Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi
14 Haziran 2018
Burada, genetik olarak Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) kullanarak birincil veya genişletilmiş insan doğal öldürücü (NK) hücreleri değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz insan NK hücreleri dönüştürme büyüme faktörü-b reseptör 2 (TGFBR2) ve hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için eksik oluşturulan.
Bu yöntem, NK hücre biyolojisi alanında, efektör hücre fonksiyonunu düzenleyen belirli genlerin ve yolların rolü ve işlevi hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, NK hücre tedavisinde klinik olarak en ilgili genlerden birinin yüksek verimli bir şekilde nakavt edilmesini kolaylaştıran DNA'ya bağlı yaklaşımlara kıyasla yüksek başarı oranıdır. Bu tekniğin etkileri, bir bağışıklık kaçış yolu olarak TGF-beta'yı eksprese eden katı tümörlerin ve beyin tümörlerinin immünoterapisine kadar uzanır.
Birincil NK hücre transdüksiyonu için, dört gün boyunca ortamı her gün ve transdüksiyondan önceki gün değiştirerek, T75 şişesi başına mililitre başına 100 IU IL2 ile desteklenmiş RPMI ortamının mililitresi başına 10 ila beş taze izole edilmiş NK hücresine üç kez inkübe edin. Genişletilmiş NK hücre transdüksiyonu için, birincil NK hücrelerini, ortamın her gün ve transdüksiyondan önceki gün yerini alan bire bir oranda, yayılan zara bağlı IL21 eksprese eden K562 besleyici hücrelerle sıfırıncı günde uyarın. Elektroporasyon gününde, bir T25 şişesini, deneysel hücre koşulu başına mililitre başına 100 IU IL2 ile takviye edilmiş sekiz mililitre taze kültür ortamı ile doldurun ve şişeleri nemlendirilmiş 37 santigrat derece ve% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
Ortam dengelenirken, 26 mikrolitre transdüksiyon karışımı başına koşul başına üç ila dört kez 10 ila altıncı hücre ekleyin, konik bir tüpe karıştırın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, tüm FBS'yi hücre süspansiyonlarından çıkarmak için hücreleri yıkama başına 12 mililitre steril PBS'de üç kez yıkayın. Hücreler yıkanırken, her bir CRISPR RNA ve tracrRNA'yı 200 mikromolar final konsantrasyonuna yeniden süspanse edin.
Her bir CRISPR RNA'nın 2.2 mikrolitresini numune başına 200 mikromolar hacimde bir tracrRNA ile karıştırın ve numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Daha sonra numunelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve CRISPR RNA/tracrRNA komplekslerini kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Ribonükleoprotein komplekslerini oluşturmak için, 30 ila 60 saniye boyunca dönen uygun karşılık gelen CRISPR RNA / tracrRNA kompleksine Cas9 endonükleaz ekleyin ve elde edilen Cas9 ribonükleoprotein komplekslerini oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin.
Son yıkamadan sonra, Nükleofektör çözeltisi P3 kitinden tüm elektroporasyon takviyesi hacmini ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemeye dikkat ederek her bir hücre peletini 20 mikrolitre P3 birincil 4D-Nükleofektör çözeltisinde yeniden süspanse edin. Hemen uygun hücre süspansiyonuna her bir ribonükleoprotein kompleksinden beş mikrolitre ekleyin ve Cas9 ribonükleoprotein kompleksi hücre karışımına bir mikrolitre 100 mikromolar Cas9 elektroporasyon arttırıcı ekleyin. 26 mikrolitre Cas9 ribonükleoprotein hücre çözeltisini bir Nükleoküv şeridinin ayrı oyuklarına aktarın ve numunelerin her bir oyuğun dibini kapladığından emin olmak için şeride hafifçe vurun.
Ardından 4D-Nükleofektör sistemi EN138 programını başlatın. Transdüksiyonun sonunda, hücrelerin üç dakika dinlenmesine izin verin. Daha sonra her bir küvete 80 mikrolitre önceden dengelenmiş kültür ortamı ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derece inkübasyonda koşul başına bir şişeye nazikçe aktarın.
48 saatlik kültürden sonra, standart protokollere göre gen delesyon taraması için genomik DNA'yı beş çarpı 10'dan beş dönüştürülmüş hücreye çıkarın. Daha sonra, dönüştürülen hücrelerin geri kalanını taze zara bağlı IL21 eksprese eden besleyici hücrelerle bire bir oranında uyarın ve kantitatif PCR ile gen ekspresyonu analizi için standart protokollere göre beş günlük ko-kültürden sonra RNA'yı çıkarın. Akış sitometrisi analizi, EN138 programının, mevcut Nükleofektör sistem programlarının en yüksek hücre canlılığı ve transdüksiyon verimliliği yüzdesi ile sonuçlandığını ortaya koymaktadır.
Örneğin, ticari olarak sağlanan kılavuz RNA'ları kullanarak, insan HPRT1, genişlemiş insan NK hücrelerinde başarılı bir şekilde nakavt edilir. Ek olarak, kılavuz RNA2, kılavuz RNA1 artı kılavuz RNA2 ve kılavuz RNA3 içeren Cas9 ribonükleoproteinleri, başarılı bir TGF-beta reseptörü iki ektodomain gen nakavtasyonu sergilerken, kılavuz RNA1 tek başına herhangi bir T7E1 saptanabilir ekleme delesyonunu indüklemez. Gerçekten de, Cas9 ribonükleoprotein elektroporasyonu için EN138 programının kullanılması, bu program aracılığıyla aktarılan hücrelerde TGF-beta reseptörü iki mRNA ekspresyonunda %60'lık bir azalma ile sonuçlanır.
Ayrıca, transdüksiyona uğrayan hücrelerin TGF-beta ve bir insan primer medulloblastom hücre hattı ile ko-kültürü, TGF-beta ile muamele edilmemiş transdüksiyonlu hücrelerin kontrolüne kıyasla NK hücre sitotoksisitesini önemli ölçüde etkilemez ve buna karşılık gelen TGF-beta reseptörü eksikliği ile karşı karşıya kalır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa beş saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, en iyi gen düzenleme sonucunu bulmak için birkaç farklı kılavuz RNA tasarlamayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, gen düzenlemenin etkinliği veya potansiyel hedef dışı genetik mutasyonların nasıl belirleneceği hakkında ek soruları yanıtlamak için DNA dizilimi veya T7E1 mutasyon testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser immünoterapisi alanındaki araştırmacıların, gen düzenlenmiş NK hücrelerinin kanser tedavisinde kullanılma potansiyelini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, birincil insan NK hücrelerinin gen düzenlemesinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.
Bu işlemden sonra NK hücre genişlemesi hakkında daha fazla bilgi için lütfen daha önceki Jove makalemize bakın. İnsan kanı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman evrensel sağlık ve güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Cas9 Ribonükleoproteinleri (Cas9/RNPs) kullanarak insan doğal öldürücü (NK) hücrelerini genetik olarak modifiye etmek için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, TGFBR2 ve HPRT1'de eksik olan NK hücrelerinin üretilmesine izin vererek, NK hücre biyolojisi ve immünoterapi araştırmalarını kolaylaştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- İmmünoloji
- Gen Düzenleme
Arka Plan
- Doğal öldürücü (NK) hücreler, bağışıklık tepkisinde önemli bir rol oynar.
- NK hücrelerinde gen işlevlerinin anlaşılması, immünoterapi yaklaşımlarını geliştirebilir.
- NK hücrelerindeki gen düzenleme için mevcut yöntemlerin sınırlamaları vardır.
- Bu protokol, NK hücrelerinde gen nakavt verimliliğini artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- NK hücrelerini modifiye etmek için güvenilir bir yöntem kurmak.
- NK hücre işlevinde belirli genlerin rollerini araştırmak.
- Katı tümörleri hedefleyen immünoterapi için implikasyonları keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- RPMI ortamında primer NK hücrelerinin izolasyonu ve kültürü.
- IL2 ve besleyici hücreler kullanılarak NK hücrelerinin transdüksiyonu.
- Cas9/RNPs'lerin NK hücrelerine tanıtılması için elektroporasyon.
- Gen nakavt verimliliği ve işlevselliğinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- TGFBR2 ve HPRT1'de eksik olan NK hücrelerinin başarılı üretimi.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla yüksek gen nakavt başarı oranı.
- Tümörler için NK hücre terapisini geliştirmede potansiyel uygulamalar.
- Tümörlerde bağışıklıktan kaçınma mekanizmalarına ilişkin içgörüler.
Sonuçlar
- Protokol, NK hücre modifikasyonu için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır.
- Bulgular, NK hücre biyolojisi ve terapisini anlamak için katkıda bulunmaktadır.
- Gelecekteki çalışmalar bu tekniği klinik uygulamalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Efficient genome editing of primary human NK cells addresses a critical bottleneck in immunotherapy development, enabling mechanistic interrogation of immune evasion pathways such as TGF-beta signaling. This DNA-free Cas9/RNP approach improves target validation confidence by reducing procedure-associated apoptosis and increasing knockout efficiency, supporting de-risking of NK cell-based therapeutics. The method enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating functionally modified NK cells that retain expansion capacity and cytotoxic potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in primary human NK cells to clarify roles of TGFBR2 and HPRT1 in effector cell regulation.
- Operational Value: Provides a high-success-rate alternative to viral transduction, minimizing apoptosis and improving yield of genetically modified NK cells.
- Predictive Value: Supports assessment of gene knockout impact on TGF-beta sensitivity, informing mechanistic de-risking of immunotherapy candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates knockout NK cells suitable for functional assays, including cytotoxicity and gene expression analysis via RT-PCR and flow cytometry.
- Operational Value: Enables standardized preparation of edited NK cells using defined electroporation parameters (EN138 program) for reproducible transduction efficiency.
- Scalability: Supports post-electroporation expansion using irradiated mbIL21-expressing feeder cells, facilitating scale-up for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Produces TGFBR2-deficient NK cells with reduced sensitivity to TGF-beta, modeling immune escape mechanisms in solid and brain tumors.
- Preclinical Continuity: Allows co-culture with tumor cell lines (e.g., medulloblastoma) to evaluate functional resistance to immunosuppressive cytokines.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of gene-edited NK cell persistence and function after modification, supporting go/no-go decisions in immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation through gene knockout, enabling screening-ready cell products, and informing preclinical assessment of immunomodulatory resistance.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of gene roles in NK cell effector function, particularly in TGF-beta-mediated immune suppression pathways.
- Screening: Generates assay-ready NK cells with quantifiable outputs (viability, transduction efficiency, gene expression) for compound or condition comparison.
- Analytics: Delivers measurable endpoints including mRNA reduction (60% for TGFBR2), viability rates, and cytotoxicity shifts for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects genetic modification to functional outcomes in tumor co-culture models, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for NK cell editing that can be applied across multiple genetic targets and therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling efficient, DNA-free knockout in primary human NK cells.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through defined electroporation conditions and feeder cell-based expansion.
- Strategic Value: Reduces biological risk in NK cell therapy development by clarifying gene function and immune escape mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunotherapy targets through mechanistic de-risking of TGF-beta resistance pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary NK cell isolation, culture, and electroporation techniques.
- Dependent on access to Nucleofector 4D system, Cas9 protein, and synthetic guide RNAs.
- Necessitates standardization of guide RNA design and validation across targets to ensure editing efficiency.
- Involves optimization of cell-to-complex ratios and incubation timing for RNP formation and delivery.
- Limited by primary NK cell donor variability and expansion potential post-electroporation.
