Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

Bu yöntem, vektör kaynaklı hastalık ekolojisi alanında, vektör mikrobiyomunun patojen dinamiklerinde nasıl bir rol oynadığı ve vektör mikrobiyomlarının nasıl oluştuğu ve değiştiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, kullanıcının değişen ekolojik ve çevresel koşullar altında vektör mikrobiyomunu doğru bir şekilde karakterize etmesine olanak tanıyan yüksek çoğaltma ve yüksek çözünürlük ve tanımlamaya izin vermesidir. Mikrobiyom dizileme kurulum adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve bu adımları öğrenmek için birçok farklı ürün ve teknik mevcut olduğundan, ancak çok az kaynak bulunduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir.

Bu yordama, metin protokolünde açıklandığı gibi onay işareti toplama ile başlayın. Yüzey kirleticilerini kenelerden çıkarmak için 500 mikrolitre hidrojen peroksit ekleyin ve 15 saniye boyunca girdap yapın. Bu yıkamayı% 70 etanol ve ardından çift damıtılmış su ile tekrarlayın.

Keneleri yeni bir PCR tüpüne yerleştirin ve kurumaya bırakın. Bu tüpte, keneleri ölümcül ve havaneli ile ezerek kene dokularını mekanik olarak bozar. Ticari olarak temin edilebilen bir DNA ekstraksiyon kitinde verilen talimatları izleyerek DNA'yı tek tek kenelerden saflaştırın.

100 mikrolitrelik son hacme kadar elute. Ekstraksiyon adımında negatif bir kontrol oluşturmak, daha sonra şüpheli kirleticileri gerçek vektör mikroplarından ayırt etmek için kritik öneme sahiptir. 16S dizilemede yaygın olan kontaminasyonun etkisini en aza indirmek için ekstraksiyon adımı ve daha sonraki PCR adımları sırasında steril tekniğin kullanılması da gereklidir.

Amplikon PCR'yi, bir mikromolar ve 12.5 mikrolitre ticari olarak temin edilebilen PCR karışımında her bir primerden beş mikrolitre içeren 27.5 mikrolitrelik bir reaksiyonda ayarlayın. Ayrıca, mikrolitre konsantrasyonunda beş nanogram konsantrasyonda tek tek kenelerden ekstrakte edilen beş mikrolitre DNA içerir. Tüpleri bir termocycler'a taşıyın ve metin protokolünde listelenen programı çalıştırın.

PCR yapıldıktan sonra, %1.5'lik bir agaroz jeli üzerine numune başına dört ila altı mikrolitre yükleyerek PCR ürününü görselleştirin. Amplifikasyonu doğrulamak için 460 baz çiftinde bir bant arayın. Her numune için yeni bir PCR tüpü kullanarak, toplam 60 mikrolitre elde etmek için PCR ürününü çift damıtılmış su ile birleştirin.

Düşük DNA konsantrasyonlarına sahip numuneler için, amplifikasyon yanlılığını azaltmak ve konsantre olmak için numuneleri bir araya getirmek için amplikon PCR'yi üçlü olarak gerçekleştirin. Paramanyetik boncukları oda sıcaklığına getirin ve kullanmadan önce iyice girdaplayın. Numunenin 60 mikrolitresine 48 mikrolitre paramanyetik boncuk ekleyin ve beş dakika inkübe edin.

Tüpleri, çözelti berraklaşana kadar beş dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Ardından, süpernatanı çıkarın. Manyetik raftaki tüplerle 500 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin.

Tüm tüplere etanol ekledikten hemen sonra sıvıyı pipetleyin, boncukları çıkarmayın. Etanol ekleme ve çıkarma işlemini bir kez daha tekrarlayın. Tüpleri manyetik rafta beş dakika açık bırakarak veya boncuklarda küçük çatlaklar görünene kadar fazla etanolü çıkarmak için numuneleri havayla kurutun.

Şimdi, 20 mikrolitre TE tamponu ekleyin ve numuneleri mıknatıstan oda sıcaklığında inkübe edin. Beş ila 10 dakika sonra tüpleri tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin. Boncuklar ve sıvı ayrıldıktan sonra, temizlenmiş PCR ürününü elde etmek için süpernatanları yeni bir tüpe aktarın.

Piyasada bulunan bir kitaplık indeks kitinden ileri veya ters primerleri veya her ikisini birden seçerek her örneğe benzersiz astar kombinasyonları atayın. İkili primerleri veya indeksleri numunelere yapıştırmak için, her bir primerden 2,5 mikrolitre, ticari olarak temin edilebilen 12,5 mikrolitre PCR Master Mix, beş mikrolitre çift damıtılmış su ve 2,5 mikrolitre temizlenmiş amplikon ürünü içeren bir PCR reaksiyonu hazırlayın. Tüpleri, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi programlanmış bir termocycler'a taşıyın.

PCR yapıldıktan sonra, %1.5'lik bir agaroz jeli üzerine numune başına dört ila altı mikrolitre yükleyerek PCR ürününü görselleştirin. Daha önce olduğu gibi temizleme prosedürünü gerçekleştirmeden önce amplifikasyonu doğrulamak için 550 baz çiftinde bir bant arayın. Saflaştırılmış her barkodlu ürünün doğru miktar tayinini gerçekleştirmek için, her numune üzerinde qPCR çalıştırın ve her numuneyi üç veya daha fazla seyreltme seviyesinde üç kopya halinde standart hale getirin ve çalıştırın.

Altı mikrolitre qPCR Master Mix, iki mikrolitre çift damıtılmış su ve iki mikrolitre numune veya standart içeren 10 mikrolitre qPCR reaksiyonu hazırlayın. qPCR plakasını metin protokolünde açıklandığı gibi programlanmış gerçek zamanlı bir PCR cihazına taşıyın ve çalıştırmayı gerçekleştirin. Nicelemeyi takiben, tüm bireysel kitaplıkların eşit hacimlerini tek bir tüpe ekleyerek birleşik kitaplığı oluşturun.

Kombine kütüphaneyi ve sıralama kontrolünü seyrelttikten ve denatüre ettikten sonra, kombine karışımı sıralama akış hücresine yükleyin. Optimum optikler için yüklemeden önce akış hücresini iyice temizleyin. Ardından, akış hücresini sıralayıcıya yükleyin ve amplikon dizi analizi gerçekleştirin.

Dizi sayısı normalizasyonu için seyrekleşme eğrileri burada gösterilmiştir. Bu eğriler, gözlemlenen operasyonel taksonomik birimlerin tam çeşitliliğini yakalamak için numune başına 2000 diziye kadar seyrekleştirmenin yeterli olması gerektiğini göstermektedir. Dizi okur, seyrekleştirme ve kalite filtrelemesinden sonra, alfa ve beta çeşitliliği çıktısı gerçekleştirilir.

Burada, kene mikrobiyom bileşiminin tedaviye göre nasıl farklılık gösterdiğini gösteren otomatik olarak oluşturulan bir ilke koordinatları analiz grafiği gösterilmektedir. Ayrıca, burada filum düzeyinde gösterilen her bir numunede bulunan mikropların görselleştirilmesi, tüm numuneler için otomatik olarak oluşturulur. Bu prosedürü denerken, dizi verilerinin yorumlanmasını kritik şekilde etkileyebilecek mikrobiyal kontaminasyonun etkisini en aza indirmek için steril tekniği korumayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, gözlemlenen mikropların vektör içinde nerede bulunduğu gibi ek soruları yanıtlamak için histolojik boyama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu yöntem, moleküler ekoloji alanındaki araştırmacıların vektör içindeki mikrobiyal etkileşimlerin rolünü keşfetmelerinin ve bunun patojen bulaşmasını nasıl etkileyebileceğini araştırmalarının yolunu açtı.