Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe

Bu yöntem, Warburg ve Crabtree etkilerinin ardındaki moleküler temelnedir gibi biyoteknolojik ve biyomedikal alanlardaki temel soruların yanıtlatılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, solunum ve fermantif metabolizmabazı maddelerin etkilerinin yüksek iş artışı çalışma sağlar. Serin üç mililitre içeren 15 mililitrekonik tüp aşılayarak başlayın, steril 2% maya özü peptone dekstroz, veya YPD suyu, ile 250 mikrolitre S.cerevisiae maya hücreleri negatif 20 santigrat derece gliserol korunmuş.

Mayayı bir gecede 30 santigrat derece ve 200 rpm'de orbital shaker'da kuluçkaya yatırın. bir 60 mililitre üzerine streaking için, 2% YPD agar dolu Petri çanak ertesi sabah. Kültür yalıtılmış koloniler gözlemlenene kadar 30 santigrat derecede çanak.

Sonra sallayarak 30 derece santigrat gece kültürü için serin, steril% 2 YPD suyu 10 mililitre içeren yeni bir konik tüp tek bir izole koloni aşılamak. Mikroplaka büyüme eğrisi kurulumu için, steril 10'a 10 kuyumikroplakasının her kuyusu için uygun bir deneysel kültürel ortamın 145 mikrolitresini ekleyin ve her kuyuyu bir gecede beş mikrolitre ile aşılamak. Daha sonra çok kuyulu plakayı 30 santigrat derecede, 200 rpm'de sürekli ajitasyonla 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve optik yoğunluğu her 30 veya 60 dakikada bir 600 nanometre de ölçün.

Sarsılmış konik şişe büyüme eğrisi kurulumu için, 30 santigrat derece ve 250 rpm kuluçka için iki 600 nanometre optik yoğunluğu nda pre-inoculum kültürünün 200 mikrolitre ile uygun bir steril kültür medya 4.8 mililitre içeren 20 mililitre konik şişeler inoculate. Dakikada 250 devirde ajitasyon, düşük ajitasyon hızlarında solunum koşullarında maya büyümesinin azaldığını gözlemlediğimiz için solunum büyümesini uygulayan düşük karbon kaynakları konsantrasyonlarında uygun bir büyüme elde etmek için çok önemlidir. 24 saat boyunca her iki saatte bir 600 nanometrede optik yoğunluğun ölçülmesine izin vermek için, bir mililitrelik spektrofotometre cuvette 900 mikrolitre distile su damıtılmış su sarsılmış konik şişe kültürünün 100 mikrolitre seyreltmek ve yavaşça pipet ile karıştırın.

Veri işleme için, uygun bir istatistiksel paket yazılımında yeni bir proje dosyası oluşturun, yeni tablo ve grafik menüsünü açın ve XY'yi seçin. Örnek veri menüsüaltında, boş bir veri tablosu ve bir nokta ve bağlantı hattı grafiği ile başlat'ı seçin. Çoğaltmalar veya hata değerleri için X bölümünü alt sütunlarda seçili bırakma. Y bölümünde, yan yana alt sütunlarda 10 çoğaltma değerlerini girin ve ortalama ve hata SD'yi çizin'i seçin. Ardından oluştur'u tıklatın.

X sütununa OD ölçümlerinin alındığı zamanı ve Y sütunundaki kültürlerden elde edilen OD değerlerini girin. Y sütun verilerini logatiklere dönüştüren üstel büyüme aşamasını belirlemek için çözümle'yi tıklatın ve dönüştürme çözümlemesini seçin. Y değerlerini seçmek ve sonuç galerisini açmak için Y eşittir günle'yi kullanın.

Dönüşüm veri tablosunu seçin, çözümle'yi tıklatın ve tablodaki değerleri seçerek doğrusal eğilimi izlemeyen optik yoğunluk değerleri hariç doğrusal regresyon çözümlemesi'ni seçin ve veri tabloları galerisini E.In, verileri bir tablo seçin ve analiz et'i tıklatın. Doğrusal olmayan regresyon eğrisi uygunluk çözümlemesi ve çözümlemek için veri kümelerini seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, enterpolasyon bölümünü seçili bırakarak verilere en az kare sığdırın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, yeni bir proje dosyası açın ve yeni tablo ve grafik menüsünde sütun seçimini seçin, boş bir veri tablosuyla başlayın ve istenen grafik. Grafiği standart sapmayla ortalamayı çizecek şekilde ayarlayın ve oluştur'u tıklatın.

Sonuçlar galerisindeki doğrusal olmayan sığdırma sonuçları tablosundan ortalama veya delta zaman değerlerini kopyalayın ve verileri bir sütuna yapıştırın. Son olarak, farklı nutrimental koşulların kinetik parametrelerini karşılaştırmak için sütun analizleri menüsündeki ilgi analizini tıklatın ve seçin. Büyüme kinetik eşik değerleri güçlü yönler arasında değişir ve analizde kullandığımız koşullara göre değerlendirilmelidir.

Fermantif fenotip gösteren kültürlerde küçük bir gecikme evresi ve yüksek büyüme hızına sahip üstel faz vardır. Ağırlıklı olarak oksidatif fosforilasyon la enerji elde eden kültürler, üstel evrede yavaş büyüme hızıile daha uzun bir gecikme evresi sergilerler. Belirli büyüme hızının hesaplanması ve üstel büyüme denklemi kullanılarak büyüme eğrilerinin iki katına çıkarılması, solunum ve fermantative büyüme değerleri için eşiklerin ayarlanmasına olanak sağlar.

Örneğin, bu temsili deneylerde, farklı resveratrol konsantrasyonlarının S.cerevisiae BY4742 hücreleri üzerindeki etkileri değişen glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak hücre enerjik durumunun modifikasyonu ortaya koymaktadır. Burada, % 10 glikoz ile takviyesi amonyum düşük konsantrasyonlarda bu kültürlerde genişletilmiş bir üstel büyüme fazı ile kanıtlanan olarak fermantif metabolizma lehine gösterir, daha yüksek bir konsantrasyon uzun bir gecikme fazı ve üstel faz sırasında daha yavaş bir büyüme hızı ile kanıtlanan bir solunum-fermantif metabolizma neden olurken. Son olarak, aynı koşullar altında yetiştirilen bu iki farklı maya suşları arasında fermantatif iki kat-zaman değerlerinde sağlam farklılıklar gözlemlenebilir ve analiz edilen her bir suuş için iki kat zaman eşiğinin doğrulanması gerekliliği vurgulanır.

Bu yordamı denerken, bu protokolün yalnızca fenotipi dışarı çıkarmak için kullanıldığını unutmamak gerekir. Solunum ve fermantasyon üzerindeki özel etkiler, sırasıyla oksijen tüketimi tahlilleri veya fermantasyon yan ürünlerinin birikmesi ile doğrulanmalıdır.