Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Bu yöntem, RNA bağlayıcı proteinlerin in vivo olarak belirli RNA'lar üzerinde nasıl bir araya geldiği ve böylece transkripsiyon sonrası gen regülasyonunu nasıl uyguladığı gibi gen ekspresyonu düzenlemesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir klonlama veya genetik manipülasyona ihtiyaç duymamasıdır. Herhangi bir model organizmaya veya alt tipe uyarlanabilir.

Oligonükleotidleri tasarlamak için, çevrimiçi araçları kullanarak mRNA'nın ikincil yapısını veya bir parçasını analiz edin. Önce boş kutuya nükleotid dizisini girin, ardından Temel Seçenekler kutusunda minimum serbest enerjiyi seçin ve izole edilmiş baz çiftlerinden kaçının. Çıktı Seçenekleri kutusunda, etkileşimli RNA ikincil yapı grafiğini seçin ve son olarak Devam düğmesine tıklayın.

İlgilenilen mRNA'nın ikincil yapısını gösteren yeni bir pencere açılacaktır. İlgilenilen mRNA içinde, tercihen geniş ikincil yapılara sahip olmayan ve 3 asal çevrilmemiş bölgelerde bulunan en az üç farklı 21 ila 24 nükleotid uzunluğunda dizi seçin. Guanidin / sitozin oranı% 50'ye yakın olan ve nükleotid tandem tekrarları olmayan bölgeleri seçin, potansiyel saç tokası oluşumunu veya kendi kendine tavlamayı önlemek için.

İstenen hedef mRNA içinde seçilen bölgelere tamamen tamamlayıcı olan 3-asal'da bir biyotin parçası taşıyan 2-asal-metoksi modifiye RNA oligonükleotidlerini manuel olarak tasarlayın. RNA hibritlerinin erime sıcaklığını 60 ila 65 derece arasında ayarlamak ve iyi bir dilsel dizi karmaşıklığına sahip olmak için uygun bir çevrimiçi araç kullanın. Transkriptomdaki diğer mRNA'larla potansiyel ASO çapraz hibridizasyonunu aramak için Temel Yerel Hizalama Arama Aracını kullanın.

Nucleotide BLAST'ı seçin, diziyi boş kutuya yerleştirin ve ilgilendiğiniz organizmayı seçin. Kalan parametreleri varsayılan olarak tutun ve BLAST'a tıklayın. HEK293 hücrelerini, raportör genin iki mikrogramını 20 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ile karıştırarak ve hücrelere ekleyerek 10 santimetrelik bir doku kültürü kabında% 70 birleşimde transfekt

Hücreleri hasattan önce 48 saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Hasat gününde, ortamı serolojik bir pipetle çıkarın ve hücreleri 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış 10 mililitre PBS ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın. Sonra, tabağa altı mililitre PBS ekleyin ve buzun üzerine koyun.

Daha sonra hücreleri bir UV çapraz bağlayıcıda santimetre kare başına 100 milijoule UV ışığına maruz bırakın. UV ışınlarına maruz kaldıktan sonra, hücreleri ve PBS'yi kazıyın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 250 kez g'de döndürün.

Süpernatanı bir pipetle çıkardıktan sonra, tüpü buz üzerinde tutarken beş veya altı kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri iki mililitre önceden soğutulmuş lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Lizatı bir pipetle buz üzerine yerleştirilmiş beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde 30 saniyelik soğutma periyodu ile 10 mikron genlikte 20 saniyelik patlamalardan oluşan üç tur boyunca sonikat yapın. Lizatı iki mililitrelik tüplere aktardıktan sonra, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 15.000 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. RNA izolasyonuna başlamak için, bir miligram oligo(dT)bağlı manyetik boncukları 500 mikrolitre lizis tamponunda dengeleyin. Tüpü döndürücüden çıkarın, manyetik bir rafa yerleştirin ve lizis tamponunu çıkarın.

Dört miligram HEK293 protein ekstraktını oligo (dT) 25 bağlı manyetik boncuklarla birleştirin. Numuneleri kuvvetlice karıştırın, ardından 25 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Tüpleri 10 saniye boyunca manyetik bir standa yerleştirin, ardından süpernatanı çıkarın.

Sonraki iyileşme turları için süpernatanı buz üzerinde tutun. Boncuklara 500 mikrolitre yıkama tamponu A ekleyin ve beş saniye boyunca girdap yapın. Boncukları bir mıknatısla toplayın ve daha sonra RNA'yı elüte etmek B.To boncukları 500 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, 30 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCl ekleyin ve tüpü 80 santigrat derecede iki dakika boyunca 1.000 RPM'de sürekli çalkalayarak inkübe edin.

Tüpü doğrudan manyetik standa aktarın ve mRNA'ların daha düşük sıcaklıklarda boncuklara potansiyel olarak yeniden bağlanmasını önlemek için 10 saniye kadar sonra elüatı mümkün olduğunca çabuk toplayın. Tekrarlanan turlardan elde edilen elüatlar daha sonra birleştirilir ve eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Spesifik mRNA'ları yakalamak için, mililitre E.coli transfer RNA'sı başına 0.1 miligram içeren bir mililitre bağlama ve yıkama tamponuna 30 mikrolitre streptavidin bağlı manyetik boncuk ekleyin.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca bir döndürücü üzerinde dengeleyin. Bir saat sonra, boncukları 750 mikrolitre bağlayıcı ve yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Tüpü girdaplayın, ardından S&B tamponunu çıkarın, ardından 30 mikrolitre tamponda yeniden süspanse edin ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.

100 mikrolitre bağlayıcı ve yıkama tamponunda önceki poli (A) izolasyonundan yaklaşık 35 mikrogram toplam proteini seyreltin, ardından uygun antisens oligonükleotidden 200 pikorol ekleyin ve tavlamayı kolaylaştırmak için 70 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Tüm ısı bloğunu cihazdan çıkarın ve yavaşça soğuması için 10 dakika oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra, 30 mikrolitre dengelenmiş streptavidin bağlı manyetik boncukları numuneye ekleyin, ardından karışımı bir karıştırıcıda 950 rpm'de sürekli çalkalanarak 25 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin, süpernatanı çıkarın ve boncukları 750 mikrolitre önceden ısıtılmış bağlama ve 55 santigrat derecede yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. 20 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCl ekleyin ve RNA'yı çıkarmak için 10 dakika boyunca 950 rpm'de sürekli çalkalayarak 90 santigrat dereceye yerleştirin. 10 dakika sonra, tüpü manyetik standa yerleştirin ve hemen elüatı toplayın.

Bu, oligo(dT) ile yakalandıktan sonra spesifik primerler ve HEK293 hücre ekstraktından p27 mRNA'lara karşı bir antisens oligonükleotid kullanılarak RT-PCR ile mRNA'ların tespiti için kullanılan bir agaroz jeldir. Antisens oligonükleotidler içermeyen bir kontrol de gösterilmiştir. Giriş şeritleri, çapraz bağlı hücrelerden gelen toplam RNA'yı gösterir.

Ek olarak, poli(A) ile rekabetten elde edilen sonuçlar da gösterilir. Burada, insan antijeni R, bilinmeyen RNA bağlayıcı protein ve negatif bir kontrol proteini olan beta-Aktin'i tespit eden antikorlarla mRNA'ya bağlı proteinlerin bir immünoblot analizi gösterilmektedir. Leke, insan antijeni R'nin, antisens oligonükleotidlerle p27 mRNA'ların yakalanması üzerine poli(A)RNA izolatlarında başarıyla tespit edildiğini göstermektedir.

İnsan antijeni R, antisens oligonükleotid içermeyen kontrol izolatlarında tespit edilmedi. Giriş şeritleri, çapraz bağlı hücrelerden elde edilen ekstrakttaki proteinleri gösterir ve poli(A) ile rekabetten elde edilen sonuçlar da gösterilir. Bu prosedürü takiben, belirli bir RNA ile etkileşime giren protein örneğinin tamamını in vivo olarak sistematik olarak analiz etmek için kütle spektrometresi gibi başka bir yöntem gerçekleştirilebilir.

Daha da önemlisi, TRIP, RNA protein etkileşimlerinin dinamik düzenini anlamak için organizmalar arasında her tür poliadenillenmiş RNA'ya uyarlanabilen çok yönlü bir yaklaşımdır. Bu nedenle, gelişimsel olarak kontrol edilen veya hastalıkla ilişkili RNA'ları araştırmak için kullanılabilir ve sonunda terapötik müdahale için yeni hedeflere yol açabilir.