Açık yama-kelepçe pipet ile Unstirred sınır tabaka iyonu konsantrasyonu ölçümü: etkileri kontrol altında sıvı iyon kanalları akışı
7 Ocak 2019
Mechanosensitive iyon kanalları kez yama-kelepçe kaydı ile sıvı akışı/makaslama kuvvet duyarlılık açısından incelenmektedir. Ancak, Deneysel protokol bağlı olarak, sonuç sıvı akışı-düzenlemelerin iyon kanalları üzerinde hatalı olabilir. Burada, önlenmesi ve teorik bir temel ile bu tür hataları düzeltmek için yöntemleri sağlar.
Bu gönderi, elektro-fizyolojik küredeki temel soruların yanıtlatMasına yardımcı olabilir, örneğin iyon kanallarının sadece yönetmeliklerinde sıvı akışı gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, iyon kanallarının akışkan akış düzenlemesi ile ilgili veri yorumu için membran yüzeyinin karıştırılmamış sınır tabakasındaki gerçek iyon konsantrasyonu tahmin edilebilmektedir. Bu prosedüre başlamak için, bir U şekli oluşturmak için ateş cam kılcal tüp viraj.
Büyük iyon akımları kaydedilirken kılcal damarın iç çapı seri direncini azaltacak kadar büyük olmalıdır. Daha sonra, üç molar potasyum klorür 100 mililitre agarose üç gram eritin ve 90 ve 100 santigrat derece arasında bir sıcak plaka üzerine yerleştirin. Daha sonra, çözelti içine cam köprü batırarak, potasyum klorür agarose ile köprü yükleyin.
Agarose ayarlamak ve sertleştirmek için oda sıcaklığında bir gecede tutun. Ertesi gün, dikkatle sertleştirilmiş agarose tuzu agarose potasyum klorür yüklü cam köprü kazmak. Köprüyü buzdolabında geniş boyunlu üç azılı potasyum klorür şişesinde saklayın.
Bu prosedürde, yama kelepçeodasının üzerine, banyo çözeltisi yüklü bir konteyner yerleştirin. Daha sonra, tüpü emerek yama kelepçesi odasını banyo solüsyonuile doldurun. Sıvı akışını durdurmak için, sıvı akışını engellemek için tüpü kabın tarafına doğru kırpın.
Daha sonra emme tarafında aynı anda emme durdurmak için tüp klip. Bu sabit kontrol koşulu. Sıvı akış kesme kuvveti uygulamak için, her iki tüpü de konteyner ve emme kenarlarında aynı anda açın.
Hücreye sıvı akış kesme kuvveti uygulamadan önce veya uyguladıktan sonra, belirli bir süre içinde sıvı hacmindeki düşüşü ölçerek dakikada mililitre cinsinden akış hızını hesaplayın. Sıvı-metal bağlantı potansiyelindeki değişiklikleri ölçmek için, banyo odası için normal bir fizyolojik tuz tuzu hazırlayın ve agar potasyum klorür köprüsünün yokluğunda ve varlığında karşılaştırın. Daha sonra, pipet ve banyo çözeltileri arasındaki kavşak potansiyelini en aza indirmek için hazneye üç molar potasyum klorür çözeltisi içeren bir yama pipet yerleştirin.
Daha sonra voltaj kelepçesi amplifikatörü geçerli kelepçe moduna ayarlayın. İlk dengeleme potansiyelini etkisiz hale aldıktan sonra, akış hızlarını değiştirerek indüklenen voltaj daki değişiklikleri ölçün. Voltajdaki değişikliklerin sıvı-metal bağlantı potansiyelleri olduğunu doğrulamak için, banyo çözeltisi ile referans elektrot arasındaki agarose tuz köprüsünü kullanarak sıvı akışının bağlantı potansiyeli üzerindeki etkisini yeniden inceleyin.
Sıvı-metal bağlantı potansiyelindeki değişikliklerin sonuçlarıyla, fonksiyon potansiyel akış hızı ilişkilerini çizin ve bağlantı noktası potansiyel değişiminin supra-sıvı akış hızına göre doyurul değerini tahmin edin. Daha sonra, banyo sıvısındaklorür konsantrasyonu değiştirmek ve kavşak potansiyel klorür konsantrasyonilişkisi çizin. Sıvı oranının sabit ve klorür konsantrasyonunun bitişikteki gümüş-gümüş klorür referans elektrotuna düşmesini önlemek için yeterince yüksek olması gerektiğini unutmayın.
İki ilişki eğrisinden, ölçülen kavşak potansiyel kaymasından klorür konsantrasyonundaki değişiklikleri tahmin edin. VDCC-L akımları enzimatik olarak dağılmış sıçan mezenterik arteriyel miyositlerde nystatin delikli yama-kıskaç kaydı ile kaydedildi. Agarose potasyum klorür köprüsü ile referans elektrot ve banyo çözeltileri arasındaki bağlantı potansiyeli en aza indirilebilir ve sıvı akışı VDCC-L akımının gerilimini bağımsız olarak artırmıştır.
Ancak, gümüş-gümüş klorür referans elektrot doğrudan banyo sıvısı bağlı olduğunda, bir agarose potasyum klorür köprü olmadan, sıvı akışı varlığında IV ilişki sağa kaymıştır, statik bir durum altında VDCC-L akımları ile karşılaştırıldığında. Agarose köprüsü ile sıçan bazofilik lösemi hücrelerinde kaydedilen Kerr 2.1 akımlarının sıvı akışına bağlı artış, karıştırılmamış tabaka etkisi ile açıklanabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra elektro-fizyoloji üzerine araştırmacıların önünü açmıştır.
Yani iyon kanalı akımlarında sıvı akışının düzenlenmesi için. Elektro-kimyasal fenomenler açısından, hücre zarı yüzeyinde karıştırılmamış sınır tabakasında.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, sıvı akışının doğru ölçülmesinin önemini ve mekanosensitif iyon kanalları üzerindeki etkilerini ele almaktadır. Deneysel protokollerdeki hataları önlemek ve düzeltmek için yöntemler sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Elektrofizyoloji
- Mekanosensitif iyon kanalları
- Akışkanlar dinamiği
Arka Plan
- Mekanik duyarlı iyon kanalları, hücrelerin mekanik uyarılara verdiği yanıtların anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Sıvı akış ölçümündeki hatalar, iyon kanalı davranışı hakkında yanlış sonuçlara yol açabilir.
- Patch-clamp kaydı, bu çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
- Verilerin doğru yorumlanması için karıştırılmamış sınır tabakanın anlaşılması esastır.
Çalışmanın Amacı
- Sıvı akış etkilerinin iyon kanalları üzerindeki etkilerinin doğru ölçümü için yöntemler sağlamak.
- Mevcut deneysel protokollerdeki potansiyel hatalara dikkat çekmek.
- Membran yüzeyleri yakınındaki iyon konsantrasyon dinamiklerinin anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Sıvı akış ölçümü için U şeklinde ısıya dayanıklı cam kılcal tüp kullanımı.
- Kayıt için bir köprü oluşturmak amacıyla agarozun potasyum klorür içinde çözülmesi.
- Uygun kıvamı sağlamak için agaroz çözeltisinin ısıtılması.
- Etkin iyon akımı kaydı için köprünün potasyum klorür agaroz ile doldurulması.
Ana Sonuçlar
- Önerilen yöntemler, akışkan akış ölçümlerinin doğruluğunu artırmaktadır.
- Düzeltilmiş protokoller, iyon kanalı düzenlemelerinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.
- Karıştırılmayan sınır tabakadaki iyon konsantrasyonunun tahmini gerçekleştirilmiştir.
- Sonuçlar, hassas deneysel düzeneklerin önemini ortaya koymaktadır.
Sonuçlar
- Hassas ölçüm teknikleri, mekanosensitif iyon kanallarının incelenmesi için hayati önem taşımaktadır.
- Sıvı akış regülasyonundaki hatalar, uygun protokoller ile minimize edilebilir.
- Bu çalışma, deneysel yöntemleri geliştirerek elektrofizyoloji alanına katkı sağlamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Karıştırılmamış sınır tabakasındaki iyon konsantrasyonunun doğru ölçümü, sıvı akışının iyon kanalı kapılanması üzerindeki etkilerinin güvenilir şekilde yorumlanması için kritik öneme sahiptir. Bu yöntem, elektrofizyoloji çalışmalarındaki deneysel artefaktları gidererek mekanosensitif iyon kanalı araştırmalarındaki hedef doğrulaması için veri kalitesini artırır. Eklem potansiyeli kaymalarını düzelterek, sıvı kayma gerilimi yanıtlarının preklinik modellerindeki öngörü güvenilirliğini geliştirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gerçek iyon kanalı düzenlemesini, sıvı akışının neden olduğu artefaktlardan ayırt ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Elektrofizyolojik okumalarda iyileştirilmiş sinyal-gürültü oranı aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Karıştırmasız tabaka etkilerinden kaynaklanan yanlış pozitifleri azaltarak, öncü bileşik tanımlamadaki güvenilirliği artırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Membran yakınındaki iyon konsantrasyonu ölçümlerini stabilize ederek, doğrulanmış biyolojik sistemleri sonraki tarama aşamaları için hazırlar.
- Tekrarlanabilirlik: Patch-clamp analizlerindeki temel bir değişkenlik kaynağını gidererek, laboratuvarlar arası analiz standardizasyonunu destekler.
- Kantitatif Çıktı: Karıştırılmamış sınır tabakadaki gerçek iyon konsantrasyonlarının ölçülmesini sağlayarak, konsantrasyon-yanıt ilişkilerinin doğruluğunu artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Tutarlı iyon ortamı modellemesi sağlayarak, keşif aşaması elektrofizyolojisini preklinik doğrulamaya bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen iyon kanalı değişikliklerinin doğrudan mekanosensitiviteden mi yoksa ikincil iyon tükenme etkilerinden mi kaynaklandığını netleştirir.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Preklinik etkinlik ve güvenlik sinyallerinin güvenilirliğini artırarak devam/dur kararlarına temel oluşturur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle de mekanik uyaranlarla düzenlenen iyon kanalları için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Akışkan akış deneylerinde, iyon konsantrasyonu değişimlerinin katkısını doğrudan kanal kapılanmasından ayırarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Akışa duyarlı iyon kanallarını hedefleyen bileşikler değerlendirilirken assay hazırlığını ve tekrarlanabilirliğini artırır.
- Analitik: Sınır tabaka iyon konsantrasyonlarının tahmin edilmesini sağlayan kantitatif eklem potansiyeli kayması ölçümleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: In vitro iyon kanalı yanıtlarının fizyolojik olarak ilgili koşulları yansıtmasını sağlayarak preklinik sürekliliği iyileştirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı terapötik alanlardaki herhangi bir mekanosensitif iyon kanalı hedefini incelemek için yeniden kullanılabilir bir elektrofizyoloji kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Karıştırılmamış tabaka etkilerini hesaba katarak, iyon kanalı regülasyonu çalışmalarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Akışkan akış koşulları altındaki patch-clamp deneylerinin tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu artırır.
- Stratejik Değer: Artifakt kaynaklı veriler nedeniyle başarısız olan takip çalışmalarını azaltarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Daha güvenilir mekanistik verilere dayanarak, iyon kanalı hedeflerinin risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Akış kontrolü ve eklem potansiyeli ölçümlerini düzgün şekilde uygulamak için elektrofizyoloji ve akışkanlar dinamiği konularında uzmanlık gerektirir.
- Hassas akış hızı kontrolü ve akım kenetleme modunda voltaj kenetleme kaydı yapabilen cihazlara bağlıdır.
- Agaroz köprü hazırlama ve banyo çözeltisi bileşimi için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Yöntemin farklı hücre tiplerine veya iyon kanalı hedeflerine uygulanması durumunda adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Referans elektrot yakınında klorür tükenmesini önlemek için yeterince yüksek akış hızlarının sürdürülmesi gerekliliği gibi pratik sınırlamalar içerir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
Agarose Salt Bridges Between the Bath Solution and Reference Electrode
1:29
Application of Fluid Flow Shear Force to Cells in a Patch-Clamping Chamber
2:21
Measuring Changes in Liquid-Metal Junction Potential
3:18
Experimental Estimation of Real Chloride Concentration
4:07
Results: Effects of Fluid Flow on L-type VDCCL and Kir2.1 Currents With and Without Agarose 3 M KCl Bridge
5:14
Conclusion
