Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz
20 Eylül 2018
Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.
Bu yöntem, periferik organlara homing için gerekli bağışıklık hücrelerinin adezyon kaskad ile ilgili temel immünobiyoloji ve inflamatuar barsak hastalığı araştırma anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, akış koşullarında hücre yapışması bağlamında fonksiyonel soruları yanıtlamak için kullanışlı ve basit bir yaklaşım olmasıdır. Bu yöntem inflamatuar barsak hastalıklarında hücre poietik anti-integrin antikorlarının mekanizmasını araştırmak için geliştirilmiş olsa da, diğer inflamatuar hastalık ortamlarında benzer sorunları analiz etmek için değiştirilebilir.
Bir tarafta küçük makaslarla bir parça kauçuk boru gererek başlayın ve tüpe yaklaşık 0,5 santimetre lik dikdörtgen bir kılcal damar ın yerleştirilmesine izin verin. Sonra parafin film ile bağlantı mühür. Kap20 mikrolitre ilgi adresleri ile kılcal ve plastik parafin film ile boru bağlı olmayan tarafı mühür en az bir saat kuluçka için 37 santigrat derece.
Kuluçka sonunda, plastik parafin film çıkarın ve tüp boşaltmak için bir kağıt havlu üzerine kılcal dışarı ıslatın sıvı sağlar. Daha sonra 37 santigrat derecede en az bir saat boyunca 20 mikrolitre bloklama çözeltisi ile kılcal damarı kesin. Bu kodlanmış proteinlerin işlevselliğini bozabilir gibi kılcal kurumasını önlemek için kaplama çıkardıktan sonra doğrudan kılcal damara tıkanıklık uygulamak çok önemlidir.
Kılcal damar lar tıkanırken, 50 mililitrelik bir tüpten 18 mililitre antikoagüle tam insan kanı ekleyin ve kanı PBS ile toplam 35 mililitrelik bir hacimle seyreltin. Kan çözeltisi altında yoğunluk gradyan orta Katman 10 mililitre ve yoğunluk gradyan santrifüj tarafından periferik kan mononükleer kan hücrelerini izole. Ayırma sonunda, yoğunluk gradyan ortamının arabiriminden periferik kan mononükleer hücrelerini 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
Ve taze PBS ile 50 mililitreye kadar tüp toplam hacmi getirmek. Santrifüjden sonra, 10 mililitre taze PBS'deki peleti, üreticinin talimatlarına göre uygun bir hücre izleme boyası ile saymak ve lekelemek için yeniden askıya alın. Boyama kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve tam RPMI orta konsantrasyonmililitre başına altı hücre için 1,5 kez 10 pelet resuspend.
Sonra 48 kuyu plaka gibi birçok kuyuiçine hücrelerin bir mililitre tohum koşulları vardır. Ve 37 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için uygun kuyulara uygun anti-integrin antikor hacmiekleyin. Daha sonra hücreleri tek tek iki mililitrelik tüplere aktarmadan önce hücreleri birkaç kez yeniden askıya almak için bir P1000 pipet kullanın.
Her birini bir mililitre PBS ile yıkın ve yıkamayı uygun iki mililitrelik tüplerde havuzlayın. Sayma sonra, santrifüj ile hücreleri pelet ve mililitre süspansiyonlar başına altıncı hücrelere 1,5 kez on elde etmek için yapışma tampon uygun hacimde hücreleri resuspened. Sonra bir milimolar son konsantrasyoniçin her tüp için manganez klorür uygun hacmi ekleyin.
Hücreler hazır olduğunda, mikroskobu açın ve uygun filtreleri ve lazerleri, nesnel ve edinme modunu seçin. Kılcal damar ın ucundan plastik parafin film çıkarın ve kılcal küçük tüp bağlı izin vermek için kauçuk boru beş santimetrelik bir parça germek için makas kullanın. Kılcal damar ve tüp arasındaki bağlantıyı plastik parafin filmile kapatın.
Ve kılcal damarı bir sabitleme tepsisine monte edin. Kapiller odak olacak şekilde tepsiyi mikroskobun tepsi tutucuya yerleştirin. Ve peristaltik pompa nın ilgili çentik içine kauçuk boru takın.
Tüpün bekar ucunu hücre süspansiyonuna içeren ilk numune tüpüne yerleştirin. Ve kapiller diğer tarafında kısa tüp ekleyin 15 mililitrelik tüp içine akış toplamak için. Hücre süspansiyonu neredeyse kılcal damara ulaşana kadar tüpün dakikada 500 mikrolitre akış hızıyla dolmasına izin verin.
Sonra kılcal damar dakikada 100 mikrolitre bir akış hızında doldurmak sağlar. Kılcal damar hücrelerle dolduğunda, akış hızını dakikada 10 mikrolitreye ayarlayın ve toplam üç dakika boyunca her iki saniyede bir, kaplanmış duvarın içindeki adresin iç kısmı boyunca yavaşça hareket eden hücrelerin zaman atlamalı görüntülerini yakalayın. Hücre süspansiyonu kılcal damarın içine ulaştığında, akışta herhangi bir kesinti olmasını önlemek önemlidir, çünkü bu, etkileşimde statik integrin adresine yol açacaktır.
Ekranda gözlenen bölümün temsili olduğundan emin olmak için tüm kılcal damarı mikroskop un merceğine atmadan önce. Pompadan tüp serbest ve kalan sıvı iki mililitrelik tüp içine geri çalışmasına izin. Daha sonra kılcal damarı ve tüpü fiksasyon tepsisinden çıkarın ve bir sonraki kılcal damarı az önce gösterildiği gibi görüntüleyin.
Zaman atlamalı kayıtları değerlendirmek için, uygun analiz yazılımındaki ilk sırayı açın ve ilk ve son üç görüntüyü TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. ImageJ'deki üç başlangıç görüntüsünü açın ve görüntüleri 32 bit'e dönüştürmek için görüntüyü, yazıyı ve 32 bit'i seçin. Ardından, görüntüleri tek bir görüntüde birleştirmek için görüntü, renk ve birleştirme kanallarını seçin ve tiff dosyası olarak kaydetmek için bileşik görüntüyü RGB'ye dönüştürün.
Son üç görüntüyü aynı şekilde dönüştürdükten sonra, bileşik görüntülerin başında ve sonunda görünen beyaz hücreleri sayın. Ve başlangıç görüntüsündeki beyaz hücrelerin sayısını, bitiş görüntüsündeki beyaz hücrelerin sayısından çıkarın. ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 ile kaplanmış ancak insan PBMC'leri ile İzotip Fc chimera ile kaplanmış kılcal damarların perfüzyonu, üç adresten biri mevcut olduğunda belirgin yapışmaya yol açar.
Buna karşılık, nötralize antikorlar kullanarak integrin adreslerinin inhibisyonu genellikle iyotip kontrol antikorları eklendiğinde olmayan dinamik yapışma belirgin bir azalmaya yol açar. Ayrıca, cd4 insan T hücrelerinin belirli kemokinler ile tedavisi tedavi edilmeyen insan hücrelerine göre adresinler için artan bir yapışma yol açar. Bu yordamı denerken, çeşitli faktörlerin bu istozda tamamen özetlenemez in vivo dinamik hücre adezyonuna katkıda bulunmak çok önemlidir.
Ancak, çok karmaşık sorulara hitap etmek için tsay ayarlamak mümkündür. Hücre türlerinin diferansiyel yapışma davranışı ile ilgili ek soruları ele almak için, farklı hücre izleme boyaları ile etiketlenmiş farklı hücre türleri ile rekabetçi yapışma testleri yapmak da mümkündür. Bu teknik, geliştirildikten sonra inflamatuar barsak hastalıklarının tedavisinde kullanılan veya şu anda geliştirilmekte olan farklı anti-integrin antikorlarının etkilerini keşfetmemizi sağladı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, bağırsak yuvalaması için kritik olan bağışıklık hücrelerinin damar duvarlarına dinamik yapışmasını analiz etmek için fonksiyonel bir in vitro test protokolü sunar. Yöntem, akış koşullarında insan hücre yapışması üzerinde anti-integrin antikorları, kemokinler ve diğer faktörlerin etkisini analiz etmeyi sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünobiyoloji
- Enflamatuar bağırsak hastalığı araştırması
- Hücre yapışma mekanizmaları
Arka Plan
- Dinamik yapışma, bağışıklık hücrelerinin yuvalanması için gereklidir.
- Bu yöntem, immünobiyolojideki önemli soruları ele alır.
- Çeşitli enflamatuar hastalık ortamları için uyarlanabilir.
- Yapışma kaskadını anlamak, tedavi stratejileri için hayati önem taşır.
Çalışmanın Amacı
- Anti-integrin antikorlarının hücre yapışması üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Fonksiyonel analiz için basit bir yaklaşım sağlamak.
- Akış koşullarında bağışıklık hücre davranışları üzerinde araştırma yapmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kapiller yerleştirimi için lastik boruları germek.
- Kapillerleri adresinlerle kaplayın.
- 37 derece Celsius'ta inkübasyon.
- Bağlantıları parafin filmi ile kapatma.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, hücre yapışma dinamiklerini etkili bir şekilde analiz eder.
- Kemokinler ve antikorların rolüne dair içgörüler sağlar.
- Sonuçlar, enflamatuar hastalıklar için tedavi yaklaşımlarını bilgilendirebilir.
Sonuçlar
- Bu teknik, immünobiyolojide araştırma için değerli bir araçtır.
- Çeşitli enflamatuar durumlar için değiştirilebilir.
- Yapışma mekanizmalarını anlamak, daha iyi tedavilere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Functional analysis of immune cell adhesion under flow conditions is critical for evaluating anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease. This dynamic adhesion assay provides a physiologically relevant system to assess target engagement and mechanism of action for integrin inhibitors. It supports early-stage de-risking by enabling quantitative comparison of therapeutic candidates before in vivo testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of integrin-dependent adhesion mechanisms under shear stress to validate target relevance in IBD pathogenesis.
- Operational Value: Provides a reproducible readout for functional screening of anti-integrin antibodies like vedolizumab and emerging candidates.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking antibody treatment to reduced adhesion under defined flow conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative adhesion metrics by comparing cell counts before and after perfusion through addressin-coated capillaries.
- Operational Value: Uses standardized perfusion parameters (10 µL/min flow rate, 3-minute capture) to ensure reproducible dynamic adhesion measurements.
- Assay Readiness: Compatible with multiplexing via competitive adhesion assays using differentially labeled cell types to compare therapeutic effects.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human immune cell homing dynamics using primary PBMCs and physiologically relevant addressins (ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1).
- Translational Continuity: Bridges in vitro target modulation with ex vivo functional outcomes predictive of tissue-specific immune cell recruitment.
- Preclinical Utility: Enables dose-response analysis of neutralizing antibodies to inform lead optimization and biomarker strategy.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional adhesion data that informs go/no-go decisions for anti-adhesion candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of integrin blockade effects on cell adhesion under flow, clarifying mechanism of action for therapeutic antibodies.
- Screening: Delivers quantitative, perfusion-based adhesion outputs that enable comparison across antibody candidates and chemokine-modulated conditions.
- Analytics: Employs time-lapse imaging and cell counting to generate subtractive adhesion scores (ending minus starting cell count) as a functional endpoint.
- Translational Research: Uses human PBMCs and disease-relevant addressins to enhance predictive confidence for IBD-specific immune cell trafficking.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other inflammatory disease models and cell types, supporting platform reuse across immunology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in anti-integrin antibody function by providing direct, real-time visualization of adhesion inhibition.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, perfusion, and imaging steps to improve reproducibility across laboratories and projects.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by validating functional target engagement before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of adhesion-modulating therapeutics based on quantitative, mechanism-linked functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, perfusion microscopy, and time-lapse image analysis for accurate adhesion quantification.
- Depends on specialized instrumentation including microscopes with flow chambers, peristaltic pumps, and environmental control at 37°C.
- Necessitates standardization of addressin coating, blocking, and perfusion protocols to minimize variability in adhesion readouts.
- Must account for physiological complexity limitations; the assay simplifies in vivo adhesion cascades and may not capture all contributing factors.
- Adaptation to alternative cell types or addressins requires re-optimization of cell concentration, flow rates, and incubation times.
