Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Bu yöntem, in vivo olarak özel olarak tasarlanmış biyo-mühendislik dokusunun etkinliği gibi gözün kendi kendine tedavisi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknikle, retina dokusunun üretilmesi ve şekillendirilmesi için bir yöntemin yanı sıra, bir hayvan modelinde göz implantasyonu için dokunun işlenmesi için bir strateji sunuyoruz. Bir ila dört adet 30 x 30 mm'lik insan amniyotik membranını veya hAM'yi yıkayarak başlayın.

Bir naylon iskeleyi, 250 ml'lik bir şişede bir çalkalayıcı üzerinde yıkama başına 80 ml PBS'de iki kez, beş dakika boyunca yüksek hızda sabitleyin. İkinci yıkamadan sonra, her şişeye 40 ml çalışan Termoliz çözeltisi ekleyin ve şişeleri 450 rpm'de beş dakika boyunca iki kez çalkalayın, ardından 30 saniye girdap yapın. İkinci Termoliz işleminden sonra, gösterildiği gibi parçaları yıkama başına 80 ml PBS ile iki kez daha yıkayın.

Ardından, hAM'leri ayrı ayrı, 10 ml PBS içeren 10 cm'lik bir kültür kabına aktarmak için uzun steril forseps kullanın. Daha sonra, naylon aşağı bakacak şekilde bir zarı PBS'nin ikinci bir 10 cm'lik kültür kabına yerleştirin ve zarı naylon olarak tutan dört klipsten ikisini çıkarın. Kültür ekinin daha küçük halkasını naylon ile zar arasına yerleştirin ve zarın daha küçük halkayı tamamen kapladığından emin olun.

Kültür ekinin ikinci kısmını, haAM'nin bazal zarı kültür ekinde sağ tarafı yukarı bakacak şekilde zarın üstüne klipsleyin ve son iki klipsi çıkarın. Ardından, kültür ekinin dışındaki herhangi bir zarı gerektiği gibi kesmek için steril makas kullanın. Ve membranı, 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de depolamak için PBS içeren 12 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarmak için forseps kullanın.

Tohumlamadan önce, flakon başına 15 ml'lik bir konik tüpte 3 ml RPE ortamında bir kez 10 ila altıncı RPE hücresi içeren kriyo şişelerini ısıtın. Hücreler çözüldüğünde, tüplerin her birinde tek hücre süspansiyonları elde etmek için pipetleyin ve üç pan mavisi dışlama ile canlı hücrelerin sayısını sayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri taze RPE ortamında mililitre konsantrasyonunda yedi kez 10 ila beşinci hücre arasında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, hazırlanan 12 oyuklu plakanın her bir oyuğundan PBS'yi aspire edin ve her bir kültür ekinin ortasına 500 mikro litre hücre ve her oyuğun dibine 1 ml RPE ortamı ekleyin. Daha sonra plakayı 30 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun ve kültürün sonuna kadar ortamı haftada iki kez değiştirin. 30. kültür gününde, %8'lik bir jelatin çözeltisini 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika ısıtın.

Ve bir vibratomun iç odasını dört santigrat derece CO2 bağımsız ortamla doldurun. Dört santigrat derecede saklanan %20'lik bir jelatin bloktan 5 cm'ye 5 cm'lik bir blok kesmek için bir neşter kullanın. Bloğun üst tarafını uygun bir yapıştırıcı ile desteğe sabitleyin.

Ve vibratomun içine yeni bir bıçak yerleştirin. Bloğu tıraş bıçağıyla aynı seviyeye gelene kadar ayarlayın ve desteğin etrafındaki banyoyu taze dört santigrat derece CO2 bağımsız ortamla doldurun. Blok pürüzsüz bir ön yüzey ile eşit şekilde kesilene kadar bloğu orta hızda kesin ve konumu sıfıra ayarlayın.

Ardından, jelatin tamamen kuruyana kadar ortamı jelatinin etrafına aspire edin. Ve bloğun üstünde bir RPE tohumlanmış kültür ekini dikkatlice açmak için forseps kullanın. Ekleme halkasının dışındaki tüm zarı çıkarmak için makas kullanın ve artık ortamın tüm hacmini aspire edin.

Kaplanana kadar membrana 1 ml'ye kadar %8'lik sıvı jelatin çözeltisi ekleyin. Ve fazla jelatini dikkatlice çıkarın. Beş ila sekiz dakika sonra, katılaşmış zar kaplanana kadar banyoya taze dört santigrat derece CO2 bağımsız ortam ekleyin.

Ve vibratom 100 mikron konumundayken, dokunun yönünü korumaya özen göstererek zarın bir bölümünü orta hızda kesin. Bölümün yönünün tanımlanmasına izin vermek için bölümün bir köşesini bir neşterle kesin. Ve jelatine gömülü zarı, dört santigrat derece koruma ortamı ile doldurulmuş altı oyuklu bir plakadan birine aktarmak için bir spatula kullanın.

Köşe kesilmeden önce serbest kalan hareket nedeniyle dilimin yönü tersine çevrilebilir. Bu nedenle, bölümden hemen sonra dilimin konumunu sabitlemeye özen gösterin. İmplantın boyutu daha sonra transplantasyondan önce cerrahi mikroskop altında alıcı gözün boyutuna göre ayarlanabilir.

Tipik olarak, kültür ekine fiksasyondan sonra zarın yüzeyinde birkaç ölü hücre kalır, ancak kültür ortamı değiştirildiğinde bu hücreler elimine edilir. Bazal membranın lifleri, hiçbir hücre kalmadığında daha yüksek bir büyütmede görülebilir, bu da Termolizin işlem süresinin optimize edildiğini gösterir. Retina epiteli olgunlaştıkça mikroskop altında görmek daha kolay hale gelir ve üç haftada tam bir parke taşı benzeri tek tabaka oluşturur.

Dört haftada, epitel implantasyon için hazırlanacak kadar olgunlaşır. Bu prosedürü denerken, jelatinin durumunun sıcaklığa bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, önerilen sıcaklıklara kesinlikle uymaya özen gösterin.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kök hücre tedavisi alanındaki araştırmacıların, retinitis pigmentosa'nın bir hayvan modelinde biyo-mühendislik ürünü bir dokunun terapötik potansiyelini keşfetmelerinin yolunu açıyor. Bu yöntem, bir iskelenin üstünde bir doku hazırlamak için kullanılabilse de, sonraki nakli için, foto reseptör katmanları içeren daha karmaşık sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, çok ince olan ve kolayca katlanma eğiliminde olan insan amniyotik zarlarının işlenmesindeki zorluk nedeniyle mücadele edeceklerdir.

İnsan amniyotik membran fiksasyonu ve jelatin gömme adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve özel bir kullanım yaklaşımı gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.