Name: Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Öğrenin, Cas9 ribonükleoproteinleri kullanarak insan NK hücrelerinde TGFBR2 ve HPRT1 genlerinin yüksek verimli knockout'unu nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu yöntem, immünoterapi ve kanser tedavisi araştırmalarında güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazması düzenleme tür yardım için Brian Tullius anıyoruz.

Sağlıklı donör buffy kat kaynak malzemesi olarak Merkez Ohio bölge Amerikan Kızıl Haç üzerinden elde edilmiştir. Bu araştırma muafiyet araştırma için kurumsal İnceleme Kurulu, Nationwide Çocuk Hastanesi tarafından tespit edilmiştir.
1. insan NK hücre arıtma ve genişleme
<ol><li>PBMCs Buffy kat12den yalıtmak.<ol>
<li>Katman buffy ceket örneği üzerinde Ficoll-Paque 15 mL 35 mL.</li>
		<li>400 x g fren olmadan 20 dakika santrifüj kapasitesi ve PBMC arabirimden toplamak.</li>
		<li>PBS eşit en az bir hacmi ekleyerek üç kez kurtarılan PBMCs yıkamak, beş dakikalığına de 400 x g centrifuging ve PBC aspirating yıka. NK hücre bu aşamada RosettesSep13tarafından ayrılmış olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK hücreleri radyasyonlu 10 x 106 mbIL21-ifade ile uyararak genişletin besleyici hücreler, 0, 7 ve 14 gün. Taze RPMI % 10 içeren ortamı değiştirin FBS, % 1 glutamin, %1 penisilin streptomisin ve 100 IU/mL IL-2 tüm ortam birimi her gün için.</li>
</ol>2. gRNA tasarımı ve seçimi
<ol><li>Hedef, online araçlar, Örneğin, NCBI, topluluğu kullanarak belirli genomik loci seçin. Örnek. Açıklama: dönüştürme büyüme faktörü beta reseptör 2 (TGFBRR2) ectodomain Görüntülemek kayıt: PF08917 Görüntülemek InterPro: IPR015013 Pozisyon: 49-157 aa Hedef sırası: Exon 4 TGFBR2 gen (ENSG00000163513)</li>
	<li>CRISPR tasarım web araçları http://crispr.mit.edu ve 'Benchling.' gibi gRNAs tasarlamak için kullanın<ol>
<li>Adım 2.1seçilen DNA dizisi girin. İnsan (hg 19) hedef genom seçin. CRISPR kılavuzları (20 nükleotit PAM sıra ile takip: NGG) daha önce girilen serisinden taranır. Ayrıca seçili genom boyunca olası hedef kapalı eşleşmeleri gösterir.</li>
		<li>Onların üzerinde hedef ve hedef kapalı oranları dayalı en yüksek puanı olan en iyi üç gRNAs seçin. Örneğin, Tablo 1 CRISPR tasarım web araçları tarafından önerilen exon 4 TGFBR2 gen hedeflemek için tasarlanmış CRISPR RNA'ları gösterir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CRISPR RNA'ların sentetik fingerprinting crRNAs sipariş.</li>
	<li>Korunmuş, sipariş crRNA ile kısmi Homoloji ile etkileşim kurmak için RNA (tracrRNA) transactivating.</li>
</ol>3. tasarım silme astar eleme
<ol><li>GRNA bölünme siteleri T7E1 mutasyon tahlil için kapsayan astar tasarım.</li>
	<li>Kullanım astar en az 100 bp küçük ekleme-silme (indels) sgRNA hedef sitede sağlamak için öngörülen bölünme sitesinden mutasyon tahlil takip % 1.5 özel jel üzerinde görünür. Tablo 2 TGFBR2 ectodomain yükseltmek için kullanılan astar gösterir.</li>
</ol>4. insan birincil ve genişletilmiş NK hücreleri iletim
Not: Cas9/RNPs öğeleri iletim NK içine 4 D sistemi aşağıdaki gibi kullanarak Elektroporasyon tarafından yapılır.
<ol><li>
Hücre Hazırlık
	<ol>
<li>
Birincil NK hücreleri için4 gün boyunca taze izole NK hücreleri 100 IU/mL IL-2 huzurunda RPMI ortamda kuluçkaya ve gün 5 adım gerçekleştirin. Ortamı her geçen gün daha önce ve bir gün önce iletim açıklandığı gibi değiştirin.</li>
		<li>
Genişletilmiş NK hücreleri içingün 0 ile 1:1 oranında radyasyonlu besleyici hücreler hücreleri uyarmak ve gün 5 veya 6 veya 7 Elektroporasyon gerçekleştirin. Ortamı her geçen gün daha önce ve bir gün önce iletim açıklandığı gibi değiştirin.</li>
		<li>Elektroporasyon günü, taze RPMI 100 IU/mL IL-2 Elektroporasyon ve önceden incubate şişe oksijen 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka geçiyor hücreler için içeren 8 mL ile dolu bir T25 şişesi hazırla. Not: Çözdürülen hücreleri veya 2nd veya 3rd stimülasyon uğramıştır hücreleri electroporated açıklandığı gibi onların kurtarma sonra herhangi bir zamanda olabilir.</li>
		<li>3-4 × 106 hücre iletim Mix 26 µL için koşul başına al. Not: NK hücre çoğalmasıyla çözümünde çok yüksek konsantrasyon iletim hızı artırır.</li>
		<li>Sık RNase aktivite içeren tüm FBS, kaldırmak için 3 kez PBS hücrelerle yıkayın. Onları spin 300 x g her zaman aşağı 8 dakikadır. Not: Tek gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) olarak Cas/RNPs için 7 adım koşulları ve iki gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) bir arada ve bir denetim yok Cas9/RNPs ile göz önünde bulundurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CrRNA:tracerRNA formu / karmaşık
	<ol>
<li>CrRNAs (gRNA1, gRNA2 ve gRNA3) ve tracerRNA 1 x 200 mikron son konsantrasyonları TE çözüm resuspend. Tablo 3' te gösterilen 200 mikron tracerRNA ile her 200 mikron gRNA Mix 2.2 μL.</li>
		<li>Örnekleri 5 min için 95 ° c ısı ve oda sıcaklığında (15-25 ° C) için tezgah üstüne soğumasını bekleyin. Mağaza resuspended RNA'ların ve crRNA: tracerRNA/karmaşık-20 ° c daha sonra kullanmak için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNP kompleks oluştururlar Not: zaman kazanmak için RNP yıkama sırasında karmaşık form Adım 4.1.5.
	<ol>
<li>Tek crRNA:tracrRNA çift yönlü tepki için Tablo 4örnekte gösterildiği gibi 36 mikron için Cas9 endonükleaz sulandırmak.</li>
		<li>Örnekte gösterildiği gibi Cas9 endonükleaz 36 mikron için için kombinasyon iletim crRNA:tracrRNA dubleks, seyreltik Tablo 5.
</li>
		<li>Cas9 endonükleaz crRNA:tracrRNA dubleks için yavaş pipet ucu, 30 'un üzerinde dönen ekleyin s 1 dakika.</li>
		<li>15-20 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya. Kuluçka sonra karışım kullanmak hazır değil eğer karışımı buz kadar kullanmak tutmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elektroporasyon
	<ol>
<li>Tüm ek Elektroporasyon P3 ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Hücre Pelet (3-4 × 106 hücre adım 4.1.5) P3 birincil 4 D Elektroporasyon çözüm 20 μL içinde resuspend. Hava kabarcıkları pipetting sırasında kaçının. Not: hücreleri P3 çözüm içinde uzun süre bırakılmamalıdır.</li>
		<li>Hemen 5 µL RNP karmaşık (adım 4,3), hücre süspansiyon için ekleyin.</li>
		<li>100 μm kalınlığında Cas9 Elektroporasyon artırıcı Cas9/RNPs/hücreye 1 μL karışımı ekleyin.</li>
		<li>Cas9/RNPs/hücre mix 20 μL Elektroporasyon şeritler halinde aktarın.</li>
		<li>Örnek alt şeritler kapsar emin olmak için şeritler hafifçe dokunun.</li>
		<li>4 D Elektroporasyon sistemini başlatmak ve tr-138 programı seçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. mesaj iletim
<ol><li>3 dakika içinde şeritler için dinlenme hücreleri izin.</li>
	<li>Küvet için önceden dengelenmiş kültür ortamının 80 µL ekleyin ve hafifçe örnek şişeler aktarın.</li>
	<li>48 saat sonra iletim, genomik DNA eleme gen silme işlemleri için 5 × 105 hücrelerden ayıklayın.</li>
	<li>Adım 3.2 Taq DNA polimeraz kitleri ile tasarlanmış primerler kullanılarak faiz gen yükseltmek.</li>
	<li>PCR amplicon heteroduplexes T7EI sindirim için formu ve ürün T7EI enzim 37 ° c ile 30-60 dakika için kuluçkaya Not: Tahlil olarak hızlı, basit ve sağlar eleme için tercih edilir T7EI arazi tahlil kullanarak göre elektroforez sonuçları temiz. Ancak, bu yöntem eklemeler ve silmeler, algılayamaz < homolog son Cas9 RNPs deneyler14' te (NHEJ) faaliyet katılmadan tarafından oluşturulan 2 bazlar.</li>
	<li>%1,5 sindirilir DNA'sını özel jel 110 V 30-45 dakika, at 15 dakikada görselleştirmek jel.</li>
	<li>Gerisi mbIL21 ifade içeren hücrelerin teşvik besleyici hücreler 1:1 oranında.</li>
	<li>Beş gün sonra stimülasyon gen ifade düzey qPCR kullanarak için RNA ayıklayın.</li>
	<li>Kuralları calcein deneyleri daha önce12bildirdi. Kısaca, hedef hücreler ile calcein AM (örnekte gösterildiği, 3 µg/mL/1.000.000 DAOY hücreleri kullanıldı) yükleyin. NK hücreleri gecede IL2 içinde bekleterek sitotoksisite deneyleri için hazırlamak (100 IU/mL) artı ya da eksi 10 ng/mL çözünür TGFβ. NK hücreleri geceleme dinlenmiş gibi calcein deneyleri aynı sitokinler içinde gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li>
<li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li>
<li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy%3A+Techniques+and+Clinical+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266(2015).</li>
<li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9(2018).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li>
<li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261(2017).</li>
<li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li>
<li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells%3A+implications+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li>
<li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition%2C+preparation%2C+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li>
<li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li>
</ol>

DAL hizmet vermektedir/kurye Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia tedavi, Merck araştırma laboratuvarları ve Miltenyi labaratuvar için bir danışman olarak hizmet vermiştir ve eşitlik/liderlik CytoSen tedavi vardır.

NK hücreleri DNA-bağımlısı değişiklik4,9zor oldu. Biz, bu nedenle, doğrudan bir sentetik ön şekillendirilmesi Ribonükleoprotein (RNPs) karmaşık ve Cas9 protein saf protein birincil ve genişletilmiş NK hücreleri8içine tanıttı. Bu yöntem takip, kapatma, ortadan kaldırmak için bize izin verdi ve RNA polimeraz II, DNA-bağımlısı iletim yöntemleri ile ilişkili NK hücre apoptosis neden olabilecek diğer transkripsiyon ve çevirim işlemleri başlatan...

Kanserli hastalarda son yıllarda ilerlemiştir. Genetik olarak değiştirilmiş chimeric antijen reseptör (araba) T hücreleri mühendislik bağışıklık hücrelerinin kanserli hastalarda başarıyla dağıtmış mükemmel bir örnektir. Bu hücreler son zamanlarda karşı tedavi için FDA tarafından onaylanmış CD19 + B hücre maligniteler, ama başarı defa birkaç targetable antijenleri taşıyan hastalıklar için sınırlı olmuştur ve böyle sınırlı antijenik kapsayacağını hedefliyor bağışıklık kaçış başarısızlık eğilimli. Ayrıca, araba T hücre otolog T hücreleri kullanımı Greft - versus - host hastalığı allojeneik T hücreleri tarafından neden riski nedeniyle odaklanmıştır. Buna ek olarak, NK hücreleri tümör hedefleri bir antijen-bağımsız şekilde öldürmek edebiliyoruz ve onları kanser immünoterapi6,7,8,9için iyi bir aday yapar GvHD neden olmaz.
CRISPR/Cas9 teknoloji son zamanlarda mühendislik bağışıklık hücreleri kullanılmaktadır ama genetik olarak NK hücreleri Plasmid'ler ile yeniden programlama her zaman zor olmuştur. Bu önemli yordamı ilişkili NK hücre apoptozis ve sınırlı üretim genetiği NK hücreleri4 neden lentiviral ve retroviral iletim gibi bir DNA bağımlı şekilde transgene teslim zorluklar nedeniyle oldu , 9.
Birçok doğuştan gelen bağışıklık hücreleri reseptörleri patojen ilişkili moleküler modelleri için yüksek düzeyde gibi hızlı retinoik asit-indüklenebilir gene ben (teçhizat-ben), hangi yabancı DNA'ın artan tanıma etkinleştirmek. Bu yollar bastırılması daha yüksek iletim verimliliği NK hücrelerindeki DNA tabanlı yöntemleri için genetik değişiklik10kullanırken sağlamıştır.
Biz burada bir DNA ücretsiz genom Cas9 Ribonükleoprotein kompleksleri (Cas9/RNPs) kullanarak birincil ve genişletilmiş insan NK hücreleri düzenleme kullanma yöntemi açıklanmaktadır. Cas9/RNPs, üç bileşenden, Rekombinant protein Cas9 bir complexed crRNA ve tracerRNA oluşan sentetik tek-Kılavuzu RNA ile complexed oluşur. Bu Cas9/RNPs fonksiyonel kompleksler olarak onların teslim nedeniyle yabancı DNA-bağımlısı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek verimlilik ile genomik hedefleri fizyon yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, Cas9/RNPs hücrelerden hızlı Gümrükleme gibi apoptozis indüksiyon hedef kapalı etkileri azaltabilir. Böylece, knock-bileşen Homolog rekombinasyon6,7için DNA ile kombine edildiğinde veya knock-out oluşturmak için kullanılabilir. Cas9/RNPs o Elektroporasyon gösterdik NK hücrelerindeki genetik değişiklik önceki kısıtlamaları üstesinden gelir bir kolay ve nispeten verimli yöntemidir.
TGFβ harekete geçirmek ve NK hücrelerin işlevlerini inhibe büyük bir immünsüpresif sitokin var. TGFβ yolu hedefleme bağışıklık hücre işlevlerini artırabilir sürülmüştür. Biz TGBR2 ectodomain TGFβ11. bağlayan kodlama bölge hedefli Temsilcisi sonuçları bu gen mRNA ifade düzeyini önemli bir azalma göstermek ve daha da değiştirilmiş NK hücreleri TGFβ için dayanıklı hale göstermek. Buna ek olarak, Genişletilmiş yazı Elektroporasyon radyasyonlu besleyici hücreler. kullanarak olmak mümkün olduğu gibi değiştirilmiş hücreler canlılığı ve proliferatif potansiyel, korumak Bu nedenle, aşağıdaki yöntemi NK hücreleri herhangi için genetik olarak işlemek için umut verici bir yaklaşımdır daha fazla klinik veya araştırma amaçlı.

<table><tbody><tr><td>Rozet ve ticaret; İnsan NK Hücre Zenginleştirme Kokteyli</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>15065</td><td>RozetSep ve ticaret; İnsan NK Hücre Zenginleştirme Kokteyli, negatif seçim yoluyla NK hücrelerini tam kandan izole etmek için tasarlanmıştır.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque&reg; PLUS</td><td>GE Healthcare - Yaşam Bilimleri</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>,</td><td>artırılmış nükleaz direnci sağlayan tescilli kimyasal modifikasyonlar içeren TracrRNA'yı 1072532. Cas9 enzimi Alt-R&reg'i aktive etmek için crRNA'ya hibritleşir</td></tr><tr><td>; Alt-R&reg Olarak Sentetik Olarak Üretilen CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>; CRISPR-Cas9 crRNA, intrest Alt-R&reg genini hedefleyen tasarlanmış gRNA dizisine dayalı</td></tr><tr><td>; Genom Düzenleme Tespit Kiti</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>1075931</td><td>Her kit, T7EI endonükleaz, T7EI reaksiyon tamponu ve T7EI tahlil kontrollerini içerir.</td></tr><tr><td>Platin&reg; Taq DNA Polimeraz Yüksek Sadakat</td><td>İnvitrojen</td><td>11304-011</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nükleokozmetik ve ticaret; Sistem</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>İnsan rekombinant IL-2 Protein</td><td>Novartis</td><td>65483-0116-07</td><td></td></tr><tr><td>P3 Birincil Hücre 4D-Nükleokozmetik ve ticaret; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td>pmaxGFP ve trade içerir; Vektör, Nükleofector ve ticaret; Çözelti, Takviye, 16 oyuklu Nükleobüv ve ticaret; Şeritler</td></tr><tr><td>Hedeflemesiz: Özel siRNA, Standart 0.05 2mol ON-TARGETplus</td><td>Dharmacon</td><td>CTM-360019</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Sp Cas9 Nükleaz 3NLS</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>1074181</td><td>Cas9 Nuclease</td></tr><tr><td>DNeasy&reg; Kan & Doku El Kitabı:</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr>, <tr><td>RNeasy Mini Kit,</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr>, <tr><td>Calcein</td><td>, ThermoFisher</td><td>C3099</td><td></td></tr>, <tr><td>TGF ve beta;</td><td>Biolegend</td><td>580706</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 Kontrol Kiti, İnsan</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>1072554</td><td>TracrRNA, HPRT pozitif kontrol crRNA, negatif kontrol crRNA#1, HPRT Primer Karışımı ve Nükleaz İçermeyen Çift Yönlü Tampon içerir.</td></tr><tr><td>IDTE pH 7.5 (1X TE Çözeltisi)</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Cas9 Elektroporasyon Arttırıcı</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>1075915</td><td>Cas9 Elektroporasyon Arttırıcı</td></tr></tbody></table>

cas9 ribonucleoproteins kullanarak knock-out birincil ve genişletilmiş insan nk hücre üretimi

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 teknoloji genom mühendislik birçok hücre tipleri, ama şimdiye kadar gen teslim hızlanıyor ve istikrarlı gen değişikliği birincil NK hücreleri zorlu olmuştur. Örneğin, lentiviral veya retroviral iletim kullanarak transgene teslim hücrelerinin genetik mühendisliğiyle NK önemli yordamı ilişkili NK hücre apoptosis nedeniyle sınırlı bir verim sonuçlandı. Biz burada genom Cas9 Ribonükleoprotein kompleksleri (Cas9/RNPs) kullanarak insan birincil ve genişletilmiş NK hücreleri düzenleme için bir DNA ücretsiz yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem etkili nakavt TGFBR2 ve NK hücreleri HPRT1 genlerinde izin. Veri RT-PCR gen ifade düzey önemli bir azalma gösterdi ve sitotoksisite tahlil bir temsilcisi hücre ürünün RNP-modified NK hücreleri TGFβ için daha az duyarlı oldu önerdi. Genetiği değiştirilmiş hücreler stimülasyon ile ışınlanmış mbIL21 ifade tarafından Genişletilmiş yazı Elektroporasyon olabilir besleyici hücreler.

Elektroporasyon verimliliği
Cas9/RNPs Elektroporasyon en iyi duruma getirmek için GFP hedefleme-siRNA ve DNA plazmid iletim NK hücreleri ile 16 farklı programlar test. Akış Sitometresi tahlil tr-138 hücre canlılığı ve iletim verimliliği (% 35 canlı GFP pozitif hücrelerinin) her iki parçacıklar (resim 1 ve Şekil 2) için en yüksek yüzdesi olduğunu göstermişt...

Burada, genetik olarak Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) kullanarak birincil veya genişletilmiş insan doğal öldürücü (NK) hücreleri değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz insan NK hücreleri dönüştürme büyüme faktörü-b reseptör 2 (TGFBR2) ve hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için eksik oluşturulan.

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Bu yöntem, NK hücre biyolojisi alanında, efektör hücre fonksiyonunu düzenleyen belirli genlerin ve yolların rolü ve işlevi hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, NK hücre tedavisinde klinik olarak en ilgili genlerden birinin yüksek verimli bir şekilde nakavt edilmesini kolaylaştıran DNA'ya bağlı yaklaşımlara kıyasla yüksek başarı oranıdır. Bu tekniğin etkileri, bir bağışıklık kaçış yolu olarak TGF-beta'yı eksprese eden katı tümörlerin ve beyin tümörlerinin immünoterapisine kadar uzanır.Birincil NK hücre transdüksiyonu için, dört gün boyunca ortamı her gün ve transdüksiyondan önceki gün değiştirerek, T75 şişesi başına mililitre başına 100 IU IL2 ile desteklenmiş RPMI ortamının mililitresi başına 10 ila beş taze izole edilmiş NK hücresine üç kez inkübe edin. Genişletilmiş NK hücre transdüksiyonu için, birincil NK hücrelerini, ortamın her gün ve transdüksiyondan önceki gün yerini alan bire bir oranda, yayılan zara bağlı IL21 eksprese eden K562 besleyici hücrelerle sıfırıncı günde uyarın. Elektroporasyon gününde, bir T25 şişesini, deneysel hücre koşulu başına mililitre başına 100 IU IL2 ile takviye edilmiş sekiz mililitre taze kültür ortamı i

generation-knock-out-primary-expanded-human-nk-cells-using-cas9

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, birincil doğal öldürücü (NK) hücrelerin Cas9 ribonükleoprotein aracılı genetik modifikasyonu için bir tekniği göstermektedir. Bir CRISPR RNA (crRNA) ve bir trans-aktive edici crRNA'nın (tracrRNA) baz eşleşmesiyle oluşturulan bir kılavuz RNA'ya (gRNA) bağlı bir Cas9 endonükleazından oluşan bir Cas9 ribonükleoproteini, elektroporasyon yoluyla birincil doğal öldürücü hücrelere verilir. Ribonükleoprotein, hedef bölgedeki konakçı DNA'yı hedefler ve parçalar, bu da hedef genin hücresel...

CRISPR Cas9 Kullanarak Doğal Öldürücü Hücrelerde Gen Düzenleme Tekniği

CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçları, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu el yazması, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü hiPSC raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Cas9/tek kılavuzlu RNA (sgRNA) ribonucleoprotein komplekslerini virüs benzeri parçacıklar içine yüklemek için basit ve ucuz bir protokol geliştirdik. "Nanoblades" adı verilen bu parçacıklar, Cas9/sgRNA kompleksinin ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerin yanı sıra in vivo olarak verimli bir şekilde teslimini sağlar.

Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Kompleksinin Virüs Benzeri Parçacıklar ("Nanoblades") aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Teslimi

Bu protokol, makrofaj ve T hücre satırlarındaki darbe denemelerini basitleştirmek için floresan muhabirleri ve hücre sıralamasını kullanır. Bu basitleştirilmiş knock-in deneyleri için iki plazmid kullanılır, yani CRISPR / Cas9- ve DsRed2 ifade eden plazmid ve bağışıklık hücrelerindeki Rosa26 lokusunda kalıcı olarak entegre edilen EBFP2'yi ifade eden homolog bir rekombinasyon donör plazmid.

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Protokol, kılavuz-RNA'ların tasarımından hücresel klonlamaya ve nakavt klonlarının karakterizasyonuna kadar CRISPR / Cas9 kullanarak nakavt miyoblastlarının nasıl üretileceğini açıklar.

Lentivirüs Aracılı CRISPR / Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak Nakavt Kas Hücre Hatlarının Geliştirilmesi

CRISPR ile ilgili protokoller giderek daha kullanışlı ve erişilebilir hale geldikçe, belirli deneysel koşullar altında komplikasyonlar ve engeller hala ortaya çıkabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 kullanarak reseptörle etkileşime giren bir serin/treonin-protein kinaz 1 (RIPK1/RIP1) nakavt insan hücre hattının oluşturulmasını ana hatlarıyla belirtir ve bu işlem sırasında karşılaşılan potansiyel zorlukları vurgular.

CRISPR-Cas1 Sistemini Kullanarak Bir RIP937 Nakavt U9 Hücre Hattının Oluşturulması

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Öğrenin, Cas9 ribonükleoproteinleri kullanarak insan NK hücrelerinde TGFBR2 ve HPRT1 genlerinin yüksek verimli knockout'unu nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu yöntem, immünoterapi ve kanser tedavisi araştırmalarında güçlü bir araç sunar.

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

Daha fazla video keşfet