Name: Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik kortikal nöronlarında amiloid β'nun aksonal büyüme koni çöküşüne etkisini görüntüleme yöntemini. Bu protokol, Alzheimer hastalığının erken patofizyolojik mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen JSP'ler gelen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir (KAKENHI 18K 07389), Japonya, Takeda Bilim Vakfı, Japonya ve Kobayashi ilaç Co., Ltd., Japonya.

Tüm deneyler kılavuzlarınıza uygun olarak bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Toyama Üniversitesi Sugitani kampüsünde yapılmıştır ve hayvan bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Sugitani kampüsünde Komitesi tarafından kabul edildi Üniversitesi, Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. Daralt tahlil
<ol><li>Poli-D-lizin kaplama<ol>
<li>8-şey kültür slaytlar ile 5 μg/mL poli-D-lizin (PDL) 400 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) kat ve onları gece 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>PDL çözümü kaldırmak ve wells 3 kez distile su ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nöron kültürü24<ol>
<li>Embriyonik gün 14 (E14) ddY fareler microscissors nöron kültürü % 12 at serum, % 0.6 glikoz ve 2 mM L-glutamin (a orta) içeren ortamda ile gelen taze izole serebral cortices kıyma. Antibiyotik eklemeyin. Not: Bu protokol için ddY fare kullanılır. Bu Japonya'da yaygın olarak kullanılan outbred bir yük olduğunu. Bu nöron kültürü iletişim kuralı da sıçan kortikal nöronlar7,25için uygulanabilir.</li>
		<li>87 x g 3 dk de doku santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant kaldırın. Öyleyse Pelet için 2 mL % 0.05 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Her 5 dk dokunarak karıştırın.</li>
		<li>Orta A ve mix 4 mL dokunarak ekleyin.</li>
		<li>178 x g 3 dk de doku santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve ben ve 0.3 mg/mL soya tripsin inhibitörü 37 ° C'de 15 dakika PBS içinde çözünmüş 600 U/mL DNaz kurcalayarak kuluçkaya Her 5 dk dokunarak karıştırın.</li>
		<li>Kuluçka sonra dokunarak 4 mL orta A ve karışımı ekleyin.</li>
		<li>178 x g 3 dk de doku santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant kaldırma sonra orta A 4 mL ekleyin ve cilalı bir Pasteur pipet kurcalayarak triturate.</li>
		<li>70 µm gözenek boyutu kafes triturated kurcalayarak filtre. Filtrasyon sonra bir hemasitometre hücrelerle yoğunluğunu hesaplamak.</li>
		<li>8-şey kültür hücrelerde 0.8 x 104 hücreleri/iyi orta A ile slayt ve CO2 kuluçka 37 ° C'de % 10 CO2 oksijen atmosfere sahip proje kültür</li>
		<li>Kültür 4 h sonra nöronal kültür, % 0.6 glikoz ve 2 mM L-glutamin (orta B) içeren %2 ek bir kültür Orta'ya değiştirin. Not: Nöronlar saflığı yaklaşık % 75,26daha önce açıklandığı gibi oldu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daralt tahlil27<ol>
<li>Ticari olarak elde tam uzunlukta amiloid β1-42 (Aβ1-42) 0,5 mM bir konsantrasyon, distile su içinde dağıtılması ve 37 ° C de 7 gün kuluçkaya. Kuluçka sonra toplanan Aβ1-42 çözüm kullanmak kadar-30 ° C buzlukta saklamak. Not: Bu kuluçka toplama ve Aβ27,28,29,30toksisite için gereklidir.</li>
		<li>Yeni orta b 100 μL Wells'le nöronal kültürünün 4 gün tedavi sonra 0.5 mikron içeren Aβ1-42 ya da araç çözüm (distile su) 1 h için toplanan. Not: Aβ1-42 etkileri doz bağımlı 0,1 5 mikron artmış ve27daha önce açıklandığı gibi 0.5 mikron kadar yükseldi. Aβ1-42 tedavi ne zaman 1 h için nöronal kültür313 gün sonra tarafından benzer sonuçlar görülebilmektedir.</li>
		<li>Kültür orta kaldırmak ve nöronlar sıcak tabakta 37 ° C'de 1 h için PBS içinde % 4 Sükroz içeren %4 paraformaldehyde ile sorunu hemen.</li>
		<li>Fiksasyon sonra PBS ile 3 kez nöronlar yıkayın ve bir sulu montaj orta ile mount. Montaj orta 4 ° C'de 2 – 4 gündür kuru.</li>
		<li>Her şey bir 20 X kuru objektif lens üzerinde ters bir mikroskop ile tüm alanı (7,8 x 9 mm2) yakalama.</li>
		<li>Her nöron uzun neurites aşamada 3 veya 4 olarak aksonlar, yukarıda açıklanan32,33sınıflandırmak.</li>
		<li>Büyüme koniler aşağıdaki ölçütlere göre sınıflandırmak: 1) aksonal büyüme koni lamellipodia eksik veya 2) den az üç filopodia sahip olarak kabul edilir17daha önce açıklandığı gibi büyüme koniler çöktü. Not: Sağlıklı büyüme koniler 0 noktası olarak attı; daraltılmış büyüme koniler 1 puan attı. Puanları hesaplanır çöküşü için her tedavi demek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. amiloid Beta Immunostaining
<ol><li>Fare kortikal nöronlar 1.2 adımda anlatıldığı gibi 3 gün boyunca kültür.</li>
	<li>Tedavi ile toplanan Aβ1-42 (5 mikron) ya da araç CO2 kuluçka 37 ° C'de 4 h için.</li>
	<li>Orta çıkarmadan, her şey için PBS içinde % 4 Sükroz içeren %4 paraformaldehyde eşit bir hacmi ekleyin ve 5 min için sıcak tabakta 37 ° C'de kültür korumak.</li>
	<li>PBS %4 Sükroz içeren %4 paraformaldehyde 400 μL çözüm yerine ve 1 h için sıcak tabakta 37 ° C'de korumak. Bu fiksasyon Protokolü önceki rapor34güncellenmiştir.</li>
	<li>Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>% 5 normal keçi serum PBS ile engelleyin.</li>
	<li>Nöronlar ile fare Anti-amiloid β immünoglobulin G (IgG) (1:50) ve % 1 sığır serum albümin PBS içinde 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Nöronlar bir ikincil antikor (1: 400) Floresan Birleşik ve % 1 sığır serum albümin PBS içinde oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın ve bir sulu montaj orta ile mount.</li>
	<li>Ters mikroskobunun d. 40 X kuru objektif lens kullanarak floresans görüntüler ve eğik aydınlatmalı parlak alan görüntüleri yakalama</li>
</ol>3. aksonal Immunostaining27
<ol><li>3 kez ile PBS nöronlar 1.3.3. adımda açıklandığı gibi kültürlü nöron fiksasyon sonra yıkayın.</li>
	<li>Nöronlar fare anti-tau-1 ile kuluçkaya IgG (1:500), tavşan Anti-Mikrotubul ilişkili protein 2 (MAP2) IgG (1:500) % 5 normal keçi serum ve %0,3 t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol içinde PBS gecede 4 ° C'de.</li>
	<li>Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikorlar (1: 400) Floresan Birleşik ve %0,3 t- octylphenoxypolyethoxyethanol PBS içinde 2 h için oda sıcaklığında nöronlar kuluçkaya.</li>
	<li>Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın ve bir sulu montaj orta kullanarak bağlayabilirsiniz.</li>
	<li>Floresan ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) ters mikroskop A. üzerinde 20 × kuru objektif lens kullanarak çekim</li>
</ol>4. canlı hücre27 görüntüleme
<ol><li>Kat cam tabanlı yemekleri ile 500 μL PDL (5 μg/mL), 1.1.1. adımda açıklandığı gibi. Not: Bu protokol için ev yemekleri cam tabanlı kullanılmıştır. Piyasada bulunan cam tabanlı yemekleri de canlı görüntüleme için kullanılabilir. Ev yemekleri cam tabanlı aşağıdaki gibi hazırlanan: 1) yol yaklaşık 1.4 mm çapında 35-mm çanak ortasına bir el yumruk ile açın ve 2) silikon ile çanak arka cam coverslip (22 mm çapında) ekleyin.</li>
	<li>1.1.2. adımda açıklandığı gibi plakaları distile su ile yıkama ve kortikal nöronlar, 3 x 104 hücreleri/çanak adım 1.2 açıklandığı gibi orta a cam tabanlı tabak içinde kültür.</li>
	<li>Yeni orta B 2 mL ve transferi ile Orta hücre kültürü, 4 gün değiştirdikten sonraki yemek için mikroskop A. koru % 10 CO2 37 ° C'de oksijen bir atmosferde kültür ters</li>
</ol>5. endositoz deney
<ol><li>Fare kortikal nöronlar 1.2 adımda anlatıldığı gibi kültür.</li>
	<li>Dört gün sonra yeni orta 20 mikron floresans membran sonda 1 dk. için içeren B 100 μL orta yerine.</li>
	<li>Pipetting tarafından 1 μL 0,05 mM toplu Aβ1-42 (son 0.5 mikron) veya araç (distile su) çözüm ve karışımı ekleyin. 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Orta kaldırmak ve wells önceden 37 ° C'ye ısıtılmış oldu iki kez orta B ile yıkayın</li>
	<li>Tamir, yıkama ve nöronlar 1.3.3 ve 1.3.4 adımlarda açıklandığı şekilde bağlayın.</li>
	<li>Floresan ve petrol objektif lens üzerinde ters mikroskop A. X 63 görüntülerle DIC yakalama</li>
	<li>Floresans membran sonda pozitif alan her sağlıklı büyüme koni yoğunluğu bir görüntü yazılımı kullanarak ölçmek.</li>
</ol>6. Gene Transfection
<ol><li>Kortikal nöronlar 1.2. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. 1.2.1-1.2.10 adımları tamamladıktan sonra 178 x g 3 dk de nöronların santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak için Ca2 +4 mL ekleyin-ücretsiz ve Mg2 +-Hanks dengeli tuz solüsyonu (CMF-HBSS) ücretsiz ve mix pipetting tarafından.</li>
	<li>178 x g 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak, 4 mL CMF-HBSS ve pipetting tarafından karıştırın. Daha sonra hücre yoğunluğu 1.2.10 adımda anlatıldığı gibi hesaplayın.</li>
	<li>5 x 106 hücreler bir 1,5 mL tüp ve 1 dk. için 1,677 x g, santrifüj aktarın.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak, transfection çözüm eki ile 100 μL ve EGFP veya EGFP-AP180 C-terminus kodlama DNA plazmid 3 μg ekleyin ve pipetting tarafından mix.</li>
	<li>Yukarıdaki çözüm (adım 6,6) sertifikalı bir küvet aktarmak ve üreticinin protokole göre bir electroporator ile transfect.</li>
	<li>Hemen transfection sonra orta A 500 μL küvet ekleyin ve sertifikalı bir pipet ile 1.5 mL tüp çözüm aktarmak. Daha sonra hücre yoğunluğu 1.2.10 adımda anlatıldığı gibi hesaplayın.</li>
	<li>0.8 x 104 hücreleri/iyi, bir 8-şey kültür slayda hücrelerde 1.2.11 ve 1.2.12 adımlarda açıklandığı gibi kültür.</li>
	<li>Hücre kültürü, 4 gün sonra bir çöküş tahlil 1.3 adımda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.</li>
</ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Bu çalışmada açıklanan protokol aksonal büyüme koniler erken olayları gözlem Aβ1-42 tedaviden sonra etkin. Aβ1-42 endositoz aksonal büyüme koni içinde 20 dk içinde indüklenen ve büyüme koni Daralt tedavinin içinde 1 h gözlendi. Bu endositoz muhtemelen clathrin tarafından aracılık. Bu iletişim kuralını kullanarak, clathrin-aracılı endositoz inhibisyonu Aβ1 42 bağlı büyüme koni çöküşü ve kültürlü nöronlar27aksonal dejenerasyon önlemek için doğrulandı. Ayrıca, clathrin-aracılı endositoz inhibisyonu A...

Amiloid-β (Aβ) mevduat Alzheimer hastalığı (Ah) hastalarda beyin bulunur ve nöronal ağlar, bozabilir reklam1 bellek bozuklukları2,3,4' e giden kritik bir nedeni olarak kabul edilir. Birçok klinik ilaç adaylarının etkili amiloid-β (Aβ) üretim önlemek veya Aβ mevduat kaldırma gösterilmiştir. Ancak, hiçbiri reklam hastalar5işlevinde bellek iyileştirmede başarılı olması. Aβ bellek bozuklukları6başlangıcından önce beyinde yatırılır; Bu nedenle, hastaların beyinlerinin seviyelerinde Aβ azalan sergileri bellek bozuklukları etkisiz olabilir. Aβ ifade preklinik reklam hastalarda mevcuttur; Ancak, bu hastaların nadiren nöronal dejenerasyon ve bellek açıkları6ile mevcut. Aβ ifade ve bellek bozuklukları arasında bir zaman farkı vardır. Bu nedenle, reklam önlenmesi için kritik bir strateji Aβ toksisite reklam, önce bellek açıkları gelişimi erken aşamalarında sinyali engelliyor. Aβ ifade için bir bozulma yol açabilir axon dejenerasyon7,8,9,10,11,12,13, neden olmaktadır. sinir ağları ve bellek işlevinin sürekli bozulma. Birçok çalışma mekanizmaları Aβ toksisite araştırdık; Örneğin, dejenere aksonlar, reklam farelerin beyinlerinin autophagy14artış gösterilmiştir. Kalsinörin harekete geçirmek aksonal dejenerasyon Aβ kaynaklı15olası bir mekanizma olarak bildirilmiştir; Ancak, aksonal dejenerasyon doğrudan tetikleyici bilinmeyen kalır.
Bu çalışmada aksonal sonlar büyüme koniler olarak adlandırılan çöküşü odaklanır. Aksonal büyüme koniler çöküşü aksonal büyüme kovucular, semaphorin-3A ve ephrin-A516,17,18,19,gibi20neden olabilir. Çöküşü gibi distrofik aksonal sonlar hastalar21,22yılında beyinlerinde gözlenmiştir. Ayrıca, büyüme koni işleyen bir başarısızlık aksonal dejenerasyon23sebep olabilir. Ancak, ister Aβ büyüme koni Daralt indükler bilinmemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada Aβ erken etkileri kültürlü nöronlar içinde gözlemlemek ve Aβ kaynaklı büyüme koni Daralt araştırmak için yeni bir protokol sunar.

<table><tbody><tr><td>ddY fareler</td><td>SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekiz kuyulu kültür slaydı</td><td>Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>poli D lizin</td><td>Wako</td><td>168-19041</td><td></td></tr><tr><td>Kültür ortamı, Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>ev serumu</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Wako</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>%0.05 tripsin</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>DP</td><td></td></tr><tr><td>soya fasulyesi tripsin inhibitörü</td><td>Gibco</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>70 & mikro filtreli; m ağ boyutu, hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>B-27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatör</td><td>Astec</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Amiloid ve beta; 1-42</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9810</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>sükroz&nbsp;</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Sulu montaj ortamı, Aqua-Poly/Mount</td><td>polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop A</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer Z1&nbsp;</td><td>AxioCam MRm, Isıtma Ünitesi XL S, CO2 Modülü S1 ve TempModule S1 ile bağlantılı</td></tr><tr><td>Objektif Plan-Apochromat 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901</td><td></td></tr><tr><td>Objektif Plan-Apochromat 63x</td><td>Carl Zeiss</td><td>440762-9904</td><td></td></tr><tr><td>Objektif, CFI Planı Apo Lambda 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2 IgG Abcam</td><td></td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>anti-tau-1 IgG Chemicon</td><td></td><td>MAB3420</td><td></td></tr><tr><td>anti-amiloid ve beta; antikor</td><td>IBL</td><td>10379</td><td>klonu 11A1</td></tr><tr><td>normal keçi serumu</td><td>Wako</td><td>143-06561</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini</td><td>Wako</td><td>010-25783</td><td></td></tr><tr><td>t-oktilfenoksipolietoksietanol</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 ile konjuge keçi anti-fare IgG AlexaFluor 488 ile</td><td>konjuge Invitrogen</td><td>A11032</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti-tavşan IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>sıcak plaka</td><td>NISSIN</td><td>NHP-M30N</td><td></td></tr><tr><td>kapak camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>35 mm çanak</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Silikon RTV</td><td>Shin-Etsu</td><td>KE42T</td><td></td></tr><tr><td>el zımbası</td><td>Roper Whitney</td><td>No. </td><td></td>XX</tr><tr><td>Floresan membran probu, FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+- ve Mg2+ içermeyen Hanks'in dengeli tuz çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon çözeltisi, Nükleofektör çözeltisi</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör, Nükleofektör I</td><td>Amaxa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop B</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü yazılımı, ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amiloid-β (Aβ) bellek bozuklukları Alzheimer hastalığı içinde (Ah) neden olur. Tedavi gösterilen rağmen reklam hastaların beynindeki Aβ düzeyleri azaltmak için bunlar hafıza fonksiyonları geliştirmek değil. Bellek bozuklukları görünümünü önce beyinde Aβ toplar beri Aβ hedefleme zaten bellek açıkları sergileyen reklam hastaları tedavi etmek için verimsiz olabilir. Bu nedenle, aşağı akım Aβ birikimi nedeniyle sinyal reklam geliştirme önce engellenmelidir. Aβ aksonal dejenerasyon, nöronal ağlar ve bellek bozuklukları kesintiye uğraması için önde gelen neden olmaktadır. Aβ toksisite mekanizmalar üzerinde birçok çalışma olmasına rağmen kaynak Aβ toksisitesi bilinmemektedir. Kaynağını belirlemeye yardımcı olması için mikroskopi, gen transfection ve canlı hücre tarafından Aβ kültürlü nöronların aksonal büyüme koni içinde neden erken değişiklikleri öğrenmek için Imaging kullanan yeni bir iletişim kuralı öneriyoruz. Bu iletişim kuralı Aβ endositoz inhibisyonu Aβ toksisite engel olduğunu gösteren clathrin aracılı endositoz büyüme koni çöküntü, takip aksonal büyüme koni içinde indüklenen saptandı. Bu iletişim kuralı Aβ erken etkileri okumak yararlı olacaktır ve daha verimli ve önleyici reklam tedavi neden olabilir.

Kuluçka Aβ1-42 toksik formları27,28,30,35üretmek için ihtiyaç vardı çünkü bu protokol için kullanmadan, 7 gün için 37 ° C'de Aβ1-42 inkübe. Bu kuluçka sonra Aβ toplanan formları (Şekil 1A) tespit edildi. Bu Aβ1-42 benzer kuluçka Aβ36fibriller şeklinde üretilen bildirilmiştir. Bu toplanan Aβ1-42 ile tedavi son...

Burada amiloid-β (Aβ) beyindeki erken etkilerini araştırmak için bir protokol sunulmuştur. Bu Aβ clathrin aracılı endositoz ve aksonal büyüme koniler çöküşü indükler gösterir. İletişim kuralı erken etkileri Aβ aksonal büyüme koniler okumak yararlı ve Alzheimer hastalığı önleme kolaylaştırabilir.

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Bu yöntem Alzheimer hastalığı araştırma alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, özellikle erken olaylar büyüme koni çöküşü dahil. Bu tekniğin en büyük avantajı, amiloid beta tedavisinden hemen sonra aksonal büyüme konileri görselleştirmek ve analiz etmektir. Antibiyotik olmadan nöron kültür ortamda embriyonik gün-14 farelerden taze izole serebral kortekskıyma mikro-makas kullanarak başlayın.Dokuları toplayın ve 87G'de üç dakika boyunca dokuları santrifüj edin. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın ve pelet için% 0.05 trypsin iki mililitre ekleyin. 37 santigrat derece 15 dakika kuluçka ve her beş dakikada bir dokunarak karıştırın.15 dakika sonra, tripsin nötralize etmek için orta A dört mililitre ekleyin ve dokunarak karıştırın. Sonra dokuları 178 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Supernatant çıkardıktan sonra, DNaase ve soya tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin ve daha önce olduğu gibi her beş dakikada bir karıştırma ile 37 santigrat derece 15 dakika kuluçka.Kuluçka süresi dolduğunda, daha önce olduğu gibi orta A.Mix ve santrifüj dört mililitre ekleyin. Supernatant çıkardıktan sonra, orta A dört mililitre ekleyin ve hiçbir enkaz gözlenene kadar cilalı Pasteur pipet il

visualizing-axonal-growth-cone-collapse-early-amyloid-effects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, fare primer serebellar granül nöronlarında bir nöronal yaralanma modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Uyarıcı bir nörotransmitter reseptör agonisti olan NMDA ve bir ko-agonist olan glisin kullanarak nöronal hasarın indüklenmesinde yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir. NMDA ve glisin, spesifik nöronal reseptörlere bağlanarak aşırı uyarılmasına neden olur ve nöronal hücre hasarına ve ölümüne yol açan büyük bir hücre içi kalsiyum akışına neden olur.

Fare Primer Serebellar Granül Nöronlarında Nöronal Hasarın Modellenmesi

Bu video, amiloid-β (Aβ) agregatları tarafından nöronal büyüme konisi çöküşünün in vitro değerlendirmesini göstermektedir. Nöronların Aβ agregatları ile tedavi edilmesi, hücre iskeletinin destabilizasyonuna neden olarak aksonların ucundaki büyüme konilerinin çökmesine neden olur. Tedavi edilen hücreler, büyüme konisi çöküşünün derecesini değerlendirmek için kontrol hücreleri ile karşılaştırılır.

Agrege Amiloid-β'in Nöronal Büyüme Konisi Çöküşü Üzerine İn Vitro Değerlendirmesi

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Burada, amiloid-beta'nın doğrudan stereotaksik beyin infüzyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, amiloid-beta'nın beyin nöronları üzerindeki kısa vadeli etkilerini ele almak için alternatif bir in vivo fare modeli sağlar.

Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Bu iletişim kuralı, Alfa-synuclein oluşumu çoğaltır hücre tabanlı bir sistem içinde vivoagrega sağlamak için hedeftir. Hücre içi Alfa-synuclein kapanımlar birincil nöronlarda tarafından içselleştirilmesi numaralı seribaşı ve eksojen yayılması hastalıklı Alfa-synuclein transgenik fareler izole yerli microsomes ilişkili Alfa-synuclein toplamları yönetilen.

Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Burada, mitokondri ile ilişkili endoplazmik retikulum (ER) membranlarının (MAM'lar) yapısal stabilizatörlerinin aksonal taşıma hızını, Alzheimer hastalığı (AD) nöronlarından nörotoksik β-amiloid (Aβ) üretimini gerçek zamanlı olarak artırarak veya sürdürerek MAM stabilizasyonunu ölçmek ve AD terapötiklerinin geliştirilmesine yardımcı olmak için doğrudan ve kantitatif bir metrik olarak hizmet etmeyi açıklıyoruz.

Alzheimer Hastalığının (AD) Nöral Modelinde Mitokondri ile İlişkili Endoplazmik Retikulum Membranı (MAM) Stabilizasyonunun Kantitatif Analizi 

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Öğrenin, fare embriyonik kortikal nöronlarında amiloid β'nun aksonal büyüme koni çöküşüne etkisini görüntüleme yöntemini. Bu protokol, Alzheimer hastalığının erken patofizyolojik mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet