Yerelleştirmek için Autometallography ve yarı ölçmek gümüş deniz doku kullanımı

Bu yöntem, alt organ dağılımları ve biyolojik sistemler içinde ağır metallerin konsantrasyonu hakkında çevresel toksikoloji alanında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı AMG kullanımı kolay ve ucuz bir metodoloji olmasıdır, bu dokularda ağır metaller araştırmak için değerli bir adjuvan olmasıdır. Protokolü göstermek için yunusve balinaların dokularını kullanıyoruz.

Ancak, protokolün çeşitli hayvan türlerinde kullanılabileceğine inanıyoruz. Wen-Ta Li ile prosedürü gösteren Shun Theng, enstitümüzden bir klinisyen olacak. Bir mahsur cetacean AMG analizi için çift uyumlu karaciğer ve böbrek dokuları toplayarak başlayın, ve 10 kez% 10 nötr tamponlu formalin hacmi 24 ila 48 saat için doku sabitleme.

Daha sonra, formalin-sabit karaciğer ve böbrek dokularını bir santimetre, üç milimetrelik kesitlerle iki santimetreye küçültmek ve aynı bireyin karaciğer ve böbrek bölümlerini aynı etiketli kasetlere yerleştirmek için tek kullanımlık paslanmaz çelik mikrotom bıçakları kullanın. Bir doku işlemcisindeki bölümleri bir dizi dereceli etanol ve ksilen daldırma yoluyla dehydrate, bir saat ve iki saatlik parafin daldırma takip. İki saatlik parafin daldırma sonra, çelik histoloji kalıpları diplerine dokuları transfer ve taze erimiş parafin ile kurutulmuş doku örnekleri gömmek.

Formalin-sabit, parafin gömülü doku bloklarını soğuk bir plaka üzerinde soğutun, ta ki parafin katılanına kadar, ve doku yüzeyi açığa çıkana kadar mikrotomdaki her bloğu kırpın. Numuneleri eksi 20 derecede 10 dakika soğutun ve mikrotom üzerinde beş mikrometrelik doku bölümleri edinin. Cımbız ve fırçalar kullanarak, elde edildiklerinde doku bölümünün şeritlerini kaldırın ve 45 derece lik çift distile su banyosunun yüzeyinde yüzdürün, ayrılana kadar, ve tek tek mikroskop slaytlarına yerleştirin.

Ardından, slaytları bir saat boyunca bir kaydırak ısıtıcıya, 60 santigrat derecede yerleştirin. Daha sonra, slaytları slayt raflarına yerleştirin ve sekiz beş ve üç dakikalık kuluçkalar için 200 ila 250 mililitre saf ksilen içeren üç farklı boyama yemeğinin kesitlerini definize edin. Dereceli etanol çözeltilerinin farklı boyama yemeklerinde parrafinize edilmiş numuneleri nemlendirin ve ardından çift distile suda durulayın.

PBS'de bölümleri bir kez durulayın ve %5 Triton X 100, sadece PBS'de birkaç kez ve yıkama başına 30 saniye boyunca taze çift distile suda bir kez durulayın. Son yıkamadan sonra, her numuneyi 300 mikrolitre karışık gümüş geliştirme kiti çözeltisi ile etiketleyin, oda sıcaklığında karanlıkta en fazla 15 dakika süreyle. Kuluçka sonunda, slaytları çift distile suyla yıkayın ve slayt başına 300 mikrolitre hematoksilin ile 10 saniye boyunca kesitleri lekeleyin.

Akan musluk suyu ile slaytları yıkayın. Kurutun ve montaj ortamı ile bölümleri monte. Daha sonra, bir ışık mikroskobu 40X hedefi altında, her doku bölümü 10 rasgele histolojik görüntüleri yakalamak.

Örneklerin pozitifliğini otometallografi veya AMG analiz etmek için, görüntüleri uygun bir görüntü analizi yazılım programında açın ve ilk görüntüyü kırmızı, mavi ve yeşil renk kanallarına bölmek için görüntü, yazı ve RGB yığınını seçin. Mavi kanalda, her görüntüdeki AMG pozitif sinyallerle alanın yüzdesini ölçmek için görüntüyü seçin, ayarlayın ve eşik seçin, çekirdeklerde veya kırmızı kan hücrelerinde yanlış pozitif alanların varlığına bağlı olarak her görüntünün eşiği için kesme değerini el ile ayarlayın. Alan kesirinin kaydedildiğini belirtmek için analiz et ve ölçümleri ayarla'yı tıklatın ve alan fraksiyonu denetimin.

Sonuç penceresinin her histolojik görüntü yüzdesi alan sütununun pozitif yüzde alanını görüntülemek için çözümle ve ölçü'ye tıklayın. Endüktif birleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi sonuçları ile AMG-pozitif değerler arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için uygun grafik yazılımını açın. Yeni bir proje dosyası oluşturun ve XY ve korelasyon seçin.

Pearson korelasyon analizi ile analiz sonuçları arasındaki ilişkinin gücünü analiz etmek için endüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi ve AMG analizlerinin sonuçlarını ve seçip analizi ve korelasyon sonuçlarını girdi. Parametrelerde, doğrusal olmayan regresyon penceresi, uygun sayfada farklı bir regresyon modeli seçin ve karşılaştırma sayfasında karşılaştırma yöntemlerini seçin. Kareler F testi ve Akaike's Bilgi Kriteri ekstra toplamı ekleyin.

Karşılaştırma yöntemlerinin sonuçlarına göre, cetacean histolojik gümüş tahsinnispeten uygun bir regresyon modeli seçin ve cetacean karaciğer ve böbrek dokularının gümüş konsantrasyonları tahmin etmek için taht kullanmak, bilinmeyen gümüş konsantrasyonları ile. AMG-pozitif sinyalleri hepatosit ve Kupffer hücrelerinin sitoplazmasında değişken büyüklükte, kahverengiden siyah granüllere ve bazı proksimal renal tübüllerin lümenve bazal membranında kahverengi AMG pozitif sinyallere sarı sarı. Analiz edilen karaciğer ve böbrek dokularında endüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi ve AMG pozitifliği değerleri ile f testi karelerinin ekstra toplamına göre kökenyoluyla tercih edilen doğrusal regresyon ile akaike'nin Bilgi Kriteri arasında pozitif korelasyon vardır.

Bu yordamı denerken, AMG yönteminin bir adjuvan yöntem olduğunu ve dokularda ağır metallerin gerçek bileşimini izlemek için ICPMS gibi diğer özel yöntemlerle kullanılması gerektiğini unutmamak önemlidir.