Name: Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Keşfedin anti-integrin antikorlarının iltihabi bağırsak hastalığında bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışmasına etkisini. Bu yöntem, akış koşullarında hücre yapışması fonksiyonel analizi için kullanışlı bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma CN, IA, MFN ve SZ klinik araştırma (IZKF) ve Erlangen-Nürnberg Üniversitesi, başka Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, Alman Crohn ELAN programı için disiplinlerarası Center tarafından desteklendi ve Kolit Vakfı (DCCV), klinik araştırma grubu CEDER, Alman Araştırma Konseyi (DFG), DFG konu programın Microbiota, ortaya çıkan alan girişimi ve DFG işbirlikçi araştırma merkezleri 643, 796 ve 1181.

Aşağıdaki bölümlerde açıklanan çalışmalar Etik Komitesi Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nürnberg onayı göre gerçekleştirilmiş.
1. kılcal hazırlanması
<ol><li>Dikdörtgen kılcal tüp bir tarafta küçük makasla germe ve dikkatle (yaklaşık 0.5 cm) kılcal tüp içine ekleme tarafından alıpkendi için bağlayın. Kılcal boru plastik parafin film arasındaki bağlantıyı kapatın.</li>
	<li>İsteyebileğinizi (rekombinant Fc chimera; 5 µg/isteyebileğinizi, Örneğin MAdCAM-1, kaplama arabelleği (150 mM NaCl + 1 mM HEPES) mL) veya p20 pipet kullanarak uygun izotip kontrol çözümü 20 µL ile kılcal kat (sıvı emmek kendisi kılcal damar). Sonra yan Boru Plastik parafin film ile bağlı değil mühür ve en az 1 h 37 ° C'de için kuluçkaya Sadece kaplama arabellek veya negatif kontrol olarak uygun izotip kontrol ile dolu bir kılcal kullanın.</li>
	<li>Plastik parafin film kılcal uç--dan kaldırmak için en az 1 h 20 µL çözüm (1 x PBS ile %5 BSA) 37 ° C'de engelleme ile bir kağıt havlu ve blok kılcal üzerinde kılcal dışında sıvı emmek izin vererek kaplama boş Plastik parafin film ile kılcal açık tarafına kapatın. Mikroskopi geçmeden önce engelleme çözüm kaldırmaz.</li>
</ol>2. hücre izolasyon, tedavi ve Mikroskopi için hazırlık
Not: Aşağıdaki adımları sırasında kuluçka dönemleri için kılcal hazırlık gerekli gerçekleştirilebilir.
<ol><li>Sonra yerel düzenlemelere göre bilinçli yazılı onayı ile kişi (Örneğin, IBD hastalar ve/veya sağlıklı kontrol) gönüllü kübital damar küme bir aseptik kan koleksiyon 18 mL anticoagulated tam insan kanı toplamak Etik Komitesi. Not: Bu adımı yalnızca ulusal ve/veya yerel düzenlemelere göre eğitimli ve deneyimli sağlık personeli tarafından gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>50 mL tüp içine kan doldurmak ve 35 mL 1 x PBS ile hacmi oranında seyreltin. O zaman yoğunluk gradient orta 10 mL kan-PBS karışımla altına koymak.</li>
	<li>Yoğunluk gradient Santrifüjü 15dk vasıl 800 x g ve fren ayrı hücreler olmadan 24 ° C için gerçekleştirin.</li>
	<li>Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) yoğunluk gradient orta tabakası (net orta tabaka) tam üstünde beyaz hücre katmanı aspirating tarafından toplamak. PBMCs taze 50 mL tüp içine aktarmak, ilâ 50 mL 1 x PBS ve 300 x g ve 10 ° c de 10 dakika santrifüj ile doldurmak</li>
	<li>Süpernatant atmak, hücre Pelet 10 mL 1 x PBS resuspend ve daha sonra hücre sayıları, odası sayma Neubauer hücre kullanarak Örneğin, saymak.</li>
	<li>İsteğe bağlı: çalışmaya granülosit yapışma gerçekleştirmek aşağıdaki yordamı. Aksi halde adım 2.7 veya 2.8 ile devam edin.
	<ol>
<li>Granülosit katman (yoğunluk gradient Santrifüjü Ayrıca eritrositler içeren sonra alttaki katman) toplamak. 40 mL 1 x PBS hücrelerde resuspend. %6 8 mL ekleyin 1 x PBS, Dextran karışımı yavaşça ve hücreleri tortu, oda sıcaklığında 30 dakika izin. Not: granülosit süspansiyon kalırken eritrositler tüpü dibine batacak.</li>
		<li>30 dk sonra süpernatant toplamak, bir taze 50 mL tüp ve 300 g ve 4 ° c x 6 dk santrifüj içine transfer Süpernatant atmak ve 5 mL %0,2 de ekleyerek kalan eritrositler lyse NaCl GKD2O. Incubate 1 dk için.</li>
		<li>5 mL % 1,4 ekleyin NaCl GKD2O ve başka bir dakikalığına kuluçkaya. Hipotonik lizis 20 mL 1 x PBS ve santrifüj 300 x g de 6 dk ve 4 ° c için ekleyerek durdurmak</li>
		<li>Hücre Pelet 10 mL 1 x PBS resuspend. O zaman, hücre sayıları odası sayma Neubauer hücre kullanarak sayılır.</li>
	</ol></li>
	<li>İsteğe bağlı: PBMC alt kümeleri yapışma çalışmaya, farklı hücre tipleri veya alt kümelerini arındırmak (Örneğin, CD4+ ve CD8+ T hücreleri veya CD19+ B hücreleri) lastikteki üreticinin protokolüne göre veya floresan-harekete geçirmek kullanma sıralama (FACS) hücre. Aksi halde adım 2.8 ile devam edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için 300 g ile 10 ° c x 10 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve üreticinin yönergelerine göre (Örneğin, CFSE) boya izleme hücre içeren hücrelerin leke.</li>
	<li>Daha sonra hücreler için 300 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 1 x PBS resuspend, cep telefonu numarasını ve 300 x g, 10 min için tekrar santrifüj belirleyin.</li>
	<li>Süpernatant atın ve lekeli hücre Pelet yapışma arabellek (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) uygun miktarda 1.5 x 106 hücre/mL süspansiyon elde etmek için resuspend. O zaman, 100 mM MnCl2 1 mM son bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda ekleyin. Not: Bu hücreler artık Mikroskopi için hazırsınız demektir.</li>
	<li>İsteğe bağlı: antikorlar veya diğer bileşikler nötralize sitokinler, hücrelerle tedavi. Aksi durumda, adım 3 ile devam edin.
	<ol>
<li>Adım 2.10 atlarsanız, lekeli hücre Pelet adım 2,9 RPMI orta resuspend (%10 FBS ve % 1 ile penisilin/streptomisin) 1.5 x 106 hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için.</li>
		<li>Bu hücre süspansiyon 1 mL 48-şey plaka kadar kuyu pipet olarak çözümlenmesi için koşullar. Her zaman negatif kontrol olarak kaplanmamış bir kılcal damar yoluyla periosteum tedavi edilmezse hücrelerle bir şey ve tedavi edilmeyen hücrelerin pozitif kontrol olarak isteyebileğinizi kaplı kılcal damar yoluyla periosteum ile bir şey hazırlamak.</li>
		<li>Anti-integrin antikorlar ile tedavisi için antikor (Örneğin, 10 µg/mL vedolizumab) uygun miktarda hücre süspansiyon için ekleyin. 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Sitokinler ile tedavi için hücre süspansiyon rekombinant sitokin (Örneğin, 10 ng/mL CXCL10) uygun miktarda ekleyin. 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya</li>
		<li>Kuluçka sonra birkaç kez p1000 pipet kullanarak hücreleri resuspending tarafından hücre hasat. Hücreler 2 mL tüp içine aktarmak, tekrar 1 mL 1 x PBS ile durulayın ve 2 mL tüp ekleyin. Cep numarasını belirleyin. Not: Ek önlemler yapisan hücre popülasyonlarının (örneğin, monosit) kuluçka gerektirebilir (Örn., tripsin ile tedavi) plaka hücrelerden ayırmak için.</li>
	</ol></li>
	<li>Santrifüj hücreler için 300 x g 10 ° C'de 10 dakika Süpernatant atın ve hücre Pelet yapışma arabellek 1.5 x 106 hücre/mL süspansiyon elde etmek için uygun miktarda resuspend. O zaman, 100 mM MnCl2 1 mM son bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda ekleyin. Kemokinler ile pretreating ne zaman MnCl2 hücre süspansiyon eklemeyin. Bu hücreler Mikroskopi için hazırsınız. Not: tahlil için kullanılan en küçük birim pompa ve boru kullanılan üzerinde bağlıdır. Peristaltik pompa ve boru Malzemeleri tablo, belirtilen kullanarak bu çalışmada 400 µL en küçük bir birim için gerekli oldu. İstenen ve uygulanabilir (hücre tipi ve verim) bağlı olarak, kısa bir süre içinde daha yüksek yapışma ölçmek için süspansiyon hücre konsantrasyonu artırılabilir.</li>
	<li>Olası değişiklik: rekabetçi dinamik yapışma tahlil
	<ol>
<li>Birbirlerine (Örneğin, düzenleyici ve aracılığıyla üretici talimatları adım 2.7 göre manyetik boncuk izolasyon izole efektör T hücreleri) karşılaştırılmak üzere farklı hücre popülasyonlarının ile yukarıda belirtilen adımları uygulayın.</li>
		<li>Her nüfus farklı bir boya (Örneğin, CFSE ve FarRed) mikroskopi sırasında hücre popülasyonlarının ayırt edebilmek için 2.8-2,9 adımda açıklandığı gibi leke.</li>
		<li>Süpernatant atın ve lekeli hücre topakları yapışma arabellek (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) uygun miktarda 1.5 x 106 hücre/mL süspansiyon elde etmek için resuspend.</li>
		<li>Mix (Örneğin, 500 µL düzenleyici T hücreleri) ve 500 µL efektör T hücrelerinin hücre süspansiyonlar eşit miktarda bir final elde etmek için 1.5 x 106 hücre/mL hücre konsantrasyonu karışık. O zaman, 100 mM MnCl2 1 mM son bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda ekleyin. Böyle süspansiyonlar, yapışma süreci rekabet analizi için farklı hücre popülasyonlarının aynı kılcal damar yoluyla ventriküler tarafından daha sonra kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. canlı hücre görüntüleme dinamik yapıştırılması
<ol><li>Mikroskobunun açın ve uygun filtreyi seçin veya dye(s) (Örneğin, 488 CFSE için nm lazer), uygun bir amaç (Örneğin, 40 X) ve satın alma modunu etkinleştirme zamanlı hızlandırılmış görüntü izleme hücre heyecanlandırmak için lazer.</li>
	<li>Plastik parafin film kılcal uç--dan kaldırmak ve kılcal tüp bir tarafta küçük makasla germe ve dikkatle kılcal (yaklaşık 0.5 cm) ekleme (yaklaşık 5 cm uzunlukta) boru kısa bir parçası bağlantı tüpün içine. Kılcal boru plastik parafin film arasındaki bağlantıyı kapatın.</li>
	<li>Kılcal bir fiksasyon tepsi (Örneğin, bir dikdörtgen boşaltma kılcal uzunluğundan daha ile 6-şey plaka kapak) bağlama ve kılcal odak ve hazır olması sabit kılcal mikroskop, tepsi sahibinin yer Mikroskopi için.</li>
	<li>Alıpkendi peristaltik pompa karşılık gelen çentik yerleştirin ve kılcal için hücre süspansiyon içeren göre örnek tüpüne bağlı değil sonuna yerleştirin. Kılcal diğer tarafında kısa tüp akışı aracılığıyla toplamak için 15 mL tüp içine yerleştirin.</li>
	<li>Boru dolgu izin hücre süspansiyon neredeyse kılcal ulaşıncaya kadar dakikada 500 µL bir debi ile. O zaman 100 µL/dak bir debi ile kılcal doldurun izin ver. Not: Bir hızlı kılcal dolduruyor hücre süspansiyon kılcal içinde normal bir dağılım sağlar.</li>
	<li>Kılcal hücre süspansiyon ile dolu debisi 10 µL/dk ayarlanır. Not: farklı bir boyut veya farklı peristaltik pompa kılcal kullanıldığında bu akış oranları değişebilir. Bu çalışmada, 10 µL/dk debisi pompa ve kılcal vivo içinde kan akımı taklit etmek için optimize edildi.</li>
	<li>Zaman atlama çekim yavaş yavaş kılcal isteyebileğinizi kaplı içinde duvar boyunca her 2 hareket hücre s 3 dk toplam. Not: Aralıkları ve toplam süre ele alınması gereken hücre tipi ve soru göre değişiklik gösterebilir.</li>
	<li>Kılcal atılmadan önce bütün kılcal videoda gösterildiği bölüm temsilcisi olduğundan emin olmak için mikroskop göz parçası ekran. Gerekirse, ikinci bir kayıt olun.</li>
	<li>Boru pompadan ücretsiz ve kalan sıvı hemen 2 mL tüp içine o zaman Kılcal boru fiksasyon tepsisinden çıkarıp koşup ile sonraki kılcal devam bildirin.</li>
</ol>4. değerlendirme ve hücre sayımı
<ol><li>Hızlandırılmış sıra uygun yazılım ile açın ve ilk üç görüntüler ("başlangıç") ve ("son") son üç görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarma.</li>
	<li>Açık ImageJ, üç "Başlayan" görüntüleri dönüştürmek için 32 bit ('görüntü | Türü | 32 bit') ve birleştirme resimler (' resim | Renk | Kanalları birleştirme; kırmızı, yeşil ve mavi renkleri atamak için farklı resimler). Bileşik görüntü RGB dönüştürmek (' resim | Type-RGB') ve TIFF dosyası olarak kaydedin. "Son" görüntüleri ile yineleyin. Not: farklı renklerle lekeli hücrelerle rekabetçi dinamik yapışma deneyleri içinde farklı hücre popülasyonlarının yapışma ayrı ayrı analiz etmek için görüntülerin kanalları bölündüğünü.</li>
	<li>Beyaz hücreleri saymak "Başlangıç" ve "Son" bileşik içinde görünür ve "Başlangıç" "sonunda" beyaz hücrelerden beyaz hücre sayısı çıkarın. Not: yeni kalarak sayısını 3 dk zaman aralığında hücreleri farkı temsil eder. Bileşik görüntüde, taşınan hücreleri önceki ve sonraki çerçeve içinde başka bir yere içinde Yerelleştir beri ilgili çerçeveye atamış belirli renk görünür. Yapışık, hücreler için aynı nokta örtüşme beyaz kırmızı, yeşil ve mavi sinyalleri.</li>
	<li>Daha iyi sonuçlar görmek için hızlandırılmış dizilerinden bir video ImageJ kullanarak Örneğin, derleme.</li>
</ol>

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B14%CE%B21+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn%27s+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li>
<li>Binder, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).</li>
<li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23964932">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li>
<li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li>
<li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038247">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li>
<li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li>
<li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%3A+The+Official+Clinical+Practice+Journal+of+the+American+Gastroenterological+Association%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li>
<li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+phase+2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).</li>
<li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MAdCAM+antibody+%28PF-00547659%29+for+ulcerative+colitis+%28TURANDOT%29%3A+a+phase+2+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).</li>
<li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-based+therapeutics%3A+biological+basis%2C+clinical+use+and+new+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).</li>
<li>Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+effects+of+vedolizumab+binding+on+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes.</a> mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B14%CE%B27+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li>
<li>Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+receptor+occupancy+pharmacodynamic+assays+used+in+the+clinical+development+of+the+monoclonal+antibody+vedolizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li>
<li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit%3A+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).</li>
<li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Binding+Specificity+and+Selective+Antagonism+of+Vedolizumab%2C+an+Anti-%CE%B14%CE%B27+Integrin+Therapeutic+Antibody+in+Development+for+Inflammatory+Bowel+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).</li>
<li>Parikh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vedolizumab+for+the+treatment+of+active+ulcerative+colitis%3A+a+randomized+controlled+phase+2+dose-ranging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).</li>
<li>Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+Suppress+CCR9-Mediated+Chemotaxis%2C+Calcium+Flux%2C+and+Adhesion+to+MAdCAM-1+in+Human+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells.</a> The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).</li>
<li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptor+3+promotes+leukocyte+rolling+by+mobilizing+endothelial+P-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+MRP8%2F14+is+a+regulator+of+%CE%B22+integrin-dependent+neutrophil+slow+rolling+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Binder, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li>
<li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li>
<li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li>
<li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
<li>Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+%CE%B1E%CE%B27+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8%28%2B%29+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li>
</ol>

M.F.N., Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda ve Boehringer için bir danışman olarak hizmet vermiştir. M.F.N. ve S.Z. Takeda ve Roche araştırma desteği aldı.

Yukarıdaki Protokolü dinamik adezyonu endotel ligandlar için insan bağışıklık hücrelerinin çalışma için yararlı bir yöntem açıklanır. Kaplamalı ligandlar, periosteum hücre tipleri veya alt kümeleri, kuluçka ek uyaranlara veya farklı nötralize antikorlar ile varyasyon ile neredeyse var sınırsız potansiyel uygulamalar. Bu nedenle, bu tür dinamik yapışma deneyleri temel araştırma hem de geliştirmek ve klinik tedavisi ilaçlarla yapışma işlemine engel optimize etmek için yardımcı olabilir translasyonel sorgular her iki temel ...

Hücre hareket vazgeçilmez geliştirme ve işlevi çok hücreli organizmalar için sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir ama aynı zamanda çok sayıda hastalıkları1patogenezinde karıştığı. Stok yenileme ve genişletme iltihaplı dokulara immunologically aracılı hastalıkları2 patojen hücrelerinin katkıda beri son zamanlarda artan ilgi, periferik dokulara kan akışından bağışıklık hücreleri izleme sürecinin kazanmıştır ,3. Özellikle, posta iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD) translasyonel yakınlık derecesine sahip olduğu gösterilmiştir. Gut posta ile müdahale tedavi anti-α4β7 integrin antikor vedolizumab etkinliği büyük klinik çalışmalarda4,5 ' te gösterilen ve gerçek klinik pratikte6,7 ' başarılı bir şekilde kullanılmıştır , 8. daha fazla bileşikler9,10izleyin muhtemeldir. Benzer şekilde, tedavi anti-α4 integrin antikor, natalizumab, multipl skleroz (MS)11tedavisi için kullanılır.
Ancak, bizim işlevsel izleme süreci genel olarak anlama ve bu tür tedavi antikorların etki mekanizması özellikle hala sınırlı. İyi posta hücre hayvan zinciri ve sağlam tutuklama trans endotel geçiş12,13tarafından takip önde gelen sonraki hücre adezyon ile çalışırken de dahil olmak üzere birkaç adımdan oluşan kuruldu. Yukarıda bahsedilen antikorlar integrinler damar duvarının addressins üzerinde endotel ile etkileşimi engelleyen hücre yüzeyinde etkisiz hale getirin. Bu firma hücre adezyon14,15engel düşünülmektedir. Henüz, biz sadece hücre posta, farklı hücre alt kümeleri için belirli integrinler fark uygunluğunu anlamaya başlıyor. Ayrıca, farklı anti-integrin antikorlar etkisi alt kümeleri hücre ve bir sürü açık soru IBD gut izleme ve anti-yapışma tedaviler alanında önde gelen büyük ölçüde bilinmeyen doz-yanıt ilişkilerdir.
Bu nedenle, bu tür soruları çözmek için uygun araçlar umutsuzca ihtiyaç vardır. Anti-integrin antikorlar etkisi integrin isteyebileğinizi etkileşim defa ağırlıklı olarak bağlama etkinliği/bağlama inhibisyon veya statik yapışma deneyleri16,17 akış sitometresi ile değerlendirilmesi tarafından değerlendirilmiştir ,18,19,20, böylece bariz basitleştirilmesi ve fizyolojik durum sapma ile. Biz son zamanlarda insan addressins hücrelere integrin bağımlı yapışma ve anti-integrin antikorlar altında kesme stres2etkileri çalışmaya dinamik yapışma tahlil kurulmuş. Teknik prensibi daha önce fare hücreleri21,22ile göstermiştir. Burada, bu uyarlanmış ve yukarıda belirtilen çevirim sorulara yönelik olarak geliştirilen, mekanizmaları ile anti-integrin antikorlar vivo içindetedavisinin açılış roman caddeleri için daha iyi anlıyorum.

<table><tbody><tr><td>48 oyuklu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>833,923</td><td></td></tr><tr><td>Yapışma tamponu: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl<alt>2</alt> + 1 mM CaCl<alt>2</alt></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Blokaj çözümü: ddH2O +% 5 BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu albümini (BSA)</td><td></td> <td>A1391,0100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal Damarlar: Dikdörtgen Boro Boru 0,20 mm x 2,00 mm ID, 50 mm uzunluk</td><td>CM Scientific</td><td>3520-050</td><td></td></tr><tr><td>CCL-2, insan</td><td>İmmünoaraçları</td><td>11343384</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Mikro boncuklar, insan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace ve ticaret; CFSE Hücre Proliferasyon Kiti</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (Rotixa 50 RS)</td><td>Hettrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaplama tamponu: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop (TCS SP8)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CXCL-10, insan</td><td>İmmünoaraçları</td><td>11343884</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 500</td><td>Roth</td><td>9219.3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA KE/9 mL Monovette</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şahinleri (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td></td></tr><tr><td>Fc kimera izotip kontrolü</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG</td><td></td></tr><tr><td>Akış Hızları Peristaltik Pompa (LabV1)</td><td>Baoding Shenchen Hassas Pompa Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848-100ML</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IgG İzotip Kontrolü</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31154</td><td></td></tr><tr><td>Hücreler Arası Yapışma Molekülü 1 (ICAM-1) Fc chimera</td><td>R& D Sistemleri</td><td>720-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>LS-Sütunlar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fare IgG izotip kontrolü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-545</td><td></td></tr><tr><td>Mukozal Vasküler Adresin Hücre Adezyon Molekülü 1 (MAdCAM-1) Fc kimera</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>6056-MC</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Natalizumab</td><td>Biogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Sayma odası</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, insan</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-601000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>L 182-10</td>, <td>Mg ve Ca olmadan</td></tr><tr><td>Plastik parafin filmi: Parafilm (PM-996)</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>saflaştırılmış anti-insan CD18</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Orta 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk boru: SC0059T 3 Duraklı LMT-55 Boru, 1,02 mm İç Çap, 406,4 mm uzunluk</td><td>Ismatec</td><td>SC0059</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik</td><td>Pipetler Sarstedt</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Vasküler Hücre Adezyon Molekülü 1 (VCAM-1) Fc chimera</td><td>Biolegend</td><td>553706</td><td></td></tr><tr><td>Vedolizumab (Entyvio)</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut posta bağışıklık hücrelerinin inflamatuvar barsak hastalıkları (IBD) patogenezinde için önemlidir. Integrin bağımlı hücre adezyon addressins için bu süreçte önemli bir adımdır ve tedavi stratejileri ile yapışma müdahale başarıyla kurulmuştur. Anti-α4β7 integrin antikor, vedolizumab, Crohn hastalığı (CD) klinik tedavisi için kullanılır ve ülseratif kolit (UC) ve daha fazla bileşikler takip etmek olasıdır.
Yapışma yordamı ayrıntılarını ve anti-integrin antikorlar eylem mekanizmaları hala bu alanda fonksiyonel araştırma için sınırlı kullanılabilir teknikleri nedeniyle birçok bakımdan pek açık değildir.
Burada, IBD bağlamında insan hücre adezyon akışı koşullar altında fonksiyonel analiz ve anti-integrin tedavilerin etkisi için bir dinamik yapışma tahlil mevcut. Gerçek zamanlı mikroskobik analizi ile ultrathin cam kaplı isteyebileğinizi kılcal damarlar ile birincil insan hücreleri perfüzyon dayanmaktadır. Tahlil iyileştirmeler ve değişiklikler için fırsatlar sunar ve potansiyelleri mekanik keşifler ve çevirim uygulamalar için tutar.

Yöntemi sunulan bu el yazması amacı insan hücre adezyonu endotel duvara vivo içinde süreci yakın olarak işlevsel olarak benzetimini yapmak için hücre adezyon ve müdahaleci antikorların rol değerlendirmek. Bu nedenle, ultrathin kılcal addressins ile kaplı ve perfüzyon pompa kullanarak faiz fluorescently etiketli insan hücreleri ile derin. Canlı hücre addressins için insan hücrelerinin yapışma Imaging kullanarak gerçek zamanlı (Şekil 1) görülebilir.</p...

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Bu yöntem, periferik organlara homing için gerekli bağışıklık hücrelerinin adezyon kaskad ile ilgili temel immünobiyoloji ve inflamatuar barsak hastalığı araştırma anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, akış koşullarında hücre yapışması bağlamında fonksiyonel soruları yanıtlamak için kullanışlı ve basit bir yaklaşım olmasıdır. Bu yöntem inflamatuar barsak hastalıklarında hücre poietik anti-integrin antikorlarının mekanizmasını araştırmak için geliştirilmiş olsa da, diğer inflamatuar hastalık ortamlarında benzer sorunları analiz etmek için değiştirilebilir.Bir tarafta küçük makaslarla bir parça kauçuk boru gererek başlayın ve tüpe yaklaşık 0,5 santimetre lik dikdörtgen bir kılcal damar ın yerleştirilmesine izin verin. Sonra parafin film ile bağlantı mühür. Kap20 mikrolitre ilgi adresleri ile kılcal ve plastik parafin film ile boru bağlı olmayan tarafı mühür en az bir saat kuluçka için 37 santigrat derece.Kuluçka sonunda, plastik parafin film çıkarın ve tüp boşaltmak için bir kağıt havlu üzerine kılcal dışarı ıslatın sıvı sağlar. Daha sonra 37 santigrat derecede en az bir saat boyunca 20 mikrolitre bloklama çözeltisi ile kılcal damarı kesin. Bu kodlanmış proteinlerin işlevselliğini bozabilir gibi kılcal kurumasını önlemek için kaplama çıkardıktan sonra doğrudan kılcal damara tıkanıklık uygulamak çok önemlidir.Kılcal damar lar tıkanırken, 50 mililitrelik bir tüpten 18 mililitre antikoagüle tam insan kanı ekleyin ve kanı PBS ile toplam 35 mililitrelik bir hacimle seyreltin. Kan çözeltisi altında yoğunluk gradyan orta Katman 10 mililitre ve yoğunluk gradyan santrifüj tarafından periferik kan mononükleer kan hücrelerini izole. Ayırma sonunda, yoğunluk gradyan ortamının arabiriminden periferik kan mononükleer hücrelerini 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Ve taze PBS ile 50 mililitreye kadar tüp toplam hacmi getirmek. Santrifüjden sonra, 10 mililitre taze PBS'deki peleti, üreticinin talimatlarına göre uygun bir hücre izleme boyası ile saymak ve lekelemek için yeniden askıya alın. Boyama kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve tam RPMI orta konsantrasyonmililitre başına altı hücre için 1,5 kez 10 pelet resuspend.Sonra 48 kuyu plaka gibi birçok kuyuiçine hücrelerin bir mililitre tohum koşulları vardır. Ve 37 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için uygun kuyulara uygun anti-integrin antikor hacmiekleyin. Daha sonra hücreleri tek tek iki mililitrelik tüplere aktarmadan önce hücreleri birkaç kez yeniden askıya almak için bir P1000 pipet kullanın.Her birini bir mililitre PBS ile yıkın ve yıkamayı uygun iki mililitrelik tüplerde havuzlayın. Sayma sonra, santrifüj ile hücreleri pelet ve mililitre süspansiyonlar başına altıncı hücrelere 1,5 kez on elde etmek için yapışma tampon uygun hacimde hücreleri resuspened. Sonra bir milimolar son konsantrasyoniçin her tüp için manganez klorür uygun hacmi ekleyin.Hücreler hazır olduğunda, mikroskobu açın ve uygun filtreleri ve lazerleri, nesnel ve edinme modunu seçin. Kılcal damar ın ucundan plastik parafin film çıkarın ve kılcal küçük tüp bağlı izin vermek için kauçuk boru beş santimetrelik bir parça germek için makas kullanın. Kılcal damar ve tüp arasındaki bağlantıyı plastik parafin filmile kapatın.Ve kılcal damarı bir sabitleme tepsisine monte edin. Kapiller odak olacak şekilde tepsiyi mikroskobun tepsi tutucuya yerleştirin. Ve peristaltik pompa nın ilgili çentik içine kauçuk boru takın.Tüpün bekar ucunu hücre süspansiyonuna içeren ilk numune tüpüne yerleştirin. Ve kapiller diğer tarafında kısa tüp ekleyin 15 mililitrelik tüp içine akış toplamak için. Hücre süspansiyonu neredeyse kılcal damara ulaşana kadar tüpün dakikada 500 mikrolitre akış hızıyla dolmasına izin verin.Sonra kılcal damar dakikada 100 mikrolitre bir akış hızında doldurmak sağlar. Kılcal damar hücrelerle dolduğunda, akış hızını dakikada 10 mikrolitreye ayarlayın ve toplam üç dakika boyunca her iki saniyede bir, kaplanmış duvarın içindeki adresin iç kısmı boyunca yavaşça hareket eden hücrelerin zaman atlamalı görüntülerini yakalayın. Hücre süspansiyonu kılcal damarın içine ulaştığında, akışta herhangi bir kesinti olmasını önlemek önemlidir, çünkü bu, etkileşimde statik integrin adresine yol açacaktır.Ekranda gözlenen bölümün temsili olduğundan emin olmak için tüm kılcal damarı mikroskop un merceğine atmadan önce. Pompadan tüp serbest ve kalan sıvı iki mililitrelik tüp içine geri çalışmasına izin. Daha sonra kılcal damarı ve tüpü fiksasyon tepsisinden çıkarın ve bir sonraki kılcal damarı az önce gösterildiği gibi görüntüleyin.Zaman atlamalı kayıtları değerlendirmek için, uygun analiz yazılımındaki ilk sırayı açın ve ilk ve son üç görüntüyü TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. ImageJ'deki üç başlangıç görüntüsünü açın ve görüntüleri 32 bit'e dönüştürmek için görüntüyü, yazıyı ve 32 bit'i seçin. Ardından, görüntüleri tek bir görüntüde birleştirmek için görüntü, renk ve birleştirme kanallarını seçin ve tiff dosyası olarak kaydetmek için bileşik görüntüyü RGB'ye dönüştürün.Son üç görüntüyü aynı şekilde dönüştürdükten sonra, bileşik görüntülerin başında ve sonunda görünen beyaz hücreleri sayın. Ve başlangıç görüntüsündeki beyaz hücrelerin sayısını, bitiş görüntüsündeki beyaz hücrelerin sayısından çıkarın. ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 ile kaplanmış ancak insan PBMC'leri ile İzotip Fc chimera ile kaplanmış kılcal damarların perfüzyonu, üç adresten biri mevcut olduğunda belirgin yapışmaya yol açar.Buna karşılık, nötralize antikorlar kullanarak integrin adreslerinin inhibisyonu genellikle iyotip kontrol antikorları eklendiğinde olmayan dinamik yapışma belirgin bir azalmaya yol açar. Ayrıca, cd4 insan T hücrelerinin belirli kemokinler ile tedavisi tedavi edilmeyen insan hücrelerine göre adresinler için artan bir yapışma yol açar. Bu yordamı denerken, çeşitli faktörlerin bu istozda tamamen özetlenemez in vivo dinamik hücre adezyonuna katkıda bulunmak çok önemlidir.Ancak, çok karmaşık sorulara hitap etmek için tsay ayarlamak mümkündür. Hücre türlerinin diferansiyel yapışma davranışı ile ilgili ek soruları ele almak için, farklı hücre izleme boyaları ile etiketlenmiş farklı hücre türleri ile rekabetçi yapışma testleri yapmak da mümkündür. Bu teknik, geliştirildikten sonra inflamatuar barsak hastalıklarının tedavisinde kullanılan veya şu anda geliştirilmekte olan farklı anti-integrin antikorlarının etkilerini keşfetmemizi sağladı.

dynamic-adhesion-assay-for-functional-analysis-anti-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Deneysel modeller inflamatuvar barsak hastalığı patogenezi ile ilişkili karmaşık doğal ve adaptif immün yanıtları incelemek için izin verdiler. Histolojik skorlama, pro-inflamatuar sitokinler ve miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü kullanarak, inflamatuvar barsak hastalığı görülen bu yanıtlar değerlendirmeye başlayabilirsiniz.

İBH DSS-kaynaklı Modeli Bağırsak Enflamasyon incelenmesi

Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

Burada, varsayılan hücre adezyon moleküllerinin içsel yapışkan özelliklerini karakterize etmek için basit, hızlı bir yöntem sunuyoruz.  Bir hücre adezyon molekülünün salgılanan, epitop etiketli ektodomaini, kültür ortamından küçük, düzgün işlevselleştirilmiş boncuklar üzerinde yakalanır.  Bu boncuklar daha sonra basit boncuk agregasyon testlerinde hemen kullanılabilir.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

enflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD) Mevcut tedaviler, hastalığın semptomlarını hafifletmek amaçlamaktadır, ancak ciddi yan etkilere neden olabilir. Böylece, alternatif stratejiler hayvan kolit modellerinde araştırılmaktadır. Burada, klinik IBD işaretleri diyet takviyeleri yararlı etkileri böyle bir kolit modelinde analiz edilmektedir açıklar.

Deneysel Kolit sırasında Bağırsak epitel Bariyer Fonksiyonları Üzerine Ek Beslenme Faydalı Etkileri Analizi

Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Bu çalışmada, floresein-izotiyosiyanat etiketli (FITC) dekstran, hem in vivo hem de plazma ve dışkı örneklerinde bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için farelere oral gavaj yoluyla uygulanmaktadır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu birçok hastalık sürecinde etkilendiğinden, bu doğrudan ve nicel tahlil çeşitli araştırma alanlarında kullanılabilir.

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Ayarlanabilir yoğunluğa sahip RGD ile işlevselleştirilmiş avidin-biyotin bağları kullanılarak tek göç eden trombositlerin görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır ve trombositlerin avidin-biyotin bağını koparmak için yeterli kuvvet ürettiğini ortaya çıkarır.

RGD İşlevselleştirilmiş Avidin-Biotin Bağları Kullanarak Trombosit Migrasyonunu İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Bu protokol, Crohn hastalığı (CD) benzeri ileal inflamasyon ve fibrozun Src homoloji 2 alanı içeren 5'-inositol fosfataz (SHIP) eksikliği olan fare modelinin, CD için yeni terapötikleri test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Crohn Hastalığı Benzeri İleit ve Fibrozisin SHIP Eksikliği Olan Fare Modelinde Terapötik Müdahalelerin Değerlendirilmesi

Keşfedin anti-integrin antikorlarının iltihabi bağırsak hastalığında bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışmasına etkisini. Bu yöntem, akış koşullarında hücre yapışması fonksiyonel analizi için kullanışlı bir yaklaşım sunar.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Daha fazla video keşfet