A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry
1 Kasım 2018
Burada, bağlama benzeşim ve aynı anda ölçerek immobilize katı destekli bilayers ile (SLB) A2 annexin etiket içermeyen fosfolipid bağlayıcı protein etkileşim modunu belirlemek için istihdam deneysel bir iletişim kuralı mevcut kütle alımı ve A2 annexin protein visko elastik özellikleri.
Bu yöntem lipid membranları ile proteinlerin yönlerini çalışma yardımcı olabilir. Bizim durumumuzda, negatif yüklü fosfolipidler için annexins kalsiyum bağımlı bağlanması analiz etmek için kullanın. Bu tekniğin başlıca avantajları etiketsiz, hassas, nicel olması ve etkileşimlerin gerçek zamanlı olarak gözlemlenebildiğidir.
Böylece gerçek sonuçların doğrudan analizine olanak sağlar. Bu teknik, daha karmaşık mikromolekül derlemelerinin ve hatta hücrelerin etkileşimi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Metin protokolünde açıklandığı gibi açık beş milimolar lipid çözeltisi kullanın.
10 mililitrelik cam tüplerde istenilen molar oranında çözünmüş lipidleri birleştirin. Kuru bir azot akışı kullanarak organik çözücüleri buharlaştırın. Çözücülerin kalan izlerini gidermek için lipid karışımını üç saat boyunca yüksek vakumlu lyophilization sisteminde bırakın.
Şimdi, bir mililitre sitrat tamponuyla lipid filmini askıya alın. Bir su banyosunda 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede lipid süspansiyon kuluçka, şiddetle her beş dakikada girdap. Bu sıcaklık, karışımdaki en yüksek eriyen lipidin faz geçiş sıcaklığının yaklaşık 10 derece üzerindedir.
Bu arada, 30 dakika boyunca geçiş sıcaklığıüzerinde 50 nanometre çapında gözenek ölçekli polikarbonat membran ile donatılmış ekstrüder önceden ısıtın. Multilamellar vezikül süspansiyonunu önceden ısıtılmış ekstrüderin içine yükleyin. Karışımı polikarbonat membrandan 31 kez geçirerek küçük unilamellar veziküller veya SUV'lar oluşturun.
Sıcaklığı geçiş sıcaklığının üzerinde tutun. İki mililitrelik plastik reaksiyon kabına SUV süspansiyon aktarın ve iki mililitre son hacmi getirmek için sitrat tampon ekleyin. Politetrafloroetilen tutucuya en az 30 dakika boyunca %2'lik sds çözeltisi yerleştiren dört sensör yerleştirin.
Sonra tamamen SDS kaldırmak ve kuru argon veya azot akışı kullanarak denemek için ultra saf su ile yoğun olarak yıkayın. Herhangi bir kirletici maddeyi tamamen gidermek için plazma temizleme sistemi kullanın. Bunu yapmak için, plazma temizleme odasına kuru sensörleri yerleştirin, odayı boşaltın ve oksijenle üç kez temizle.
Sonra plazma temizleyicisini açın. Vakum, yüksek radyo frekansgücü ve 10 dakikalık işlem süresi kullanın. Temizleme çalışmasından sonra makineyi kapatın ve sensörleri çıkarTın.
Plazma temizlenmiş sensörleri cımbız kullanarak dört akış odasına dikkatlice sabitleyin. Sızıntıya neden olabilecek oda ve tüplerin üzerindeki herhangi bir baskıdan veya burulmalardan kaçının. Sistemi açık akış modunda 10 dakika boyunca sitrat arabelleğiyle temizleyin.
Programı başlatın. Frekans ve dağılım taban çizgileri kararlı olana kadar yazılımı kullanarak ilk temel tonu ve overtons frekans ve dağılmasında herhangi bir değişiklik kaydetmeye başlayın. Taban çizgileri sabit olduğunda, sitrat tampon u farzına SUV süspansiyonu uygulayın.
Bir reaksiyon kabı kullanarak, ölü hacmin 1,5 mililitresini çıkarın ve döngü akış modunda sistemi kapatın. Frekans dağılım değişimini 10 dakika daha kaydedin. SLB kararlı olduğunda, 40 dakika boyunca açık akış modunda gerekli kalsiyum konsantrasyonlarında çalışan bir tampon ile sistemi dengeleyin.
Kalsiyum içeren çalışan tampon protein ekleyin. Bir denge sabit durumuna ulaşınceye kadar bir döngü akış modunda protein in uygulama gerçekleştirin. Şimdi, açık akış modunda çalışan tampon beş milimolar EGTA ile kalsiyum iyonları şelat tarafından bağlı protein ayrıştırın.
Sürekli açık akış modunda 50 mililitre çift distile su ile mikro denge sistemini yenileyin. Tüpleri su kabından çıkarın ve sistemin kurumasına izin verin. Kristal sensörü dikkatlice çıkarın ve politetrafloroetilen tutucuyu kullanarak %2'lik bir SDS çözeltisi ile temizleyin.
Akış modülünün görünür kısımlarını sensörün yerleştirildiği iç kısımlarını kurutun. Burada gösterilen, frekans eğrisi ve dağılma vardiya kaydıdır. Lipozomların eklenmesi yle frekanstaki belirgin düşüş, tampon dolgulu veziküller sert değil viskoelastik olduğu için emilimlerini gösterir, dağılma artar.
Daha sonra, birleşen veziküller yırtılır. Veziküllerin içindeki tamponun eşlik eden salınımı, istikrarlı bir platoya ulaşılıncaya kadar adsorbe kitleyi azaltır. Annexin A2'nin lipidlere bağlanması, açık frekans kaymasında görüldüğü gibi kütle ekler, ancak dağılmadaki tek küçük değişiklikte belirtildiği gibi iki katmanlı yapıyı etkilemez.
Kalsiyum iyonu şelat etkeni, EGTA, Annexin A2 tarafından çıkarıldığında lipid filmden ayrıştırılır. Frekans ve dağılma kayıtları sadece Annexin A2 bağlanmasının tamamen kalsiyum iyonuna bağlı olduğunu ve lipid filminin bozulmadığını gösteren çift katmanlı olarak görülen seviyelere kayMaktadır. Temsili bir negatif kontrol deneyi burada gösterilmiştir.
Fosfatidilserin olmadığında kalsiyum iyonu varlığında Annexin A2'nin eklenmesinden sonra frekansta veya dağılımda herhangi bir değişiklik gözlenmez. Bu yordamı çalışırken, uygun iki katmanlı oluşumunu sağlamak önemlidir. Hemen lipozomlar kullanın, aksi takdirde küçük veziküller kararsız bir taban çizgisi ne yol açabilir daha az yüzey gerilimi ile daha büyük olanlar içine kaynaşacak.
Bu prosedürü takiben, kooperatif karşı kooperatif olmayan bağlama gibi ek soruları cevaplamak için bir membran protein etkileşiminin nicel bir açıklaması yapılabilir.
Genel Bakış
Bu makale, katı destekli çift katmanlarla aneksin A2'nin bağlanma afinitelerini ve etkileşim modlarını belirlemeye yönelik bir protokol sunar. Yöntem, protein etkileşimlerinin lipid zarlarıyla gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Biyofizik
Arka Plan
- Aneksin A2, bir fosfolipid bağlayıcı proteindir.
- Lipid zarlarıyla etkileşimlerinin anlaşılması hücresel süreçler için kritik öneme sahiptir.
- Çalışma, negatif yüklü fosfolipitlere kalsiyum bağımlılı bağlanmayı merkeze alır.
- Yöntem etiket gerektirmez ve hassas, kantitatif ölçümlere olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Aneksin A2'nin katı destekli lipid çift katmanlarıyla bağlanma etkileşimlerini analiz etmek.
- Araştırmacılar için detaylı bir deney protokolü sağlamak.
- Yöntemin diğer karmaşık sistemlere uygulanabilirliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Katı destekli lipid çift katmanlarının (SLB) hazırlanması.
- Kütle alımını ve viskoelastik özellikleri ölçmek için kuvars kristal mikrodenge kullanımı.
- Frekans ve dissipasyon değişimlerinin gerçek zamanlı izlenmesi.
- Protein ayrışmasını incelemek için kalsiyum iyon şelasyonu.
Ana Sonuçlar
- Aneksin A2'nin lipidlere bağlanması kalsiyum bağımlıdır.
- Frekans kaymaları, protein bağlanması üzerine kütle değişimlerini gösterir.
- Etkileşim sırasında stabil çift katman yapısı korunur.
- Negatif kontrol deneyleri bağlanmanın özgüllüğünü doğrular.
Sonuçlar
- Protokol, zar proteini etkileşimlerinin kantitatif bir tanımını sağlar.
- Gerçek zamanlı analiz, bağlanma mekanizmalarına dair detaylı içgörüler sağlar.
- Bu yöntem, diğer protein-lipid etkileşimlerini incelemek için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This label-free, real-time technique enables quantitative assessment of protein-lipid binding dynamics, supporting target validation in membrane-associated pathways. By measuring mass and viscoelastic changes, it provides mechanistic insights into calcium-dependent interactions critical for de-risking early-stage targets. The method supports predictive confidence in screening campaigns by delivering reproducible, quantitative data on binding affinity and specificity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving phospholipid-binding proteins like annexin A2.
- Operational Value: Provides label-free, quantitative measurement of binding kinetics and calcium dependence.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming specific, reversible interactions with lipid bilayers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates robust, reproducible data for assay standardization in membrane protein screening.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding events, facilitating hit confirmation and SAR development.
- Scalability: Compatible with diverse lipid compositions and protein targets, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by maintaining native-like lipid environments.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from specific binding or nonspecific adsorption.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of target engagement in disease-relevant systems when linked to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for peripherally acting or membrane-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying calcium-dependent binding to anionic lipids.
- Screening: Delivers quantitative frequency and dissipation shifts as primary readouts for compound or mutant evaluation.
- Analytics: Enables comparison of binding affinity, stoichiometry, and reversibility across conditions.
- Translational Research: Maintains structural integrity of lipid bilayers, supporting extrapolation to cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other membrane-binding proteins and lipid systems, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-lipid interaction studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized SLB formation and real-time monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target specificity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated binding mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation and quartz crystal microbalance operation.
- Depends on access to extrusion equipment, plasma cleaners, and fluidic flow systems.
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, calcium concentrations, and regeneration protocols.
- Adaptation to different models requires validation of lipid composition and protein stability under assay conditions.
- Practical limitations include sensitivity to vesicle aggregation and baseline drift if SLB formation is suboptimal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Lipid Vesicle Preparation and Handling the Quartz Sensors
3:03
Microbalance Operation and Cleaning
5:17
Results: Changes in Frequency and Dissipation during Bilayer formation and the Reversible Ca2+-Dependent Interaction of Annexin A2 with the Lipid Bilayer
6:36
Conclusion
