Kapsamlı değerlendirme etkinliği ve güvenliği üç tamamlayıcı yöntemlerle plasenta hedefli ilaç dağıtım

Bu yöntem, nanotıp alanında, anneye ve fetüse verilen nanopartikül üzerine yüklenen ilacın etkinliği ve güvenliği hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, plasentaya verilen ilaç miktarının doğru bir biyokimyasal ölçümünü kolaylaştırmasıdır. Bu tekniğin etkileri, plasenta aracılı gebelik komplikasyonlarının tedavisine kadar uzanır, çünkü plasentaya ilaç dağıtımının kesin olarak hedeflenmesini sağlamak önemlidir.

Embriyonik gelişimin yüksek frekanslı ultrason değerlendirmesi, ustalaşmak için sabır ve deneyim gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. İntravenöz nanopartikül enjeksiyonu için, ısıyla genişlemiş kuyruk damarları olan bir Embryonic Day 14.5 hamile fareyi bir süzgecin içine aktarın ve kuyruğu bir alkollü çubukla temizleyin. Daha sonra 28 gauge insülin şırıngasının iğne ucunu genişlemiş bir kuyruk damarına sokun ve nanopartikülleri kuyruk damarına iletmek için pistonu beş ila 10 saniye boyunca eşit basınçla yavaşça bastırın.

Enjeksiyondan 30 dakika sonra, anestezi uygulanmış hamile fareyi sırtüstü pozisyonda in vivo floresan görüntüleme sisteminin görüntüleme odasına yerleştirin. İndosiyanin yeşili floresan sinyallerini görüntülemek için 2D floresan ve uygun fotoğrafik parametreleri seçin ve otomatik ve uyarma ve emisyon dalga boylarına maruz kalmayı sırasıyla 710 ve 820 nanometreye ayarlayın. Sonra hayvanı görüntüleyin ve hamile fareyi kafesine geri koyun.

Enjeksiyondan 48 saat sonra, fetüsleri ve plasentaları toplamak için Graefe forsepsleri, Graefe doku forsepsleri ve diseksiyon makası kullanın ve hasat edilen dokuları tüm hayvan için gösterildiği gibi görüntüleyin. Embriyonik gelişimin yüksek frekanslı ultrason değerlendirmesi için, nanopartikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, anestezi uygulanmış hamile barajını sırtüstü pozisyonda 37 ila 42 derece önceden ısıtılmış ultrason görüntüleme platformuna sabitleyin ve 40 megahertz dönüştürücüyü mekanik kola yerleştirin. Ardından, odak bölgesi içindeki ilgilenilen bölge ile fetüs ve plasentanın uzunlamasına görüntülerini elde etmek için dönüştürücü konumunu ayarlayın.

B modu görüntüleme ve analiz için, B modunu seçin ve fetüs ve plasenta görünene kadar dönüştürücüyü karın üzerine indirin. Görüntülemeyi başlatmak ve durdurmak için Scan/Freeze'i, cine döngüsünü saklamak için Cine Store'u ve çerçeve görüntülerini saklamak için Frame Store'u (Çerçeve Deposu) tıklatın. Ardından gebelik kesesi uzunluğunu, fetal taç popo uzunluğunu, biparietal çapı, karın çevresini, plasenta çapını ve plasenta kalınlığını analiz etmek için Ölç'e tıklayın.

Nabız dalgası Doppler görüntüleme ve analizi için, aynı tarama projeksiyonunu kullanarak önce Renk'e tıklayın, ardından Nabız Dalgası'nı seçin ve örnekleme hacmi kutusunu umbilikal arterin ortasına yerleştirin. Görüntülemeyi başlatmak için Tara/Dondur'a ve umbilikal arter görüntülerini toplamak için Cine Store'a tıklayın. Ardından umbilikal arter tepe hızını hesaplamak için Ölç'e tıklayın.

Renkli Doppler modu görüntüleme ve analizi için, aynı tarama projeksiyonunu kullanarak Renk'e tıklayın ve gösterildiği gibi fetal kalbin görüntülerini elde etmek için dönüştürücü konumunu ayarlayın. Ardından, depolanan sinema görüntüsü döngüsünün fetal kalp atış hızını hesaplamak için Ölç'e tıklayın. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi veya HPLC analizi için, önce gösterildiği gibi tek bir doz nanopartikül ile bir Embriyonik Gün 14.5 hamile fareye enjekte edin.

24 saat sonra, hamile hayvanın kalbini 50 mililitre buz gibi% 0.9 tuzlu su ile 10 dakika boyunca perfüze edin ve bağlanmamış nanopartikülleri çıkarmak için fetüsleri ve plasentaları eksi 80 derece depolama için toplayın. Analiz gününde, her 200 miligramlık doku örneğine 500 mikrolitre taze hazırlanmış homojenizasyon çözeltisi ekleyin ve örnekleri ayrışma başına 30 saniye boyunca tam hızda iki kez homojenize edin. İkinci homojenizasyondan sonra, numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanları 0.45 mikrometrelik bir şırınga filtresinden bir HPLC şişesine süzün.

Numune şişelerini enjeksiyon için bir otomatik numune alma tepsisine yerleştirin ve sistemdeki havayı çıkarmak için HPLC gaz gidericiyi açın. Ardından, taban çizgisi gürültüsünü azaltmak için sütunu 30 dakika boyunca mobil faz ile dengelemek için akışı açın ve sütunun sıcaklığını 25 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, 30 dakika içinde dakikada bir mililitre akış hızında 20 mikrolitrelik numune hacimlerini enjekte edin ve analize başlamak için Çalıştırma Yöntemi'ne tıklayın.

Çalıştırmalar tamamlandığında, mobil fazı manuel olarak HPLC sınıfı asetonitril olarak değiştirin ve sistemi korumak için asetonitril'i yaklaşık 15 dakika çalıştırın. İn vivo görüntüleme, plasental kondroitin sülfata bağlı floresan konjuge nanopartikül enjeksiyonundan 30 dakika sonra uterus dokusunda güçlü indosiyanin yeşil sinyalleri ortaya çıkarırken, bağlanmamış nanopartiküller esas olarak karaciğer ve dalak bölgelerine lokalize olur. Enjeksiyondan 48 saat sonra, plasental kondroitin sülfata bağlı nanopartikül enjekte edilen hayvanların plasentasında floresan sinyali gözlenir ve fetüs içinde hiçbir sinyal tespit edilmez.

Plasental kondroitin sülfata bağlı floresan konjuge nanopartikül enjekte edilen hayvanların yüksek frekanslı ultrason izlemesi, önemli fetal ve plasental gelişimsel dönüm noktalarında önemli bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. İlginç bir şekilde, metotreksata bağlı nanopartiküllerle tedavi, fetal ve plasental gelişimi de hafifçe bozar, bu da nanopartiküllerin, gelişmiş geçirgenlik ve tutma etkisi yoluyla metotreksatın plasentaya verilmesini iyileştirebileceğini gösterir. Metotreksat konsantrasyonlarının HPLC ile ölçülmesi, metotreksata bağlı nanopartikül enjekte edilen farelerin plasentaları içinde yedi dakikalık bir tutma süresini gösterir.

Enjeksiyondan 24 saat sonra, metotreksata bağlı nanopartikül enjekte edilen gruptaki plasental metotreksat seviyeleri, plasental kondroitin sülfat ve metotreksata bağlı nanopartikül grubunda ölçülenden önemli ölçüde daha düşüktür ve ikincisinin fetüslerinde metotreksat tespit edilmemiştir. Metotreksat, plasental kondroitin sülfat ve metotreksata bağlı nanopartikül enjeksiyonundan 48 saat sonra plasentada hala tespit edilebilir, bu da plasental kondroitin sülfat ve metotreksata bağlı nanopartiküllerin plasentayı geçemediğini ve böylece fetüs üzerindeki potansiyel olumsuz etkileri en aza indirdiğini gösterir. Bu prosedürü denerken, plasentanın Embriyonik Gün 9 1/2 civarında oluşmaya başladığını ve bu nedenle in vivo görüntüleme deneyinin Embriyonik Gün 10 1/2 veya daha sonra daha iyi yapıldığını hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, plasenta içindeki nanopartiküllerin lokalizasyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için immünofloresan boyama ve analiz gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra, üreme tıbbı alanındaki araştırmacıların gebelik komplikasyonlarında plasenta hedefli tedavi olasılığını araştırmalarının yolunu açmıştır.