Name: Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Öğrenin, insan çok yönlü kök hücrelerinden elde edilen retinal pigment epitel hücreleri kullanarak, amniyon membran üzerinde retina dokusu mühendisliği yapmayı. Bu yöntem, retinal hastalıklar için doku nakli ve tedavi uygulamaları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Jérôme Larghero ve Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Fransa) ayarlama sırasında burada açıklanan yöntemin kendi giriş için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser ANR gelen hibe tarafından desteklenen [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [biyo-mühendislik programı - DBS20140930777] ve LABEX [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau ve Christelle Monville canlandırmak. O NeurATRIS, pluripotent için mühendislik translasyonel araştırma için bir altyapı (Investissements d'Avenir) biotherapies sinir [ANR-11-INBS-0011] ve INGESTEM, Ulusal altyapı (Investissements d'Avenir) tarafından desteklenen ve Christelle Monville için farklı kök hücre [ANR-11-INBS-000]. Karim Ben M'Barek DIM Stempole ve LABEX canlandırmak [ANR-10-LABX-73] arkadaş grupları tarafından desteklenmiştir. Kök Biotherapies Enstitüsü Nadir Hastalıklar Derneği Française contre les Myopathies (AFM) tarafından desteklenen bir parçasıdır-Téléthon.

Bu protokol için kullanılan tüm insan malzemelerin Avrupa Birliği yönetmeliklerine uygun olarak kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan insan ES hücre hattı benzersiz bir embriyo elde edildi. Embriyo hibe çift tam bilgi verildi ve isimsiz bir bağış için onların onayını verdi. Bir klinik-grade insan ES hücre kültürünü Bu embriyo türetilmiş, banked, nitelikli ve düzgün Roslin hücreleri (İngiltere) tarafından belgelenmiş. Jambon steril koşullarda plasenta bağış hastane yönergelere (APHP, Hôpital Saint Louis) için bir onay imzalayan annelerinde sezaryen sırasında tedarik.
1. hazırlanması Kültür Medya ve Kimyasalları
<ol><li>
RPE hücre kültür orta hazırlanması
	<ol>
<li>RPE hücre kültür ortamı hazırlamak için % 4 serum yedek (için son hacmi 500 mL 20 mL), 1000 x seyreltilmiş 2-mercaptoethanol (500 mL son hacmi için 500 µL) ve % 1 ' Eagle′s en az gerekli Orta (MEM) non-gerekli amino asitler çözüm (5 mL bir final için ekleyin 500 mL hacmi) Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) yüksek glikoz (475 mL 500 mL nihai bir birim için) için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Taşıma/koruma orta hazırlanması
	<ol>
<li>Taşıma/koruma orta hazırlamak, penisilin-streptomisin (için son hacmi 500 mL 5 mL) % 1'i CO2' ye ekleyin-bağımsız Orta (500 mL son hacmi için 495 mL) ve 4 ° C'de tutmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Resuspension thermolysin enzim
	<ol>
<li>Thermolysin stok çözeltisi hazırlanması<ol>
<li>Thermolysin stok çözeltisi hazırlamak için oda sıcaklığında-20 ° C'de depolanan thermolysin toz çözülme.</li>
			<li>Enzimatik aktivite değişken toplu iş toplu gibi kullanılacak toplu iş thermolysin tozu ile sağlanan analiz belgesi dayalı bu etkinliği hesaplayın. Bölmek "etkinliği tarafsız proteaz hesaplanan ANPC =" (analiz sertifika gösterilir) (Tirozin'ın molekül ağırlığı olan) 181 tarafından. Elde edilen sonuç sağlanan thermolysin toz (U/flakon) Toplam enzimatik aktivite için karşılık gelir.</li>
			<li>200 U/mL stok bir çözüme 200 (U/mL) tarafından ayrılmış toplam enzimatik aktivite (U/flakon) karşılık gelen su hacmi ekleyerek hazırlayın.</li>
			<li>Enzim yukarı ve aşağı eklendi su pipetting tarafından çözülür. Girdap 30 s ve onay için çözüm olup toz tamamen askıya alındı. Daha fazla pipetting için tam bir çözünme gerekli olabilir.</li>
			<li>Aliquot hisse senedi çözüm ve -20 ° C'de saklayın</li>
		</ol>
</li>
		<li>Thermolysin çalışan bir çözüm hazırlanması Not: Thermolysin çözüm jambon tedavi günü hazırlanmalıdır.<ol>
<li>Thermolysin 200 U/mL-20 ° C'de depolanan, hisse senedi aliquots tezcan Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hisse senedi çözüm 200 x 1 U/ml nihai bir enzimatik aktivite elde etmek için oranında seyreltin. 1 – 4 jambon yamalar tedavi etmek için 40 mL hazırlayın.</li>
			<li>Thermolysin çözüm kullanmadan 0.2 µm filtre önce aracılığıyla filtre.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Resuspension jelatin
	<ol>
<li>% 20 jelatin çözüm ve blok hazırlanması Not: % 20 jelatin çözüm ve blok kadar kullanmadan önce 1 hafta hazır.<ol>
<li>CO2sıcak-42 ° c su banyosu (1 s) en fazla 30 dakika içinde bağımsız orta. 50 mL tüp içinde 10 g jelatin için 40 mL sıcak CO2eklemek-bağımsız orta ve girdap çözüm.</li>
			<li>30-60 dk 42 ° C'de jelatin dağıtılması Girdap çözüm homojenize her 10 min.</li>
			<li>Bir kez homojen bir çözümdür, dört 6 cm kültür yemekleri için 4 mL % 20 jelatin çözeltisi ekleyin. Bubbles kaçınmak. Bulaşıkları korumak için bir plastik parafin film ekleyin ve 4 ° C'de kuvvetlendirmek çözüm sağlar</li>
		</ol>
</li>
		<li>%8 jelatin çözelti hazırlanması Not: % 8 jelatin çözüm gün kullanmadan önce hazırlanacak ve 4 ° C'de depolanan<ol>
<li>CO2sıcak-42 ° c (1 s) en fazla 30 dk için bağımsız orta. Bir 50 mL tüp 4 g jelatin için 46 mL sıcak CO2eklemek-bağımsız orta ve girdap çözüm.</li>
			<li>30-60 dk 42 ° C'de jelatin dağıtılması Tüp korumak ve aynı gün kullanılmak üzere ise 37 ° C'de bir su banyosunda sağlamak için bir plastik parafin film eklemek veya daha sonra kullanılmak üzere ise 4 ° C'de saklayabilirsiniz.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Thermolysin tedavisi insan amniyotik membran
<ol><li>
İnsan amniyotik membran yıkama
	<ol>
<li>Bir naylon iskele, ya zaten PBS 4 ° C'de sabit veya dondurulmuş küçük parçalar (yaklaşık 30 mm x 30 mm) sağlanan jambon var. Eğer dondurulmuş, membranlar bir kuluçka için 30 dk 37 ° C'de erimek.</li>
		<li>Membranlar yıkama:<ol>
<li>1 – 4 membranlar PBS 80 mL içeren bir 250 mL şişe yerleştirin. Çok sayıda şişe gerektiği gibi kullanın.</li>
			<li>Her şişe 5 min için yüksek hızda bir plaka shaker sallamayın, sonra PBS atmak. PBS ve tekrar 80 mL ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thermolysin tedavi
	<ol>
<li>40 mL thermolysin (1 U/mL) membranlar içeren şişe başına çalışma çözeltisi ekleyin (1 – 4 membranlar şişe; başına bir seferde 3 şişe).</li>
		<li>450 d/d, sonra girdap 5 min için şişe sallamak için 30 onları s. 1 x tekrarlayın.</li>
		<li>Thermolysin çözüm atın ve PBS 80 mL ekleyin.</li>
		<li>450 rpm'de 5 min için şişe sallamak. PBS atın ve PBS 80 mL ekleyin. 3 x tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bir kültür Ekle insan amniyotik membran fiksasyonu
<ol><li>(Bu şişenin dibinde ulaşabilirsiniz) kadar steril forseps hAMs tek tek kaldırmak için kullanın ve her jambon PBS 10 mL içeren 10 cm kültür çanak transfer.</li>
	<li>PBS 10 mL içeren yeni bir 10 cm kültür tabak içinde Membranlar ile naylon aşağı bakacak şekilde yerleştirin. İki membran naylon için düzeltmek için kullanılan dört klip bağlantısını kesin.</li>
	<li>Naylon ve membran arasında kültür ucun daha küçük yüzüğü takın.</li>
	<li>Membran daha küçük halka tamamen kapsadığından emin olun. Kültür Ekle membran üstüne ikinci bölümü küçük. Jambon membran içinde kültür Ekle karşıya. Son iki klibin bağlantısını kesin.</li>
	<li>Kesim, steril makasla, membran dışında kültür Ekle gerekirse fazlalığı. Forseps kullanarak, bir 12-şey plakasına kültür eklemek içinde sabit membran transfer PBS ekleyin ve bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2plaka saklayın.</li>
	<li>Diğer membranlar (Kimden adım 3.2-3,5) bu işlemleri tekrarlayın.</li>
</ol>4. çözülme ve Retina Pigment epitel hücre insan amniyotik membran üzerinde tohum
<ol><li>
Retina pigment epiteli hücrelerinin çözdürme
	<ol>
<li>RPE hücre banka kriyojenik şişe başına 1 milyon hücre, sıvı nitrojen içinde donmuş. Gerektiği gibi çok sayıda kriyojenik şişeleri çözülme (membran 350.000 hücreleri numaralı seribaşı).</li>
		<li>RPE orta kriyojenik şişe başına 3 mL içeren bir 15 mL Tüp hazırlayın. Sonra şişeyi çözdürülen, hücreleri her tüpün aktarın. Diğer şişeleri için bu işlemi yineleyin.</li>
		<li>Homojenize (yukarı ve aşağı birkaç kez-pipet RPE orta hücrelerde resuspend) ve hücre çözümü 10 µL alıp 1,5 mL tüp aktarmak. Trypan mavi, 10 µL ekleyin. Bu çözümün bir sayım odasında yer 15 µL sonra hücrelerin sayısı (mavi renkli değil) uygun bir 4 X amacı ile mikroskop altında saymak. Diğer şişeleri için bu işlemi yineleyin.</li>
		<li>Bu arada, 110 x g 5 dk. atmak için de 15 mL tüpler süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücreleri 700.000 hücre/mL, resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Retina pigment epiteli hücrelerinin insan amniyotik membran tohumlama
	<ol>
<li>Üzerinden kuluçka makinesi membranların içeren 12-şey plaka kaldırın.</li>
		<li>PBS Aspire edin. Adım 4.1.4 kültür Ekle ortasına hazırlanan hücre süspansiyon 500 µL ekleyin. RPE orta kültür Ekle (içinde de) dışında 1 mL ekleyin. Diğer membran için yineleyin.</li>
		<li>Kuluçka makinesi membranların içeren 12-şey tabak koyun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. bakım Retina Pigment epitel hücre kültürlerinde insan amniyotik membran üzerinde
<ol><li>Orta 2 yenilemek hafta, genellikle Pazartesi ve Cuma, en az kadar her gün 30 kültür.</li>
	<li>İçinde ve dışında kültür ekleme her şey için orta Aspire edin ve taze Orta (1 mL kültür Ekle dışında ve içinde 500 µL) ile yenilemek. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2tabak koyun.</li>
</ol>6. nakli için Retina Pigment epiteli yama hazırlanması
Not: kültür 30 gün başlayarak, doku nakli için hazırdır.
<ol><li>Sıcak su banyosu 30 dk. 37 ° C'de % 8 jelatin çözümde doldurmak vibratome soğuk CO2iç TMMOB-bağımsız Orta (4 ° C'de).</li>
	<li>
% 20 jelatin blok vibratome yerleştirin.
	<ol>
<li>% 20 jelatin buzdolabından bloğunu içeren 6 cm kültür yemek al. Bir neşter kullanılarak, bir 5 cm x 5 cm blok kesme. Cyanoacrylate tutkal veya eşdeğeri ile çekmek için blok üst kısmı yapıştırın.</li>
		<li>Yeni bir bıçak vibratome yerleştirin.</li>
		<li>Jilet aynı düzeyine gelinceye blok düzeyini ayarlayın.</li>
		<li>Banyo destek etrafında taze CO2ile doldurun-4 ° C'de bağımsız orta Blok blok düzgün kesilmiş kadar orta hızlı kullanarak, pürüzsüz bir yüzey için önde gelen vibratome ile kesti. 0 konumunu belirleyin.</li>
		<li>Kadar tamamen kuru orta jelatin blok etrafında Aspire edin ve 37 ° C'de kuluçka makinesi dokulardan içeren 12-şey kültür plaka almak</li>
		<li>Forseps kullanarak kültür Ekle jelatin blok üzerine dikkatlice açın. Kesim, makas ile tüm hücreleri (dışında nerede hücreleri değil kültürlü halka) içermez ve membranlar parçaları. Tüm kalan orta Aspire edin.</li>
		<li>Membran kapak için 37 ° C'de 1 mL sıvı % 8 jelatin çözeltisi ekleyin. Aşırı dikkatli bir şekilde çıkarın. 5-8 dakika jelatin kuvvetlendirmek izin vermek için bekleyin.</li>
		<li>Taze CO2ekleyin-bağımsız Orta (4 ° C'de) ve banyo membran kaplı kadar.</li>
		<li>Kesim, vibratome bir pozisyonda blok çalışma şeklini farkında kalan bir orta hızlı ile-100 µm ile. Bölümünün sonunda doku yönünü korumak için dikkatli olun.</li>
		<li>Bir neşter ile bölüm yönünü belirlemek için bir köşe kesti.</li>
		<li>İçinde jelatin bir spatula ile gömülü membran toplamak ve alıcı göz içine aşılama kadar koruma orta 4 ° C'de dolu bir 6-şey plaka yerleştirebilirsiniz.</li>
		<li>Nakli zamanda, implantın cerrahi mikroskop (1-3 için rats, insan dışı primatlar için 10-15 mm2 ) altında alıcı göz büyüklüğüne boyutunu ayarlamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17101537">Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts.</a> Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).</li>
<li>Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+a+multifactorial+late-onset+disease%3A+from+genetic+susceptibility+to+disease+mechanisms+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).</li>
<li>Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).</li>
<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li>
<li>Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+pluripotent+stem+cells+to+study+and+treat+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).</li>
<li>Ben M'Barek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC-derived+retinal+epithelial+cell+sheets+potentiate+rescue+of+photoreceptor+cell+loss+in+rats+with+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration.</a> Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+Follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).</li>
<li>Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cell+monolayers+have+higher+resistance+to+oxidative+stress-induced+cell+death+than+nonpolarized+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).</li>
<li>Diniz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li>
<li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li>
<li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li>
<li>Thomas, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+functionality+of+hESC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+cultured+as+a+monolayer+on+polymer+substrates+transplanted+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).</li>
<li>Borooah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+treat+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).</li>
<li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Making+stem+cells+retinal%3A+Methods+for+deriving+retinal+pigment+epithelium+and+implications+for+patients+with+ocular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Lustremant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+tool+to+model+a+form+of+Leber+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis.</a> Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+Cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-directed%2C+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+stem+cells+grown+into+polarized+RPE+monolayers+on+a+polyester+matrix+are+maintained+after+grafting+into+rabbit+subretinal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).</li>
<li>Ilmarinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+polyimide+membrane+as+cell+carrier+for+subretinal+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell+derived+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium.</a> PloS One. 10 (11), e0143669(2015).</li>
<li>Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descemet%27s+membrane+as+membranous+support+in+RPE%2FIPE+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation.</a> Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).</li>
<li>Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+amniotic+membrane+to+the+subretinal+space+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs.</a> Stem Cells International. 2012, 716968(2012).</li>
<li>Capeans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+as+support+for+human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).</li>
<li>Ohno-Matsui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+amniotic+membrane+on+retinal+pigment+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation.</a> Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).</li>
<li>Paolin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membranes+in+ophthalmology%3A+long+term+data+on+transplantation+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes.</a> Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+therapies+in+combination+with+substrate+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%3A+The+Official+Journal+of+the+Association%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).</li>
<li>Song, M. J., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+into+the+future%3A+Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+build+two+and+three+dimensional+ocular+tissue+for+cell+therapy+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling.</a> Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).</li>
<li>Ramsden, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+Past%2C+present+and+future%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future).</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li>
<li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced%2C+dry+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).</li>
<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+the+RPE+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of the RPE in AMD.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).</li>
<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li>
<li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li>
</ol>

Olivier Goureau Retina hücreleri üretimi için insan pluripotent kök hücre ile ilgili patent bekleyen üzerinde mucit biridir. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.

Biyolojik bir iskele ve onun hazırlanması için implantasyon hayvan modellerinde RPE hücrelerinin kültürü için bir yöntem nitelendirdi. Bakım prosedürü boyunca jambon yönünün jelatin içine onun dahil kadar Protokolü'nün önemli adımlardan biri. Nitekim, membran yerli epitel kaldırılır ve onun membran maruz kalan9olur. RPE hücrelerinin üstünde tepe-in bu membran seribaşı zorunda. Jelatin katıştırma için hazırlık, tanımlanmış sıcaklığında iş ile tüm ürün çok önemlidir. Gerçekten de, jelatin özelliğini...

RPE çok hayatta kalma ve sıkı bir şekilde ilişkili1olduğu photoreceptors homeostazı için önemlidir. Birkaç patolojik koşulları, işlevsellik ve/veya hayatta kalma, RP ve AMD gibi değişiklikler.
RP photoreceptors veya RPE hücrelerinin ya da her ikisi2,3fonksiyonları etkiler devralınan monogenic mutasyonlar oluşan bir gruptur. Bu etkiler özellikle RPE mutasyonlar RP2%5 için hesap hücreleri tahmin edilmektedir. AMD nerede RPE katman değiştirilmez, başka bir lider sonuçta için merkezi görme kaybı durumdur. AMD tarafından genetik ve çevresel faktörlerin karmaşık etkileşimlerin neden olur ve yaşlı4,5,6etkiler. Projeksiyonlar göre AMD için 196 milyon hasta 20207tarafından Dünya çapında bir endişe olacaktır. Bu bozuklukları için etkili tedavisi yoktur var, ve bir teklif stratejileri yeni RPE hücrelerinin nakli ölü/işlevsiz önceden varolan RPE hücrelerinin8için telafi etmek için.
Aşılı için nihai ürün formülasyonu modu en iyi fonksiyonel sonuçları sağlamak için önemlidir. Teslimat, kolay ve basit bir yöntem olmasına rağmen bir hücre süspansiyon olarak enjekte RPE hücrelerinin endişeleri ile ilgili olarak onların hayatta kalma, tümleştirme ve işlevsellik9,10,11,12 yükseltmek , 13. bilim adamları artık daha fazla gelişmekte teslim etmek için karmaşık formülasyonları mühendislik Retina doku9,13,14,15,16. Bu bağlamda, ekimi9için kullanılabilir vitro RPE doku oluşturmak için özgün bir yöntem geliştirdik.
RPE hücre bankalar (ES) insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş bu protokol için kullanılır. Ancak, alternatif RPE hücre bankalar farklı hücre kaynaklarından (insan kaynaklı pluripotent kök hücreler, birincil RPE hücrelerinin, vb) ve farklı bir yöntem ile Ayrıştırılan bu iletişim kuralı için uygundur. Yönlendirilmiş farklılaşma içermektedir sitokinler ve/veya küçük moleküller17,18,19,20,21,22kullanarak iletişim kuralları.
Nakledilecek, mühendislik doku üzerinde bir iskele hazırlanmalıdır. Son birkaç yıl içinde farklı iskele tabanlı bir polimer veya bir matris biyolojik kökenli13,23,24geliştirilmiştir. Burada, kullanılan biyolojik substrat jambon olmakla beraber denuded Bruch zarı gibi diğer yüzeylerde uygulanabilir. Burada açıklanan yöntemi daha RPE yerel ortam ile ilgili biyolojik bir iskele kullanmanın avantajı vardır.
İnsan ES Hücre kaynaklı RPE hücrelerinin en az 4 hafta için tam bir Arnavut kaldırımlı monolayer düzenlenmesi amacıyla kültürlü. Bu aşamada elde edilen epitel işlevseldir ve9polarize. Son olarak, bu doku kolayca kırışıklıkları gibi daha fazla sertlik ve esneklik vermek için ve enjeksiyon işlemi sırasında korumak için hidrojel taşıyıcı ince bir tabaka, gömülüdür. Bu ürün sonra aşılama kadar 4 ° C'de depolanır.

<table><tbody><tr><td>Steril biyogüvenlik kabini</td><td>TechGen International</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Aspirasyon için sıvı atık bertaraf sistemi</td><td>Vacuubrand</td><td>BVC 21</td><td></td></tr><tr><td>CO2 kontrollü +37&nbsp; &deg; C hücreli inkübatör</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>BVC 21 NT</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &mikro; L pipet: P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; mL pipet: P1000</td><td>Gilson</td><td>F144566</td><td></td></tr><tr><td>Pipet yardımcısı</td><td>Drummond</td><td>75001</td><td></td></tr><tr><td>+4&nbsp; &deg; C buzdolabı</td><td>Liebherr</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>WPI</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Forseps (x2)</td><td>WPI</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Hibe subaqua pro</td><td>SUB6</td><td></td></tr><tr><td>Hassas denge</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorff</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SC30</td><td></td></tr><tr><td>Yatay Sallanan Çalkalayıcı</td><td>IKA-WERKE</td><td>IKA MTS 214D</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>VWR</td><td>LAB DANCER S40</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Neşter</td><td>WPI</td><td>500351</td><td></td></tr><tr><td>plastik parafin filmi</td><td>VWR</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>0.200 & m tek kullanımlık şırınga filtresi</td><td>SARTORIUS</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>İğnesiz şırınga 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>50012</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler 250 mL</td><td>Dutscher</td><td>28024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steril Falcon tüpleri</td><td>Dutscher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steril Falcon tüpleri</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>kültür eki</td><td>Scaffdex</td><td>C00001N</td><td></td></tr><tr><td>60&nbşk; mm hücre kültürü diskleri: B6</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakaları</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>Castorama</td><td>3178040670105</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (500&nbsp; mL)</td> <td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Termolizin</td><td>Roche</td><td>5339880001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td> <td>İnvitrojen</td><td>12618-013</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td> <td>Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol (50&nbsp; mM)</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>CO2 bağımsız ortam</td><td>GIBCO</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>MERCK</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>insan amniyotik membranı</td><td>Doku bankası St Louis hastanesi (Paris, Fransa)</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantasyonu uygun retina pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Birkaç patolojik koşulları göz işlevselliği ve/veya retina pigment epiteli (RPE) yaşama etkiler. Bunlar bazı formlar retinitis pigmentosa (RP) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) içerir. Hücre tedavisi zaten insanlarda ilk sonuçlar teşvik ile bu hastalıkların tedavisi için önerilen en umut verici tedavi stratejileri biridir. Ancak, greft hazırlanması yöntemi onun fonksiyonel sonuçlar içinde vivoüzerinde önemli bir etkisi vardır. Nitekim, RPE hücrelerinin hücre süspansiyon aşılı Retina bir doku nakli aynı hücreler daha az işlevsel. Burada, mühendis RPE doku ve onun hazırlık in vivo implantasyon için basit ve tekrarlanabilir bir yönteme açıklar. RPE hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerden türetilmiş bir biyolojik destek, insan amniyotik membran (hAM) numaralı seribaşı. Yapay iskele için karşılaştırıldığında, bu destek nerede endojen RPE hücrelerinin bağlı Bruch'ın membran yakın olan bir membran sahip olmanın avantajı var. Ancak, onun manipülasyon kolay değildir ve onun uygun kültür için çeşitli stratejiler ve hazırlık içinde vivoaşılama için geliştirdiğimiz.

Jambon RPE hücrelerinin tohum önce kaldırılması gerektiğini bir epitel tabakası içerir. Membran bir enzimatik tedavi altında sallayarak thermolysin ile gerçekleştirilir. Değil için sırayla (epitel bir tarafı) membran polarite kaybetmek, hangi kompozisyon sağlayıcı (Şekil 1A) bağlı olarak farklı olabilir bir destek tamir edildi. Bu adımda verdiği destek için membran yapışma denetleyin ve gerekirse klip ekleyin. Kültür eklemek içinde fiksasyon zamanda, dikkatli...

Retina pigment epitel hücrelerinin insan amniyotik membran ve hayvan modellerinde aşılama için hazırlık üstüne kültürlü insan pluripotent kök hücreler elde oluşan bir retina doku mühendisi bir yöntem açıklanmaktadır.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Bu yöntem, in vivo olarak özel olarak tasarlanmış biyo-mühendislik dokusunun etkinliği gibi gözün kendi kendine tedavisi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknikle, retina dokusunun üretilmesi ve şekillendirilmesi için bir yöntemin yanı sıra, bir hayvan modelinde göz implantasyonu için dokunun işlenmesi için bir strateji sunuyoruz. Bir ila dört adet 30 x 30 mm'lik insan amniyotik membranını veya hAM'yi yıkayarak başlayın.Bir naylon iskeleyi, 250 ml'lik bir şişede bir çalkalayıcı üzerinde yıkama başına 80 ml PBS'de iki kez, beş dakika boyunca yüksek hızda sabitleyin. İkinci yıkamadan sonra, her şişeye 40 ml çalışan Termoliz çözeltisi ekleyin ve şişeleri 450 rpm'de beş dakika boyunca iki kez çalkalayın, ardından 30 saniye girdap yapın. İkinci Termoliz işleminden sonra, gösterildiği gibi parçaları yıkama başına 80 ml PBS ile iki kez daha yıkayın.Ardından, hAM'leri ayrı ayrı, 10 ml PBS içeren 10 cm'lik bir kültür kabına aktarmak için uzun steril forseps kullanın. Daha sonra, naylon aşağı bakacak şekilde bir zarı PBS'nin ikinci bir 10 cm'lik kültür kabına yerleştirin ve zarı naylon olarak tutan dört klipsten ikisini çıkarın. Kültür ekinin daha küçük halkasını naylon ile zar arasına yerleştirin ve zarın daha küçük halkayı tamamen kapladığından emin olun.Kültür ekinin ikinci kısmını, haAM'nin bazal zarı kültür ekinde sağ tarafı yukarı bakacak şekilde zarın üstüne klipsleyin ve son iki klipsi çıkarın. Ardından, kültür ekinin dışındaki herhangi bir zarı gerektiği gibi kesmek için steril makas kullanın. Ve membranı, 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de depolamak için PBS içeren 12 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarmak için forseps kullanın.Tohumlamadan önce, flakon başına 15 ml'lik bir konik tüpte 3 ml RPE ortamında bir kez 10 ila altıncı RPE hücresi içeren kriyo şişelerini ısıtın. Hücreler çözüldüğünde, tüplerin her birinde tek hücre süspansiyonları elde etmek için pipetleyin ve üç pan mavisi dışlama ile canlı hücrelerin sayısını sayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri taze RPE ortamında mililitre konsantrasyonunda yedi kez 10 ila beşinci hücre arasında yeniden süspanse edin.Daha sonra, hazırlanan 12 oyuklu plakanın her bir oyuğundan PBS'yi aspire edin ve her bir kültür ekinin ortasına 500 mikro litre hücre ve her oyuğun dibine 1 ml RPE ortamı ekleyin. Daha sonra plakayı 30 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun ve kültürün sonuna kadar ortamı haftada iki kez değiştirin. 30. kültür gününde, %8'lik bir jelatin çözeltisini 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika ısıtın.Ve bir vibratomun iç odasını dört santigrat derece CO2 bağımsız ortamla doldurun. Dört santigrat derecede saklanan %20'lik bir jelatin bloktan 5 cm'ye 5 cm'lik bir blok kesmek için bir neşter kullanın. Bloğun üst tarafını uygun bir yapıştırıcı ile desteğe sabitleyin.Ve vibratomun içine yeni bir bıçak yerleştirin. Bloğu tıraş bıçağıyla aynı seviyeye gelene kadar ayarlayın ve desteğin etrafındaki banyoyu taze dört santigrat derece CO2 bağımsız ortamla doldurun. Blok pürüzsüz bir ön yüzey ile eşit şekilde kesilene kadar bloğu orta hızda kesin ve konumu sıfıra ayarlayın.Ardından, jelatin tamamen kuruyana kadar ortamı jelatinin etrafına aspire edin. Ve bloğun üstünde bir RPE tohumlanmış kültür ekini dikkatlice açmak için forseps kullanın. Ekleme halkasının dışındaki tüm zarı çıkarmak için makas kullanın ve artık ortamın tüm hacmini aspire edin.Kaplanana kadar membrana 1 ml'ye kadar %8'lik sıvı jelatin çözeltisi ekleyin. Ve fazla jelatini dikkatlice çıkarın. Beş ila sekiz dakika sonra, katılaşmış zar kaplanana kadar banyoya taze dört santigrat derece CO2 bağımsız ortam ekleyin.Ve vibratom 100 mikron konumundayken, dokunun yönünü korumaya özen göstererek zarın bir bölümünü orta hızda kesin. Bölümün yönünün tanımlanmasına izin vermek için bölümün bir köşesini bir neşterle kesin. Ve jelatine gömülü zarı, dört santigrat derece koruma ortamı ile doldurulmuş altı oyuklu bir plakadan birine aktarmak için bir spatula kullanın.Köşe kesilmeden önce serbest kalan hareket nedeniyle dilimin yönü tersine çevrilebilir. Bu nedenle, bölümden hemen sonra dilimin konumunu sabitlemeye özen gösterin. İmplantın boyutu daha sonra transplantasyondan önce cerrahi mikroskop altında alıcı gözün boyutuna göre ayarlanabilir.Tipik olarak, kültür ekine fiksasyondan sonra zarın yüzeyinde birkaç ölü hücre kalır, ancak kültür ortamı değiştirildiğinde bu hücreler elimine edilir. Bazal membranın lifleri, hiçbir hücre kalmadığında daha yüksek bir büyütmede görülebilir, bu da Termolizin işlem süresinin optimize edildiğini gösterir. Retina epiteli olgunlaştıkça mikroskop altında görmek daha kolay hale gelir ve üç haftada tam bir parke taşı benzeri tek tabaka oluşturur.Dört haftada, epitel implantasyon için hazırlanacak kadar olgunlaşır. Bu prosedürü denerken, jelatinin durumunun sıcaklığa bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, önerilen sıcaklıklara kesinlikle uymaya özen gösterin.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kök hücre tedavisi alanındaki araştırmacıların, retinitis pigmentosa'nın bir hayvan modelinde biyo-mühendislik ürünü bir dokunun terapötik potansiyelini keşfetmelerinin yolunu açıyor. Bu yöntem, bir iskelenin üstünde bir doku hazırlamak için kullanılabilse de, sonraki nakli için, foto reseptör katmanları içeren daha karmaşık sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, çok ince olan ve kolayca katlanma eğiliminde olan insan amniyotik zarlarının işlenmesindeki zorluk nedeniyle mücadele edeceklerdir.İnsan amniyotik membran fiksasyonu ve jelatin gömme adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve özel bir kullanım yaklaşımı gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

engineering-transplantation-suitable-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Burada, sıçanlarda ve farelerde bir RPE hücresi bolusunu subretinal olarak enjekte etmek için multimedya formatında topluluk tarafından kabul edilen bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, retinal dejenerasyonun hayvan modellerinde implantasyon üzerine aşılanmış RPE hücrelerinin kurtarma potansiyellerini, güvenlik profillerini ve hayatta kalma kapasitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır.

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Subretinal enjeksiyon kök hücre replasman tedavisi için yaşa bağlı makula dejenerasyonu preklinik çalışmalarda yaygın olarak uygulanmıştır. Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz daha az riskli, tekrarlanabilir ve tam olarak değiştirilmiş subretinal enjeksiyon tekniğini hücrelerin sıçan gözlerinin içine sunmak için trans-scleral yaklaşım yoluyla tanımlamak.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücreleri (RPE) pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem farklılaşma kök hücre içine olgunlaşmamış RPE on dört gün ve olgun, fonksiyonel RPE üç ay sonra büyüme faktörleri ve küçük moleküller bir arada kullanır.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Retina pigment epitel hücreleri hücre-replasman tedavisi için Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu gelişmiş form olarak hizmet verebilir. Bu iletişim kuralı coğrafi Atrofi büyük gözlü modeli ve hastalık bu modeline insan embriyonik kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücrelerinin nakli subretinal nesil açıklar.

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Burada, insan pluripotent kök hücresi (hPSC) kaynaklı retinal dokunun büyük bir hayvan modelinin subretinal boşluğuna nakledilmesi için cerrahi bir teknik sunulmaktadır.

Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

İnsan olmayan primat (NHP), anatomik ve genetik benzerlikler nedeniyle insan retina hücresel terapötiklerini incelemek için ideal bir modeldir. Bu makalede, NHP gözündeki retina pigment epitel hücrelerinin submaküler nakli için bir yöntem ve makula manipülasyonu ile ilişkili intraoperatif komplikasyonları önleme stratejileri açıklanmaktadır.

Dejeneratif Retina Hastalıkları için İnsan Dışı Primat Modelinde Retina Pigment Epitel Transplantasyonu

Bu protokol, retina dejenerasyonu olan veya olmayan fare alıcılarında düşük cerrahi komplikasyon oranıyla subretinal hücresel greftleri güvenli ve hassas bir şekilde vermek için transpupiller görme kılavuzluğunda trans-skleral bir yaklaşım sunar.

Retinal Dejenerasyon Fare Modelinde Subretinal Greftlerin Transpupiller Kılavuzluğunda Transskleral Transplantasyonu

Kriyoprezervasyon sonrası hESC kaynaklı fotoreseptör progenitör hücrelerin hazırlanması ve bu hücrelerin rd10 farelerde retina altı verilmesi için ayrıntılı bir protokol tanımladık.

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Öğrenin, insan çok yönlü kök hücrelerinden elde edilen retinal pigment epitel hücreleri kullanarak, amniyon membran üzerinde retina dokusu mühendisliği yapmayı. Bu yöntem, retinal hastalıklar için doku nakli ve tedavi uygulamaları sağlar.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Daha fazla video keşfet