanol 0.2 mL distile su ekleyin. % 2 için YPG: 0.1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve gliserol 10 mL için 0.2 mL distile su ekleyin. Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için bu büyüme ortamları. Not: Gliserol ve etanol sadece mitokondrial solunum tarafından metabolize fermente karbon kaynakları vardır. Bu nedenle, onlar bir solunum büyüme denetimleri kullanılır. Bu adımda, maya özü-pepton (YP) suyu (10 g maya özü ve kazein pepton 1000 mL distile su içinde 20 g) bir üs olarak kullanarak büyüme fenotip üzerindeki etkilerini test etmek için karbon kaynağı Kültür medya konsantrasyon ve türünü değiştirilebilir. Karbon yanı sıra diğer besin etkilerini sınamak için sentetik tam (SC) orta denemenin amacı göre desteklenen. Maya azot temel amino asitler, 5 g amonyum sülfat 1.8 g için SC orta noktasıdır [(NH4)2SO4], monosodyum fosfat (NaH2PO4), 1.4 g ve 2 g bırakma 1000 mL distile su karışımı. Ek bir karbon kaynağı ve ek azot kaynağı gerekli konsantrasyonlarda ile medya.</li>
	<li>Deneysel tasarım için uygun kültür ortamının 145 μL her şey bir kapak ile steril Mikroplaka (10 x 10-de) ekleyin ve onları ön inoculum 5 μL ile aşılamak. Not: amaç maddeler/bileşikler etkisi Maya enerjik metabolizma ekran için ise, bu madde/bileşik bu adımı sırasında eklenmelidir. Ayrıca, bir kapak ile Mikroplaka her türlü yararlı olmalıdır.</li>
	<li>30 ° C'de Mikroplaka Okuyucu 48 h. ölçü 600 optik yoğunluk (OD) için 200 devirde sabit ajitasyon ile çok iyi plaka kuluçkaya nm her 30 veya 60 dak. Not: Mikroplaka Okuyucu Mikroplaka kuluçkaya seçeneği varsa, bu bir orbital çalkalayıcı, OD her ölçüm arasında aynı koşulları içinde inkübe.</li>
</ol>3. büyüme eğrileri sarsılmış konik şişeler içinde
<ol><li>Uygun kültür ortamının 4,8 mL 20 mL konik şişeler ve basınçlı kap ekleyin. Her şişesi 200 μL OD600nm ~ 2 serin, steril % 2 YPD suyu içinde ön inoculum kültürünün ile aşılamak. Onları 24 h için 250 rpm sabit ajitasyon ile 30 ° C'de kuluçkaya. Not: kuluçka süresi 24 saat yüksekse, 50 mL konik şişeler ve basınçlı kap uygun kültür ortamının 12 mL ekleyin. Onları ön inoculum 500 μL ile aşılamak. Fermantatif büyüme denetimleri (YP medya % 1, % 2 veya % 10 glikoz ile) ve solunum büyüme denetimleri (YP % 2 gliserol veya etanol ortamla) dikkate almak önemlidir.</li>
	<li>Sarsılmış konik şişesi kültürünün 100 μL al ve 900 μL 1 mL spektrofotometre küvet içinde distile su içinde seyreltik ve karışımı yavaşça pipetting tarafından. 600 OD ölçmek bir spektrofotometre her 2 h kullanarak nm. Gerçek OD elde etmek için sonucu on tarafından çarpın.</li>
</ol>4. veri işleme ve kinetik parametrelerin hesaplama
<ol><li>
Yeni bir proje dosyasında istatistik paketi yazılımında oluşturun. "Yeni tablove grafik" bölümünde "XY" seçeneğini seçin.
	<ol>
<li>Seçeneği seçin: "bir boş veri tablosu ile Start" "Örnek veriler" bölümünde.</li>
		<li>"Noktaları ve bağlantı hattı" grafik türünü seçin. "X" bölümü "Çoğaltır veya hata değerleri için Subcolumns" kesim içinde seçili bırakın ve içinde "Y" seçeneği seçin: "Yan yana subcolumns (10) Çoğalt değerler girin ve ortalama ve hata SD Arsa". Oluştur düğmesini tıklatın. Not: Tablo biçiminde bir X sütun ve birden fazla Y sütun, her biri daha önce seçilen 10 subcolumns var.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yazma hangi aşırı doz ölçümleri X sütununda alınmıştır zaman (Örneğin, 0, 30, 60, 90 dakika veya 0, 1, 1.5, 2 h). Y sütunlarda kültürler elde OD değerleri yazın.</li>
	<li>Logaritma Y sütun veri dönüştürme ve üstel büyüme aşamasında tanımlayın. "Analiz" düğmesini tıklatın, "Dönüştürmek" analiz, Y kullanarak Y değerlerini seçin Log(Y) =. "Galeri sonuçları", "Dönüştürmek" veri tablo seçin "Analiz" düğmesini tıklatın ve "Doğrusal regresyon" analiz seçin gidin. Doğrusal bir davranış takip etmez OD değerleri almamak. Değerleri almamak için bunları veri tablosunu seçin ve "Ctrl + E"yazın. Not: Üstel büyüme denklem de veya üssel faz ile uyuyor beri izleyen veya üssel faz değil değerleri almamak önemlidir.</li>
	<li>"Veri tabloları Galeri", veri tablosunu seçin "veri 1". "Analiz" düğmesini tıklatın ve "Doğrusal olmayan regresyon (eğri FIT)" Analizi "XY analizleri" arasındaseçin.</li>
	<li>Analiz ve "Tamam" düğmesini tıklatın veri kümelerini seçin. "Üstel denklemi" bölümüne "Uygun" sekmesini seçin ve "üstel büyüme denklemi" seçin (, nerede hücre konsantrasyonu, X X0 sıfır zamanda μ hücre konsantrasyon olduğunu belirli büyüme oranı ve t zamanı). "Uyan en az kare sayısını" uygun yöntemi olarak kullanmak ve aradeğerleme bölümü seçili bırakın. "Tamam" düğmesini tıklatın. Not: "Galeri sonuçlarının"doğrusal olmayan uygun sonuçlar ile sekmesidir. Katlama zaman (Dt) ve özel yazılım hesaplar büyüme oranı (μ). Yazılım μ K olarak sonuçları sekmesini gösterir.</li>
	<li>Yeni bir proje dosyasını açın ve "yeni tablo ve grafik" bölümünde, sütun seçim seçin. "Bir boş veri tablosu ile Başlat" seçeneğini seçin ve istediğiniz grafiği seçin. Ortalama SD seçin "Oluştur" düğmesine çizmek seçin.</li>
	<li>"Galeri sonuçlarının" doğrusal olmayan uygun sonuçlar sekmesini μ veya Dt değerleri kopyalamak ve bir sütunda yapıştırabilirsiniz. Son olarak, "Analiz" düğmesini seçin ve istediğiniz analiz farklı nutrimental koşullardan kinetik parametrelerin karşılaştırmak için "Sütun analizleri" bölümünde seçin. Not: Kinetik parametrelerin fermantatif büyüme denetimleri (YP medya % 1, % 2 veya % 10 glikoz ile) elde edilen ve solunum büyüme denetimleri (YP % 2 gliserol veya etanol ortamla) yardımcı olur fermantatif ve mitokondrial solunum eşiği belirlemek, anılan sıraya göre. Kinetik karşılaştırma beslenme durumu ve madde/bileşik ile solunum ve fermantatif büyüme denetlesinler parametreleri tanımlayan olası etkisi solunum veya fermantatif metabolizmasına yardımcı.</li>
</ol>

<ol><li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li>
<li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li>
<li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect%3F+A+review+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li>
<li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+effect%3A+a+regulatory+system+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li>
<li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li>
<li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+and+Warburg+effects%3A+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li>
<li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells%3A+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25(2018).</li>
<li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17(2014).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.mi.03.100149.002103">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li>
<li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022247X07002260">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li>
<li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800(2014).</li>
<li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li>
<li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li>
<li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+curves%3A+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

J. Monod10 bakteriyel kültürlerde büyüme çalışmanın Mikrobiyoloji temel yöntemi olduğunu ifade beri uzun zaman geçti. Moleküler araçları gelişiyle kullanım ve çalışma bir teknik olarak büyüme geciktirir. Çok sayıda birbiriyle ilişkili süreçlerinden büyüme karmaşıklığına rağmen onun temel mekanizmaları matematiksel modeller11kullanarak tanımlanabilir. En karmaşık moleküler mekanizmaları12aydınlatmak için tamamlayıcı bir aracı olarak kullanılan güçlü b...

Saccharomyces cerevisiae büyüme fizyolojik ve moleküler mekanizmaları onlarca tanımlamak için değerli bir araç hizmet vermiştir. Büyüme öncelikle üç yöntemlerle ölçülen: spot test, koloni oluşturan birim sayma ve büyüme eğrileri seri dilutions. Bu teknikler belirli yanıtlar veya fenotipleri araştırmak için tek başına veya birlikte çeşitli yüzeyler, çevre koşulları, mutantlar ve kimyasallar ile kullanılabilir.
Mitokondrial solunum içinde büyüme kinetik başarıyla bilinmeyen mekanizmaları keşfetmek için uygulanmış olan biyolojik bir süreçtir. Bu durumda, tek karbon ve enerji kaynağı değerlendirmek için izin verdiğinden takviyesi ile fermente karbon büyüme ortamının gliserol, laktat veya (ki sadece mitokondrial solunum tarafından metabolize) etanol gibi kaynakları Solunum büyüme, tedirginlikler Oksidatif fosforilasyon faaliyet1' algılamak önemlidir. Diğer taraftan, fermantasyon arkasında mekanizmaları deşifre bir yöntem olarak büyüme kinetik modelleri kullanmak karmaşıktır.
Fermantasyon ve mitokondrial solunum Crabtree ve Warburg etkileri2,3gibi belirli fenotipleri arkasında moleküler mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Crabtree etkisi ile karakterize bir artış glycolytic akı, baskı mitokondrial solunum ve fermantasyon ATP fermente karbonhidrat yüksek konsantrasyonda huzurunda oluşturmak için birincil yolu olarak kurulması (> 0.8 mM)4,5. Memeli hücrelerinde, ana, fermantasyon laktat6ürünü Warburg etkisi metabolik olarak Crabtree etkisi farkı ile analog bu olmak. Gerçekten de, kanser hücrelerinin, Glikoz alımı ve tüketimi bile oksijen7huzurunda uyarının harekete geçirilmesine karşılık çeşitli tarafından Warburg etkisi sergilenmektedir. Böylece, solunum geçiş Crabtree etkisi fermantasyon için moleküler temeli eğitim biyoteknolojik yankıları (etanol üretimi için) hem de olası etkileri kanser araştırma vardır.
S. cerevisiae büyüme Crabtree ve Warburg etkileri çalışmaya uygun bir araç olabilir. Maya üssel faz mitokondrial solunum ve fermantasyon, büyüme sürdürmek için gerekli olan ATP üretmek için kullanılan merkezi yolları vardır gerçeğine dayanarak bu fikir. Örneğin, S. cerevisiae gelişimini yakından ATP üretme yolları fonksiyonuyla ilişkilidir. Fermantasyon sadece 2 ATP molekülleri, üretir, ancak glukoz molekülü başına S. cerevisiae ' mitokondrial solunum üretir yaklaşık 18 ATP molekülleri, bu nedenle bu büyüme hızı metabolik yollar ile sıkı bağlantıları bulunmaktadır bekleniyor üreten ATP8. Fermantasyon ATP üretmek için ana yolu olduğunda, bu bağlamda, Maya düşük ATP üretimi için Glikoz alımı hızını artırarak dengeler. Aksine, mitokondrial solunum ana ATP kaynağı olarak kullanmak Maya hücreleri glikoz tüketiminden düşüktür. Bu ATP nasıl oluşturulacaklarını belirleme önce Maya duyu karbonhidrat durumu için önemli olduğunu gösterir. Bu nedenle, glikoz kullanılabilirlik fermantasyon ve mitokondrial solunum arasında geçiş içinde önemli bir rol oynar S. cerevisiae. Huzurunda yüksek miktarda glikoz Maya fermantasyon ATP üretmek için orta yol olarak tercih ediyor. İlginçtir, Maya fermantasyon belirli büyüme oranı, en yüksek seviyede korunur. Öte yandan, glikoz seviyesinin düşük altında S. cerevisiae düşük büyüme oranları koruyarak mitokondrial solunum, kullanarak ATP üretir. Böylece, toplama varyasyon glikoz ve diğer karbon kaynaklarının Maya'nın tercihi fermantatif ve solunum büyüme arasında değişimler ikna etmek. Üstel büyüme denklem bu gerçeği dikkate alarak, bir saat (Dt) ve belirli büyüme hızı (µ) iki katına gibi kinetik parametrelerin biyolojik anlamını elde edebilirsiniz. Örneğin, Maya birincil yolu mitokondrial solunum kullandığında alt µ değerleri bulunmuştur. Aksine, fermantasyon lehine koşullar altında yüksek µ değerleri bulunmuştur. Bu metodoloji fermantasyon ve mitokondrial Solunum etkileyen herhangi bir kimyasal muhtemel mekanizmaları ölçmek için kullanılabilir S. cerevisiae.
Bu kağıt amacı belirli bir madde/bileşik etkilerini mitokondrial solunum veya fermantasyon süzmek için büyüme kinetik esas alarak bir yöntemini teklif etmektir.

<table><tbody><tr><td>Orbital Çalkalayıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td>4353</td><td>İnokulum inkübasyonu veya konik fask kültürleri için Biyoekran</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Büyüme eğrileri</td><td>C MBR</td><td>Mikroplakalarda toplu kültürler için</td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7021</td><td>YPD suyu hazırlama için</td></tr><tr><td>Kazeinden Pepton, enzimatik sindirim</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>82303</td><td>YPD et suyu hazırlama için</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>09182-1KG-F</td><td>YPD suyu hazırlama için</td></tr><tr><td>Bakteriyolojik Agar</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5306</td><td>YPD agar hazırlığı için</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S8282</td><td>SC suyu hazırlama için</td></tr> <tr><td>(NH4) 2SO4</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4418</td><td>SC suyu hazırlama için</td></tr><tr><td>Amino asit ve amonyum sülfat içermeyen maya azot bazı</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Y1251</td><td>SC suyu hazırlama için</td></tr><tr><td>Maya sentetik bırakma ortamı takviyeleri</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Y1501</td><td>SC suyu hazırlama için</td></tr><tr><td>Amonyum sülfat granül</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-R</td><td>Orta takviye örneği için</td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>R5010</td><td>Orta takviye örneği için</td></tr><tr><td>Galaktoz</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td>Orta takviye örneği için</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S7903</td><td>Orta takviye için örnek</td></tr><tr><td>Absolut etanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>Orta takviye için örnek</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>J.T. Baker</td><td>2136-01</td><td>Orta takviye örneği için</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td></td><td>Veri analizi için</td></tr><tr><td>Petek mikroplakalar</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502550</td><td>Mikroplaka kültürleri için</td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae hücreleri veya üssel faz olarak onların büyüme fermantasyon ve/veya mitokondrial solunum ATP üreten sürdürmek. Fermente karbon konsantrasyonu esas olarak Maya hücreleri ATP oluşturmak nasıl yönetir; Böylece, fermente karbonhidrat düzeyleri varyasyon S. cerevisiaeenerjik metabolizma kullanıyor. Bu kağıt toplama değişikliklerin etkisini ve solunum ve fermantatif metabolizmasına karbon kaynağı niteliği tahmin etmek için üstel Maya büyüme dayalı yüksek üretilen iş yöntemi açıklanır. S. cerevisiae büyüme bir Mikroplaka ölçülen veya konik sarsıldı 600 optik yoğunluk (OD) malzemelerini şişesi nm. Sonra bir büyüme eğrisi zaman, hangi kimlik ve üssel faz yelpazesi sağlar ve üstel büyüme denklemle kinetik parametrelerin elde etmek için monte karşı çizdirme OD tarafından inşa edilmiştir. Düşük belirli büyüme oranları daha yüksek katlama süreler genellikle solunum büyüme temsil eder. Buna karşılık, daha yüksek belirli büyüme oranları daha düşük katlama kez fermantatif büyüme gösterir. Zaman ve belirli büyüme oranı iki katına eşik değerleri fermente karbon kaynakları veya daha yüksek konsantrasyonlarda fermente şekerler gibi iyi bilinen solunum veya fermantatif koşullar kullanarak tahmin edilir. Bunun için belirli her zor elde edilir. Son olarak, hesaplanan kinetik parametrelerin Maya fermantatif ve/veya solunum büyüme gösterip göstermediğini kurmak için eşik değerleri ile karşılaştırılır. Bu yöntemin avantajı fermantatif veya solunum metabolizma bir madde/bileşik etkilerini anlamak için göreli basitliğidir. Büyüme karışık ve karmaşık bir biyolojik süreç olduğunu vurgulamak önemlidir; Bu nedenle, bu yöntem ilk veri oksijen tüketim miktar ve fermantasyon yan birikimi tarafından corroborated gerekir. Böylece, bu teknik bileşikler/maddeler rahatsız ya da fermantatif veya solunum metabolizma artırmak bir ön elemeyi olarak kullanılabilir.

Büyüme eğrileri birime S. cerevisiae Maya solunum ve fermantatif fenotipleri arasında ayırımcılık için kullanılabilir. Bu nedenle, biz S. cerevisiae (BY4742) toplu iş kültürleri fermantatif büyümesini teşvik bildirilmiştir farklı glikoz konsantrasyonu ile gerçekleştirilen: % 1, % 2 ve % 10 (w/v)9. Fermantatif fenotip gösterilen kültürler küçük gecikme faz ve bir yüksek büyüme oranı (resim 1) ile bir üssel faz hakkına ...

Burada solunum ve fermantatif metabolizma Saccharomyces cerevisiae üstel büyüme üstel büyüme Denklem için yaklaştırarak tahmin etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Kinetik parametrelerin hesaplanması maddeler/bileşikler etkileri fermantasyon veya mitokondrial solunum testi ile taranması için izin verir.

Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Bu yöntem, Warburg ve Crabtree etkilerinin ardındaki moleküler temelnedir gibi biyoteknolojik ve biyomedikal alanlardaki temel soruların yanıtlatılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, solunum ve fermantif metabolizmabazı maddelerin etkilerinin yüksek iş artışı çalışma sağlar. Serin üç mililitre içeren 15 mililitrekonik tüp aşılayarak başlayın, steril 2% maya özü peptone dekstroz, veya YPD suyu, ile 250 mikrolitre S.cerevisiae maya hücreleri negatif 20 santigrat derece gliserol korunmuş.Mayayı bir gecede 30 santigrat derece ve 200 rpm'de orbital shaker'da kuluçkaya yatırın. bir 60 mililitre üzerine streaking için, 2% YPD agar dolu Petri çanak ertesi sabah. Kültür yalıtılmış koloniler gözlemlenene kadar 30 santigrat derecede çanak.Sonra sallayarak 30 derece santigrat gece kültürü için serin, steril% 2 YPD suyu 10 mililitre içeren yeni bir konik tüp tek bir izole koloni aşılamak. Mikroplaka büyüme eğrisi kurulumu için, steril 10'a 10 kuyumikroplakasının her kuyusu için uygun bir deneysel kültürel ortamın 145 mikrolitresini ekleyin ve her kuyuyu bir gecede beş mikrolitre ile aşılamak. Daha sonra çok kuyulu plakayı 30 santigrat derecede, 200 rpm'de sürekli ajitasyonla 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve optik yoğunluğu her 30 veya 60 dakikada bir 600 nanometre de ölçün.Sarsılmış konik şişe büyüme eğrisi kurulumu için, 30 santigrat derece ve 250 rpm kuluçka için iki 600 nanometre optik yoğunluğu nda pre-inoculum kültürünün 200 mikrolitre ile uygun bir steril kültür medya 4.8 mililitre içeren 20 mililitre konik şişeler inoculate. Dakikada 250 devirde ajitasyon, düşük ajitasyon hızlarında solunum koşullarında maya büyümesinin azaldığını gözlemlediğimiz için solunum büyümesini uygulayan düşük karbon kaynakları konsantrasyonlarında uygun bir büyüme elde etmek için çok önemlidir. 24 saat boyunca her iki saatte bir 600 nanometrede optik yoğunluğun ölçülmesine izin vermek için, bir mililitrelik spektrofotometre cuvette 900 mikrolitre distile su damıtılmış su sarsılmış konik şişe kültürünün 100 mikrolitre seyreltmek ve yavaşça pipet ile karıştırın.Veri işleme için, uygun bir istatistiksel paket yazılımında yeni bir proje dosyası oluşturun, yeni tablo ve grafik menüsünü açın ve XY'yi seçin. Örnek veri menüsüaltında, boş bir veri tablosu ve bir nokta ve bağlantı hattı grafiği ile başlat'ı seçin. Çoğaltmalar veya hata değerleri için X bölümünü alt sütunlarda seçili bırakma. Y bölümünde, yan yana alt sütunlarda 10 çoğaltma değerlerini girin ve ortalama ve hata SD'yi çizin'i seçin. Ardından oluştur'u tıklatın.X sütununa OD ölçümlerinin alındığı zamanı ve Y sütunundaki kültürlerden elde edilen OD değerlerini girin. Y sütun verilerini logatiklere dönüştüren üstel büyüme aşamasını belirlemek için çözümle'yi tıklatın ve dönüştürme çözümlemesini seçin. Y değerlerini seçmek ve sonuç galerisini açmak için Y eşittir günle'yi kullanın.Dönüşüm veri tablosunu seçin, çözümle'yi tıklatın ve tablodaki değerleri seçerek doğrusal eğilimi izlemeyen optik yoğunluk değerleri hariç doğrusal regresyon çözümlemesi'ni seçin ve veri tabloları galerisini E.In, verileri bir tablo seçin ve analiz et'i tıklatın. Doğrusal olmayan regresyon eğrisi uygunluk çözümlemesi ve çözümlemek için veri kümelerini seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, enterpolasyon bölümünü seçili bırakarak verilere en az kare sığdırın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, yeni bir proje dosyası açın ve yeni tablo ve grafik menüsünde sütun seçimini seçin, boş bir veri tablosuyla başlayın ve istenen grafik. Grafiği standart sapmayla ortalamayı çizecek şekilde ayarlayın ve oluştur'u tıklatın.Sonuçlar galerisindeki doğrusal olmayan sığdırma sonuçları tablosundan ortalama veya delta zaman değerlerini kopyalayın ve verileri bir sütuna yapıştırın. Son olarak, farklı nutrimental koşulların kinetik parametrelerini karşılaştırmak için sütun analizleri menüsündeki ilgi analizini tıklatın ve seçin. Büyüme kinetik eşik değerleri güçlü yönler arasında değişir ve analizde kullandığımız koşullara göre değerlendirilmelidir.Fermantif fenotip gösteren kültürlerde küçük bir gecikme evresi ve yüksek büyüme hızına sahip üstel faz vardır. Ağırlıklı olarak oksidatif fosforilasyon la enerji elde eden kültürler, üstel evrede yavaş büyüme hızıile daha uzun bir gecikme evresi sergilerler. Belirli büyüme hızının hesaplanması ve üstel büyüme denklemi kullanılarak büyüme eğrilerinin iki katına çıkarılması, solunum ve fermantative büyüme değerleri için eşiklerin ayarlanmasına olanak sağlar.Örneğin, bu temsili deneylerde, farklı resveratrol konsantrasyonlarının S.cerevisiae BY4742 hücreleri üzerindeki etkileri değişen glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak hücre enerjik durumunun modifikasyonu ortaya koymaktadır. Burada, % 10 glikoz ile takviyesi amonyum düşük konsantrasyonlarda bu kültürlerde genişletilmiş bir üstel büyüme fazı ile kanıtlanan olarak fermantif metabolizma lehine gösterir, daha yüksek bir konsantrasyon uzun bir gecikme fazı ve üstel faz sırasında daha yavaş bir büyüme hızı ile kanıtlanan bir solunum-fermantif metabolizma neden olurken. Son olarak, aynı koşullar altında yetiştirilen bu iki farklı maya suşları arasında fermantatif iki kat-zaman değerlerinde sağlam farklılıklar gözlemlenebilir ve analiz edilen her bir suuş için iki kat zaman eşiğinin doğrulanması gerekliliği vurgulanır.Bu yordamı denerken, bu protokolün yalnızca fenotipi dışarı çıkarmak için kullanıldığını unutmamak gerekir. Solunum ve fermantasyon üzerindeki özel etkiler, sırasıyla oksijen tüketimi tahlilleri veya fermantasyon yan ürünlerinin birikmesi ile doğrulanmalıdır.

saccharomyces-cerevisiae-exponential-growth-kinetics-batch-culture-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Belirli mRNA'ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA'nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Maya mayalarındaki canlı hücrelerin bir hücreli katlanarak değerlendirilmesi (ODELAY) olarak adlandırılan zaman atlamalı mikroskobi kullanarak katı miyar üzerinde kolonilere dönüşürken tek tek maya hücrelerinin büyüme fenotiplerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kolonilere dönüşen genetik olarak özdeş hücrelerin popülasyon heterojenliği doğrudan gözlemlenebilir ve nicelenebilir.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Maya bütün hücrelerinde mitokondriyal solunum, hücre biyoenerjiğinin değerli bir göstergesidir. Burada, farklı maya türleri için geçerli olan bu fenotipi ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Maya Bütün Hücrelerinde Mitokondriyal Solunum Miktar Tayini

Bu protokol, Saccharomyces eubayanus'ta transkripsiyonel aktivite ölçümlerine izin vererek, glikozdan maltoza geçişi izlemek, metabolik adaptasyonların gerçek zamanlı analizini sağlamak ve çeşitli koşullar altında endüstriyel fermantasyon için gerinim optimizasyonunu desteklemek için bir biyolüminesan raportör kullanır.

In vivo (İn canlı) Mayada Biyolüminesan Raportör Kullanılarak Metabolik Geçiş Sırasında Transkripsiyonel Aktivitenin İzlenmesi

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae kullanarak solunum ve fermantatif metabolizmayı yüksek verimli tarama yöntemiyle analiz etmeyi. Bu protokol, biyoteknoloji ve biyomedikal araştırmalarda metabolik mühendislik için kritik öneme sahiptir.

Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe

Daha fazla video keşfet