Name: Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Öğrenin sığır granuloza hücrelerinde östrojen üretimini in vitro kültür modeliyle araştırma yöntemlerini. Dondurarak saklama tekniği sayesinde hücre kültürleri uzun süre korunabilir ve doku teminine bağımlı kalmadan çalışılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Veronica Schreiter onun mükemmel teknik yardım ve kurulan dondurma tekniği ve hücre kültür modeli yararlı değişiklikler için teşekkür ederim. Ayrıca, biz gibi Maren Anders ve Swanhild Rodewald daha sonraki analiz onların mükemmel teknik yardım için teşekkür ederim.

Not: Sığır yumurtalıklar ticari bir mezbaha elde edilmiştir. Mezbaha yan topluluğu Alman yasalarına göre etik bir onay gerektirmez.
1. çalışma koşulları ve hazırlıkları
<ol><li>Kısırlık garantilemek için tüm medya gerçekleştirmek ve doku hazırlık yanı sıra tüm kültür bir laminar akış Bank kullanarak bir özel hücre kültür laboratuarda çalışıyorum.</li>
	<li>1 x 100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve yumurtalık taşıtlar için 0,5 µg/µL amfoterisin ile takıma fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) hazırlayın. Not: Bu kurulum içinde 2 h yumurtalık alma ve GC yalıtma arasında maksimal süresi kadardır.</li>
</ol>2. izolasyon sığır Granulosa hücre
<ol><li>
Yalıtım yordamına başlamadan önce yüzeyden herhangi bir kan kaldırmak için yumurtalıklarda birkaç kez 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) yıkayın. Bir ölçek kullanın, yumurtalık içinde yer, 1 x PBS ile doldurun ve PBS tekrar atmak.
	<ol>
<li>Yumurtalık kalan herhangi bir kan temizlenir bu kadar yıkama 3 – 4 x, tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir yumurtalık mümkün contaminations en aza indirmek için % 70 alkol ile batırılmış bir laboratuvar silin kullanarak silin.</li>
	<li>3 mL şırınga ve bir 18 G iğne ile küçük ve orta boyutlu köklerinin delinme tarafından GC Aspire edin (< cetvelle ölçülür 6 mm) ve bir 50 mL santrifüj tüpü foliküler sıvı Havuzu. Not: şırınga nemlendirmek için 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) küçük bir miktar alır. Bu Folliküler sıvı az miktarda toplamak için yardımcı olur ve hücre şırınga yapışmasını önler.</li>
	<li>Birkaç köklerinin delinme sonra şırınga ve iğne ara temizlik için 1 x PBS ile yıkayın.</li>
</ol>3. hücre dondurma
<ol><li>
Trypan mavi boyama kullanın ve bir hemasitometre altında hücreleri saymak.
	<ol>
<li>Hücrelerin sayısını saymak için bir tüp ile 1,5 µL % 0,25 trypan mavi çözüm hazırlamak. Not: trypan mavi mavi görünür ölü hücreleri hücre bariyer sadece erişebildiğinden canlı hücreler günahı kalır.</li>
		<li>15 µL granulosa hücre süspansiyon trypan mavi ekleyin ve onları hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Karışımı bir hemasitometre her iki odasında yerleştirin. Yaşam saymak (günahıÖrneğin,) bir büyük kare başına odası hücrelerde. Not: her ne kadar bazı kan hücreleri görülebilir, onlar onların çok küçük boyutuna göre ayrılır.</li>
		<li>Genel esaslarına göre her iki odası kareler ortalaması ile canlı hücreler sayısını hesaplamak; canlı hücreler oranını yumurtalık arasında değişebilir ama %6013aşmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir örnek daha ayrıntılı bir çözümleme için bir başvuru olarak taze izole granulosa hücre havuzundan al.
	<ol>
<li>İzole GC hücre sayısı bağlı olarak, uygun bir sayı hücre başvuru örnekleri RNA, DNA veya protein hazırlık için bir kenara. Not: sonraki diğer analizleri farklı, genellikle yüksek hücre sayıları gerektirebilir RNA izolasyon sonraki gen ifadesinin değerlendirilmesi için 1 x 105 hücreleri yeterli, olanlardır.</li>
		<li>Bir veya daha fazla aliquots başvuru hücre taze bir tüp içinde yerleştirin ve oda sıcaklığında ve hücre Pelet elde etmek için en yüksek hızı (12.000 x g) 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.</li>
		<li>Hemen şok-örnekleri sıvı azot kıpırdama. Örnek-80 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dondurma aşağıdaki gibi yapın.
	<ol>
<li>Dondurucu orta % 80 fetal buzağı serum (FCS) ve % 20 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak hazırlayın.</li>
		<li>Yavaşça GC cips için GC için oda sıcaklığında ve 500 x g3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın ve yavaşça hücreleri resuspend yok daha fazla hücre kadar % 100 FCS (Örneğin, 1 mL) içinde kümeleri görülebilir.</li>
		<li>1 birim (Örneğin, 1 mL) hazır dondurma Orta hücre süspansiyon ekleyin ve karışımı kriyojenik bir şişe aktarın. Not: Soğutucu koruma medya son konsantrasyonu % 90 FCS ve % 10 DMSO olacaktır.</li>
		<li>Kriyojenik şişeyi hızlı donma engelleyen bir uzman (ticari olarak mevcut) dondurma kapsayıcısına getirin. Soğutma hızı örnekleri-1 ° C/dak Transfer dondurma konteyner içine en az 4 h için-80 ° C dondurucu aşmaması gerekir.</li>
		<li>Daha uzun depolama için kriyojenik şişeleri Ultra düşük sıcaklık kaplarda (Örneğin, sıvı faz azot konteynerler) yerleştirin. Not: protokol, burada, dondurma daha uzun depolama sağlar gibi durdurulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. medya ve kültür plakaları için hazırlanması hücre kültürü
<ol><li>
Hücre kültür plakaları %0.02 kollajen R. ile kat Not: Kollajen R GC geliştirilmiş bir ek olarak kültür için gerekli olduğu bilinmektedir.<ol>
<li>Arıtılmış su hücre kültürü için uygun bir %0.02 kollajen R çözümle hazırlayın.</li>
		<li>İyi ücret 150 µL bir 24-şey tabak içinde eklemek (= 2 cm2/de) ve kültürünün bütün yüzeyi de kolajen R çözüm ile kaplıdır.</li>
		<li>Bir kaç saatliğine açık kapaklı kuru veya laminar akış mahallede bir gecede çözüm ver.</li>
		<li>Kültür plaka tamamen kuru olduğunda, onları kirlenme en aza indirmek 10-15 dk için UV ışığıyla ışınlatayım.</li>
		<li>Gerekirse, plakayı 4 ° C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medya ve kültür iş laminar akış başlık altında için ek hazırlamak. GC başarılı bir kurtarma için onlar hemen çözdürme sonra işlenmek üzere var.</li>
	<li>
Aşağıdaki ortam hazırlamak.
	<ol>
<li>2 mM L-glutamin, %0.084 sodyum bikarbonat, % 0,1 sığır serum albumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL Sodyum selenit, 5 µg/mL transferrin, 10 ng/mL insülin ve 1 mM esansiyel olmayan amino asitler ile α-Minimal gerekli ortam (α-MEM) ek.</li>
		<li>Ayrıca, 100 IU penisilin ve 0.1 mg/mL streptomisin ortamına Ekle. Not: bir kez ısındı, antibiyotikler, yaklaşık 48 saat için stabildir. Bu nedenle, aliquot kültür set-up için medya ve planlanan medya istenilen miktarda Döviz. Yalnızca medya aliquots 37 ° c su banyosu içinde önceden ısıtmak. Hazırlanan medya artık 3 aydan fazla için 4 ° C'de muhafaza edilebilir.</li>
		<li>Steroid kültürlü sığır GC etkinliğinde ikna etmek için α-MEM Ayrıca 20 ng/mL folikül - uyarıcı hormon (FSH) ile 50 ng/mL R3 IGF-1 ve 2 µM androstenedion takviyesi. Not: Her zaman kısa bir süre önce bir kültür veya ortam değişimi başlangıcı bu bileşenler ek. Bu steroid etkinlik tehlikeye atabilir FSH ve IGF-1 hisse senedi çözümleri için tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. hücre kültür çalışma
<ol><li>Hücreleri hızlı bir şekilde su banyosu için 3-4 dk 37 ° C'de erimek ve hücre süspansiyon 37 ° C önceden ısıtılmış α-MEM (olmadan hormon takviyesi) içine aktarın. Santrifüjü için son hacmi 10 mL önerilir.</li>
	<li>3 dakika oda sıcaklığında ve 500 x gde GC santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak. Önceden ısıtılmış ve desteklenmiştir α-MEM ekleyin ve hücreleri dikkatle resuspend.</li>
	<li>Tohum GC, 1 x 105 veya iyi başına 1 x 106 hücre yoğunluğu son hacmi 500 µL. Teknik çoğaltır koşul başına en az üç kültür Wells içerir.</li>
	<li>8 d için bir kuluçka-37 ° c % 5 CO2 hücre kültüründe kuluçkaya.</li>
	<li>Ortam değişimi her geçen gün gerçekleştirmek. Sadece üçte iki kültür ortamının stresi azaltmak için ve taze medya hücrelere uyarlaması kolaylaştırmak için değiştirin. Not: GC kültür birkaç gün sonra tipik bir fibroblast benzeri fenotip oluşturmak ve birlikte küme eğilimindedir. Yüksek hücre yoğunluğu kültüründe daha büyük kümeler normal yoğunluk GC Kültür (Şekil 1, doğru kapı aynası sol vs ) ile karşılaştırıldığında daha sık bulunmuştur.</li>
</ol>6. daha sonraki analiz kültürlü Granulosa hücre
<ol><li>Steroid hormon analizi gerçekleştirmek için ortam toplamak ve -20 ° C'de dondurmak Harcanan medya [Örneğin, radioimmunoassay (RIA)]14östradiol ve progesteron konsantrasyon çözümlemek için uygun yöntemleri kullanın.</li>
	<li>Farklı hedef molekülleri (RNA, DNA, protein vb.)sonraki analiz için uygun bir lysing Ajan ile kültür çanak doğrudan hücrelerde tedarikçi tarafından önerildiği gibi koşullar. Not: lysed hücreleri-20 ° C'de 1 hafta kadar saklanabilir çoğu yalıtım yordamları için burada, protokolü durdurmak mümkündür. Daha uzun depolama için hücreleri-80 ° C'de tutulmaları gerekir</li>
	<li>Transkript bereket belirlemek, cDNA sentez ve nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) teknikleri15tarafından belirli transkript ölçmek için. İstatistiksel değerlendirme farklı hücre kültürleri, farklı hücre hazırlıkları (biyolojik çoğaltır) kökenli en az üç çoğaltmalar içermelidir.</li>
</ol>

<ol><li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li>
<li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li>
<li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li>
<li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+resource%3A+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li>
<li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+granulosa+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li>
<li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li>
<li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells%3A+protein+secretion%2C+steroid+metabolism%2C+and+responsiveness+to+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li>
<li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system%3A+induction+and+maintenance+of+estradiol+production%2C+response+to+follicle-+stimulating+hormone%2C+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li>
<li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li>
<li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell%2C+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li>
<li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li>
<li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li>
<li>Schneider, F., Brüssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li>
<li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15(2018).</li>
<li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li>
<li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li>
<li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan hücre kültür modeli granulosa hücre farklılaşması içinde vitroanaliz etmek için bir araç sağlar. Çeşitli çalışmalarda serum-Alerjik ekimi kültürlü sığır GC veya diğer türler8,9GC steroid etkinliğini korumak için bir ön koşul olduğunu gösterdi. Ayrıca, hücre dışı matriks (Örneğin, kollajen R)13bileşenleri ile kültür çanak kaplama, ekin hücrelerin belirgin bir biçimde iyileştirilmiş. Bir diğer önemli özelliği uzun süreli kültür dönemdir. Son zamanlarda, uzun vadeli bir kültür yeterli steroidogenic etkinliği ve granulosa hücre kimlik işaretleri17dengeli bir ifade elde etmek gerekli olduğunu kanıtlanmıştır. Görünüşe göre GC yalıtım işlem sırasında fiziksel stresten kurtarmak için zaman gerektirir.
FSH, IGF-1 ve androstenedion aromataz etkinliğinde ikna etmek için bilinen medya takviyeleri GC kültürlü. Özellikle, ile androstenedion takviyesi kesinlikle gereklidir GC olarak bir habercisi estradiol sentezi için gerekir. Bu oldu daha önce11,18 yayınlandı ve bu nedenle, daha fazla çalışmanın sırasında soruşturma değil. Ancak, FSH, IGF-1 ve androstenedion konsantrasyonları bir uyarlaması deneysel diğer set-up için gerekli olabilir.
Burada açıklanan dondurma tekniği yanında yapım onları daha yumurtalık ile değişen kaynağından bağımsız doku kültürü deneyleri organizasyonu geliştirmeye yardımcı olabilir. Önceki test göre dondurma GC fenotip veya steroid kültür üretiminde etkilemez. Ayrıca, işaretleyici transkript kültürlü hücrelerdeki bereket önemli farklılıklar taze izole hücreler bu daha önce dondurma16için tabi ile hazırlanan örnekleri karşılaştırma olmadığını göstermiştir.
Mevcut GC kültür modeli için çok önemli bir parametre yoğunluğu kaplama hücredir. Temsilcisi sonuçlarıtarafından gösterildiği gibi kaplama yoğunluğu artan fizyolojik ve moleküler özellikleri dikkat çekici değişiklikler indüklenen. Çeşitli genler LH stimülasyon vivo içinde4,19tarafından indüklenir değişiklikleri benzeyen belirli bir şekilde düzenlenmiştir. Artan bir hücre yoğunluğu kültürlü sığır GC farklılaşma benzeri işlemler sürebilirim aslında titizlikle bu GC vitro modelde çoğaltır arasında çakışan sonuçları önlemek için dikkate alınması gereken vardır. Bu nedenle, diğer çalışmalar çelişkili sonuçlar için farklı hücre yoğunluğu atfedilen ve daha yakından incelenmesi gerekir.
Açıklanan kültür modeli algılama sınıra yakın reseptör LHCGR transkript bir çoğu burada ortaya LH için olmayan duyarlı olmak. Bu nedenle, hem LH dalgalanma bir simülasyon vivo içinde durum farklılaşma13ikna etmek başarısız oldu. Yine de, bu modeli estradiol aktif GC birincil kültür eğitim için yararlı bir araç sağlar, şu anda özellikle kadar hayır fonksiyonel sığır GC satır yok.
Farklı tedavi protokollerinin steroid üretim ya da GC farklılaşma düzenleyici mekanizmaları çözmeye yardımcı mevcut GC kültür modeli test edilebilir. Gelişim süreçlerinde söz konusu daha fazla, tek etkenler ayrı ayrı analiz edilebilir. Bu nedenle, bu kültür model birçok farklı uygulama için bir temel sağlar.

Farklı somatik foliküler hücre tipleri ince ayarlanmış ve iyi orkestra moleküler değişiklikler başarılı yumurtlama ve luteinization bağlıdır. Bu gelişim süreçleri ayrıntılarını tam olarak henüz anlaşılır değil beri daha fazla açıklama gereklidir. Vivo yaklaşımlar ayrıntılı ve pahalı ve özellikle, folliculogenesis sırasında ortaya çıkan adresi belirli moleküler mekanizmaları için başarısız. Bu nedenle, reductionistic vitro modelleri Ayrıca, hücresel ve moleküler ayrıntıları içgörü sağlamak için ihtiyaç vardır. Farklı çalışmalar Kültür bağlamında vitro fertilizasyon teknikleri1,2,3, Bütün köklerinin açıklar. Araştırmacılar farklılaşma mekanizmalar baktılar olduğundan, birçok çalışma foliküler GC üzerinde odaklanın. Bu hücreler, oosit ile doğrudan ilişkili östrojen üretiminin önemli kaynaklarıdır ve böylece, folliculogenesis ve luteinization4boyunca önemli bir rol oynamaktadır.
GC satırlarının farklı türlerden geliştirilmiştir hücre ölümsüzleştirdi. Bunların çoğu, ancak, yeterli bir steroid hormon üretimi5göstermek değil. Şimdiye kadar sadece bir telefon hattı GC oldu sığır6kurulan ama bu satırı steroidogenic faaliyete çeşitli pasajlar7' den sonra kaybetti. Bu nedenle, steroidogenesis beri ve özellikle de, estradiol üretim GC işlevlerin gerekli bir özelliktir, bu yönleriyle birincil hücre kültür modelleri incelemek için tavsiye edilir. Önceki çalışmalarda önemli estradiol üretim sadece serum serbest kültür koşulları8,9altında üremesini gösterilmiştir. GC başarısız olarak progesteron androstenedion10' a çevirmek için gerekli enzim ifade etmek daha fazla, estradiol sentez habercisi takviyesi başka bir, ön koşuldur. Ayrıca, FSH ve IGF-1 takviyesi vitro sinerjik etkisi aromataz, estradiol sentez11anahtar enzim en iyi duruma getirilmiş bir aktivite saptandı. Mevcut iletişim kuralında, GC kültür model üzerinde önemli bir etkiye sahip diğer önemli faktörler ayrıca açıklanmıştır. Özellikle, yoğunluk kaplama hücre12deneme sonucu üzerinde çok büyük etkileri vardır. Ayrıca, önemli ölçüde GC Fizyoloji kültür engel sığır GC dondurma tekniği oluşturulabilir. Bu teknik hücre kültür iş organizasyonu geliştirmeye ve tercih edilen kaplama yoğunluğu optimize etmek için yardımcı olur.

<table><tbody><tr><td>Ca2+, Mg2+</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td>, <td>orijinal olarak Biochrom AG'den satın alınan ve şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası olan PBS Instamed; Biochrom'un Kat.-No hala var</td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin (10.000 IU / 10.000 &mikro; g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td>, <td>aslen Biochrom AG'den satın alındı ve şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası; Biochrom'un Kat.-No'su hala var</td></tr><tr><td>amfoterisin (250 & mikro; g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td>, <td>aslen Biochrom AG'den satın alındı ve şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası; Biochrom'un Kat.-No'su hala var</td></tr><tr><td>3 mL şırınga (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G iğne</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>fetal buzağı serumu</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>aslen şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası olan Biochrom AG'den satın alındı; Biochrom'un Kat.-Hayır'ı hala var</td></tr><tr><td>kriyo koruma şişeleri (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX hücre dondurma kabı</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>kültür kabı, 24 kuyulu, düz tabanlı</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>kollajen R (% 0,2)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>aslen şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası olan Biochrom AG'den satın alındı; Biochrom'un Kat.-Hayır'ı hala var</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>aslen Biochrom AG'den satın alındı ve şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası; Biochrom'un Kat.-No'su hala var</td></tr><tr><td>sodyum bikarbonat</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>aslen Biochrom AG'den satın alındı ve şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası; Biochrom'un Kat.-No'su hala var</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td>, <td>aslen Biochrom AG'den satın alındı ve şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası; Biochrom'un Kat.-No'su hala var</td></tr><tr>Steril su transferinde çözünmüş<td>sodyum selenit</td><td>Sigma</td><td>S9133</td> steril <td>suda çözülmüş</td></tr> insülin (10 mg / mL<tr><td></td><td></td>) <td>Sigma</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>I0516</td><td>1x PBS'de çözülmüş</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>aslen Biochrom AG'den satın alındı ve şu anda Merck-Millipore Company'nin bir parçası; Biochrom'un Kat.-No hala var</td></tr><tr><td></td><td>FSH Sigma</td><td>F4021</td>, <td>2 & mikro'luk bir stok çözümü kullanmayı tercih ediyoruz; g / mL,% 0.9 NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>içinde seyreltilmiş, 2 & mikro'luk bir stok çözeltisi kullanıyoruz; g / mL, 1 mg / mL BSA</td></tr><tr><td>androstenedion</td><td>Sigma</td><td>46033</td> ile 10 mM HCl ve 1x PBS içinde <td>çözülmüş,% 100 etanol içinde seyreltilmiş 10 mM'lik bir stok çözeltisi kullanıyoruz</td></tr></tbody></table>

birincil sığır granulosa östrojen üreten bir doku kültürü model hücreleri

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Yumurtalık granulosa hücreleri (GC) estradiol sentez önemli kaynağıdır. Preovulatory luteinizan hormon (LH) dalgalanma tarafından indüklenen, hücreleri granulosa ve, özellikle, granulosa hücre katmanı derinden onların morfolojik, fizyolojik ve moleküler özelliklerini değiştirmek ve progesteron üretimi gövde formu luteum gebelik bakımından sorumludur. Hücre kültür modelleri temel düzenleyici mekanizmaları folliculo luteal dönüşüm içinde yer alan eğitim için gerekli araçları vardır. Yalıtım yordam ve köklerinin (< 6 mm) küçük ve orta boyutlu dan bovine GC dondurma sunulan Protokolü odaklanır. Bu teknik ile GC neredeyse saf nüfusu elde edilebilir. Dondurma işlemi büyük ölçüde zaman hücre kültürü yönetiminin bağımsız olarak doğrudan birincil doku (yumurtalık) tedarik kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı sığır GC estradiol aktif durumunu taklit eden bir serum serbest hücre kültür modeli açıklar. Başarılı steroid-aktif hücre kültürü için gerekli olan önemli koşulları boyunca protokolünün ele alınmıştır. Hücreleri kaplama yoğunluğu artan belirli bir tepki bir değişmiş gen ifade profil ve hormon üretimi tarafından belirtildiği şekilde indükler gösterilmiştir. Ayrıca, bu modeli daha da GC farklılaşması üzerine çalışmalar için bir temel oluşturur ve diğer uygulamaları sağlar.

GC fibroblastlar için karşılaştırılabilir bir hücre uzantısı biçimi olarak tipik bir fibroblast benzeri görünüm 1 x 105 hücreleri/iyi göstermek vasıl kaplama ve kümeleri (Şekil 1a ve 1 c) oluşturmak eğilimindedir. Kaplama yoğunluğu tarafından 10 kat artan 1 x 106 hücreler/iyi morfolojisi değişmedi ama daha fazla hücre kümeleri (Şekil 1b ve 1 d, oklar) görülebilir. Zaten gösterildiği gibi bir önceki yayın, kollajen kaplama kültür yemekleri büyük ölçüde hücreleri13eki geliştirilmiş.
İlk dondurma hücre kültürü ile karşılaştırıldığında bu doğrudan taze izole örnekleri kültürlü fizyolojik özellikleri önemli ölçüde değişmedi. Bu Şekil 2 ' de (qPCR tarafından ölçülen) transkript bereket birkaç işaretleyicinin genlerin ne zaman karşılaştırmak kültürlü hücreleri dondurulmuş ya da taze izole havuzlarından türetilmiş farklı değil gösterilir.
Şekil 3 sığır GC normal vs yüksek yoğunluklu kültürlü temsilcisi (RIA tarafından ölçülen) steroid hormon analizi sonuçlarını gösterir. Progesteron üretimi daha yüksek olma eğilimi ise estradiol konsantrasyonunu normal yoğunluk kültüre göre yüksek yoğunluklu kültüründe önemli ölçüde azalır.
Genlerin (qPCR tarafından ölçülen) çeşitli kültürlerde yüksek - vs normal yoğunluk karşılaştırmalı analizi önemli etkisi (Şekil 4) saptandı. CYP19A1anahtar enzim estradiol biyosentezi aromataz yanı sıra gonadotropin reseptör FSHR, kodlama, önemli ölçüde aşağı-düzenlenmiş. Buna ek olarak, RGS2 ve VNN2 genler önemli bir up-regülasyon gösterdi. Bu sonuçlar açıkça hücresel farklılaşma belirli işlemleri yoğunluk kaplama hücre artırarak indüklenir öneririz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Şekil 1: kültürlü sığır granulosa hücreleri normal (sol kapı aynası) ve yüksek hücre yoğunluğu (doğru kapı aynası). 1 x 105 hücreleri/iyi bir yoğunluk kültürlü (a ve c) hücreler tipik bir fibroblast benzeri fenotip görüntülenir. (b ve d) GC büyük hücre kümeleri (oklar) formu eğilimi bir yüksek kaplama yoğunluğuna (1 x 106 hücreler/de) daha sık hücreleri normal yoğunluk (sol panelde) altında karşılaştırıldığında kültürlü. Ölçek çubukları 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Şekil 2: yalıtım hemen sonra ve sonra dondurma kültürlü hücreleri karşılaştırılması. Hücreleri de başına 1 x 105 hücre yoğunluğu, kültürlü. Birkaç işaret transkript gen ekspresyonu değerlendirildi ve kültürlü hücreleri ile veya olmadan bir ilk dondurma arasında hiçbir fark ortaya koymuştur. Kutu çizimi n sayılarının gösterir = 3. İki kuyruklu öğrenci t-testi, p-dahil değerlerdir. Bu rakam tekrar Baufeld ve Vanselow16oluşturulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Şekil 3: Steroid hormon konsantrasyonu granulosa hücrelerinde farklı kaplama yoğunlukları kültürlü. Progesteron (P4) konsantrasyon sadece daha yüksek olma eğilimi ise estradiol (E2) toplama ne zaman GC yüksek hücre yoğunluğu kültürlü önemli ölçüde azalmıştır. Hormon konsantrasyonu farklı hücre sayıları için normalize etmek DNA içeriği için giderilmiştir. Ortalama ve SEM n = 3 gösterilir. p &gt; 0.05, iki kuyruklu öğrenci t-test. Bu rakam Baufeld ve ark. çoğaltılamaz 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Şekil 4: Kültürlü granulosa hücrelerinde fonksiyonel anahtar transkript bolluk bir normal vs yüksek kaplama yoğunluğu. Sığır GC 8 d için serum serbest koşullarda kültürlü belirli bir düzenleme birkaç seçili marker gen saptandı. Kutu çizimi n sayılarının görüntüler 3 bireysel çoğaltır =. p &lt; 0,05, iki kuyruklu öğrenci t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Uzun vadeli bir kültür model sığır granulosa hücre serum-Alerjik koşullar altında açıklanmıştır. Araştırmacılar farklı kaplama yoğunlukları östrojen üretimi ve özellikleri olarak etkileri çeşitli faktörler ve koşulları incelemek bu modeli verir sığır granulosa hücreleri.

Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bu hücre kültürü modeli, estradiol üreten sığır granüloza hücrelerinin özelliklerini in vitro olarak incelememize izin verir, örneğin tiroid faktörleri veya koşulları gibi. Bu protokolün ana avantajı, hücre kültürünün doğrudan doku kaynağından bağımsız olarak çalışmasını sağlayan kriyoprezervasyon tekniğidir. Prosedür, laboratuvarımda bir teknisyen olan Veronica Schreiter tarafından gösterilecek.Hücre izolasyon işlemine başlamadan önce, yüzeydeki kanı çıkarmak için sığır yumurtalıklarını antibiyotik takviyeli 1X PBS'de bir beherde yıkayın. PBS'yi atın ve yumurtalıklar kalan kandan temizlenene kadar yıkamayı üç ila dört kez tekrarlayın. Bir yumurtalığı silmek için %70 etanole batırılmış bir laboratuvar mendili kullanın.Küçük ila orta büyüklükteki folikülleri delmek için 18 gauge iğneli üç mililitrelik bir şırınga kullanın. Ve sonra granüloza hücrelerini içeren foliküler sıvıyı aspire edin. Foliküler sıvıyı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Birkaç folikülü deldikten sonra, iğnenin hücrelerle tıkanmasını önlemek için ara temizlik için şırıngayı ve iğneyi durulamak için bir 1X PBS kullanın. Foliküler sıvı ile mümkün olduğunca fazla hücre elde etmek için folikülleri delerek ve aspire ederek tekrarlayın. RNA, DNA ve protein analizleri için referans numune olarak uygun sayıda taze izole edilmiş GC'yi bir kenara bırakmak için, referans hücrelerin birkaç alikotunu taze 1.5 mililitrelik tüplere yerleştirin.Oda sıcaklığında 12.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peletleri sıvı nitrojen içinde şoktan arındırın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kriyoprezervasyona başlamak için, GC'leri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyerek nazikçe peletleyin.Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve tüm görünür kümeleri çıkarmak için hücre peletini %100 fetal buzağı serumu veya FCS içinde nazikçe yeniden askıya alın. Daha sonra önceden hazırlanmış dondurma ortamının bir hacmini ekleyin, hafifçe karıştırın ve karışımı kriyojenik bir şişeye aktarın. Şişeyi, hızlı donmayı önleyen özel bir dondurma kabına yerleştirin, böylece soğutma hızı dakikada eksi bir santigrat dereceyi geçmez.Ardından kabı eksi 80 santigrat derecede en az dört saat dondurun. Kriyojenik şişedeki hücreleri 37 derecelik bir su banyosunda üç ila dört dakika boyunca hızlı bir şekilde çözün ve hücre süspansiyonunu 10 mililitre nihai hacim elde etmek için hormon takviyesi olmadan 37 derece, önceden ısıtılmış Alpha MEM'e aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 500 kez G'de üç dakika santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve önceden ısıtılmış takviye edilmiş Alpha MEM'i hücre peletine ekleyin ve dikkatlice yeniden askıya alın. GC'leri, kuyu başına 500 mikrolitrelik bir nihai hacimde 24 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve koşul başına en az üç kuyucuk kopyalarını dahil ettiğinizden emin olun. Son olarak, hücreleri sekiz gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 CO2 ile inkübe edin ve ardından hücre analizine devam edin.GC'leri bir kez 10 ila beşinci hücrelerin normal yoğunluğunda kültürledikten sonra, hücreler GC'ler için tipik olan fibroblast benzeri bir fenotip sergiledi. Bir kez 10 ila altıncı kez yüksek kaplama yoğunluğunda kültürlenen hücreler morfolojilerini değiştirmedi, ancak daha sık büyük hücre kümeleri oluşturdu. Hücrelerin bir kez 10 ila beşte bir yoğunlukta kültürlenmesinden sonra, değerlendirilen birkaç belirteç transkriptinin gen ekspresyonu, ilk kriyoprezervasyonu olan veya olmayan kültürlenmiş hücreler arasında hiçbir fark göstermedi.GC'ler yüksek hücre yoğunluğunda kültürlendiğinde, estradiol konsantrasyonu önemli ölçüde azalırken, progesteron konsantrasyonu normal yoğunlukta büyüyen hücrelere kıyasla artmıştır. Sekiz gün boyunca serumsuz koşullar altında kültürlenen sığır GC'leri, QPCR ile ölçüldüğü gibi yüksek ve normal yoğunluklu kültürlerde seçilen birkaç belirteç geninin regülasyonunda önemli bir fark ortaya koydu. Estradiol üreten sığır granüloza hücrelerinin bu hücre kültürü modelini kullanırken, hücre yoğunluğu gibi hücre fizyolojisini etkileyen faktörleri hatırlamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, sığır granüloza hücre farklılaşmasında hangi moleküllerin veya sinyal yolaklarının rol oynadığı gibi sorulara cevap vermek için diğer tedavi protokolleri uygulanabilir. Kriyoprezervasyon tekniği, daha yapılandırılmış ve organize hücre kültürü çalışmalarının önünü açtı ve diğer türlere kolayca aktarılabilir.

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

İnsan meme epitelinin hormon etkisini incelemek için uygun bir 3D kültür modelini tanımlıyoruz.

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

Yumurtalık dokusu kültürler folikül gelişim, yumurtlama ve folikül atrezi modelleri olarak kullanılabilir ve düzenleyici mekanizmaları dinamik yumurtalık işlemleri gösterir.

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Gelişimin erken aşamalarında yumurtalık foliküllerinden büyüyen yumurtaların izolasyonuna yönelik prosedürlerin yanı sıra büyümeyi ve farklılaşmayı tam olarak büyümüş aşamaya kadar desteklendirebilecek bir in vitro kültür sisteminin kurulumunu anlatıyoruz.

Sığırlarda Erken Antral Folikülden Oositler Için Tüp Bebek Kültür Stratejisi

Sığır yumurtalık korteksinin in vitro kültürü ve beslenme Merdiven adım diyetinin yumurtalık mikroçevrişi üzerindeki etkisi sunulmuştur. Yumurtalık korteks parçaları yedi gün boyunca kültürlendi ve steroidler, sitokinler ve folikül evreleri değerlendirildi. Merdiven-Adım diyet tedavisi, kültürde folikül ilerlemesine neden olan steroidogenezi artırmıştı.

Sığır Yumurtalık Korteks Doku Kültürü

Preantral folikülogenez çalışmasının ilerletilmesi, tek yumurtalıklardan folikül izolasyonu için etkili yöntemler gerektirir. Burada bir doku doğrayıcı ve homojenizatör kullanılarak sığır yumurtalıklarından folikül izolasyonu için modernize edilmiş, mekanik bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, tek bir yumurtalıktan çok sayıda canlı preantral folikülün toplanmasına izin verir.

Küçük Preantral Foliküllerin Sığır Yumurtalıktan Parçalanma, Homojenizasyon ve Seri Filtrasyon Kombinasyonu Kullanılarak İzolasyonu

Enteroidler, doku fizyolojisi ve patofizyolojisi, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp çalışmaları için yeni bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, ilgili doku hücresi tipleriyle ko-kültüre izin veren bir sığır birincil hücre 2D enteroid türevi kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu model, gastrointestinal araştırma modellemesi için translasyonel bir avantaj sunar.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Bu makale, sığır teka ve granüloza hücrelerinin bir ko-kültür modelini sunmaktadır. Bu yöntem, folikül içindeki somatik hücreler arasında parakrin iletişim ve substrat taşınması çalışmasına odaklanan analizler için güvenilir bir temel oluşturma potansiyeline sahiptir.

Sığır Yumurtalığındaki Granüloza-Teka Hücre Etkileşimlerini Anlamak için Modifiye Edilmiş Bir Ko-Kültür Sistemi

İlköğretim hepatositler bir fizyolojik ilgili deneysel sistem biyokimyasal, moleküler ve metabolik fonksiyonlarını değerlendirmek için değerli bir araç sağlar. Biz sürekli to1.0 × 10 kadar yaşayabilir hepatositler üretir yerinde karaciğer perfüzyon, sıçan için güvenilir bir protokol...

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Öğrenin sığır granuloza hücrelerinde östrojen üretimini in vitro kültür modeliyle araştırma yöntemlerini. Dondurarak saklama tekniği sayesinde hücre kültürleri uzun süre korunabilir ve doku teminine bağımlı kalmadan çalışılabilir.

Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Daha fazla video keşfet