Name: Homo - ve Heterografts arasında karpuz ve kabak şişe soğuk duyarlı mikroRNAlar çalışma için oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Keşfedin karpuz ve kabak şişe arasında homo- ve heterograft oluşturma yöntemini. Bu verimli teknik, soğuk stresine yanıt veren mikroRNA'ları incelemek için kullanılır ve yüksek canlılık oranı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31772191), araştırma projesi (2017 C 32027) Zhejiang eyaletinde kamu yararı için anahtar bilim proje bitki ıslahı Zhejiang (2016 C 02051) için ve Ulusal Program tarafından desteklenmiştir Birinci sınıf genç profesyonellere (P.X.) desteği.

1. tohum sterilizasyon ve çimlenme
<ol><li>Su sıcaklığı 40 ° C'ye düşünceye kadar ara sıra, karıştırma ile 58 ° c su ile dolu bir 500 mL ölçek kabak şişe tohumlar yüzey sterilizasyon için emmek</li>
	<li>Bu arada, bir naylon torbaya ve, sterilize etmek için turba toprak 3 kg koyun Otoklav bu 120 ° C/0.5 MPa 20 dk için.</li>
	<li>4-5 h yok karıştırma ile daha fazla kabak şişe Tohum iliklerine kadar tutun.<ol>
<li>Su oda sıcaklığına ulaştığında, tohumlar 2 x - 3 x distile su ile durulayın.</li>
		<li>Fazla suyu drenaj ve tohumları bir gazlı bez torba karanlık bir büyüme odasında 28 ° C'de filiz için izin.</li>
		<li>Çimlenme sonra steril turba toprak ile dolu tohumları plastik kaplar (6 cm çapında) içine ekmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kabak şişe fidan iki düzleştirilmiş cotyledons geliştirdik adımları 1.1-1.3 karpuz tohumu ile yineleyin. Not: Bu zaman yönetimi "Soy" ve anaç boyutları de başarılı aşılama için uygun sağlar.</li>
</ol>2. fide büyüme ve aşılama
<ol><li>Sıcaklık 28 ° c (ışık) gündüz ve gece boyunca 22 ° C'de (karanlık) tutmak fidan 16-h ışık /8-h karanlık döngüsü ile büyüme odasında büyümek. Fidan su 1 x bir gün ikindi ekleyerek sulamak.</li>
	<li>Kesme-aşılama yöntemi22 heterografts zaman (anaç) kabak şişe fidan bir true-yaprak aşamada ve karpuz (soy) cotyledons (henüz düzleştirilmiş) ortaya çıkmıştır olun<ol>
<li>2-3 cm cotyledons aşağıda hypocotyls karpuz fidan kesmek ve üst kabak şişe fidan hemen üstündeki gerçek yerinde bırakır.</li>
		<li>Kesilmiş kabak şişe fidan üst bir delik açmak için bir kürdan kullanın. Kesilmiş karpuz fidan heterografts yapmak için kabak şişe fidan deliklere yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A benzer yöntem olarak adım 2.2 sunulan homografts olun Not: Homo - ve heterografting kombinasyonları her zaman aynı anda yapılmalıdır (Şekil 1), hangi, bu durumda, aşağıdaki sonuçları: kabak karpuz/şişe (WB, heterograft), karpuz/karpuz (WW, Homogref) ve kabak şişe /bottle kabak (BB, Homogref).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig1.jpg"> Şekil 1: greft kombinasyonları ve aşılı bitki yapıları örnek. WB karpuz/şişe kabak heterografting; = WW karpuz/karpuz homografting; = BB kabak şişe/şişe kabağı homo-aşılama; = WB-S "Soy" yaprakları örneklenmiş; karpuz/şişe kabak heterografts = WB-R örneklenmiş karpuz/şişe kabak heterografts yaprakların anaç =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
3. Yönetim, soğuk tedavisi, postgrafting ve örnekleme
<ol><li>Nispeten yüksek bir nem tutmak ve 16-h ışık/8-h karanlık döngüleri 28 ° c (ışık) gündüz ve sırasında 22 ° c sıcaklık tutmak, çevresel koşullar altında 7 d için proje için Şeffaf Polietilen torbalar ile aşılı fidan enwrap gece (karanlık).</li>
	<li>Şeffaf Polietilen torbalar 7 günde ortaya çıkarmak. İzin aynı altında 7-10 gün ek koşullar için bitkiler büyümek.</li>
	<li>İki grup, soğuk tedavi (vurguladı) diğeri (vurguladı-) denetimi için sağlıklı Tekdüzen fidan bölün. Kontrol grubu için süre soğuk vurguladı grubu için ek bir 48 saat için fidan (28 ° C'de) aynı büyüme odasında bırak, fide adımda anlatıldığı gibi bir büyüme Odası 6 ° C, Açık/Koyu koşulları ile sabit bir sıcaklıkta ile transfer 2.1.</li>
	<li>"Soy" ve anaç yapraklarından Greftler (Şekil 1) örnek. Örnekleri hemen sıvı azot donma ve onları kullanmak kadar-70 ° C'de saklamak.</li>
</ol>4. Kütüphane hazırlık ve yüksek işlem hacmi sıralama
<ol><li>Donmuş numuneler 2 mL microcentrifuge tüp sıvı azot aktarın.</li>
	<li>Paslanmaz çelik boncuk (5 mm çapında) dokular içeren her tüpün ekleyin.</li>
	<li>Boncuk Değirmen homogenizer için 30 kullanarak ince bir toz dokuların homojenize s.</li>
	<li>Aşılama her birleşimi için eşit tutarlar (0,1 g) toprak örneği üzerinden on fidan alıp onları bir 10 mL santrifüj tüpü karıştırın. Üreticinin önerilerini doku ağırlığına karşılık gelen temel guanidium hidroklorid reaktif (Tablo reçetesi) uygun bir miktarda ekleyin.<ol>
<li>Genomik DNA contaminations RNA-Alerjik DNaz ekleyerek kaldırmak ben 150 U/ml 1 h için 37 ° C'de.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplam belirlemek RNA miktarı RNA bütünlüğünü güvenceye almak için bir microcapillary Elektroforez sistemde sayısı &gt; 7.0. Not: Bir RIN &gt; 7.0 RNA örnekleri yüksek bir bütünlük sağlar.</li>
	<li>Küçük RNA kütüphaneler üreticinin yönergeleri doğrultusunda ticari seti (Malzemeler tablo) kullanarak hazırlayın. Örnek başına toplam RNA'ın 1 µg başlatmak için kullanın.<ol>
<li>Tezcan Kütüphane normalleştirme reaktifler ve bağdaştırıcıları üreticinin esaslarına göre. 5've 3'bağdaştırıcıları ile küçük RNA'ların ligate ve elute ve onları arındırmak. Sonra ters uyarlamak 5've 3' tane küçük RNA'lar üreticinin yönergeleri izleyerek.</li>
		<li>PCR güçlendirme üreticinin protokolüne göre gerçekleştirin. Bir microcapillary elektroforez sistemi kullanarak cDNA kütüphanelerin miktar ve kalitesini değerlendirmek.</li>
		<li>Bir RNA, RIN sağlamak için bir microcapillary elektroforez sistemi İnternet üzerinde 1 µL yük &gt; 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başka bir yerde23açıklandığı gibi bir yüksek-den geçerek sıralama cihazda küçük RNA kütüphaneler sıra.</li>
</ol>5. miRNA ve hedef Gene tahmin
<ol><li>Aşılama her birleşim için açık kaynak UEA sRNA tezgah 2.4-bitki sürüm24 kalitesiz dizileri kaldırmak ve adaptör dizileri ham okuma dan kırpmaya kullanın. 18 yaşından küçük olan dizileri silmek nt veya 32 daha büyük nt.</li>
	<li>Yüksek kaliteli "temiz" dizileri tanımak ve okuma rRNA, tRNA, snoRNA ve diğer snRNA kaldırmak için açık kaynak Rfam 11,0 veritabanına karşılaştırın.</li>
	<li>Kısa-okuma sırası hizalama araç25kullanarak başvuru genleri için kalan okuma hizalayın. Hiçbir uyuşmazlığı Bu adımda izin verilir. Not: Karpuz "97103" genom derleme26 Okunma "Soy" ile uyum için kullanılan V1 ve kabak şişe "HZ" genom derleme V127 Okunma anaç için kullanıldı.</li>
	<li>Açık kaynak miRBase 22.028olarak bilinen olgun miRNAs karşı kalan okuma karşılaştırın. Bilinen miRNAs homolog okuma korunmuş miRNAs sınıflandırılır.</li>
	<li>Bilinen miRNA öncüleri genom dizisi ile eşleşecek şekilde başarısız dizileri karşılaştırın. MIREAP29 algoritma varsayılan ayarlar altında potansiyel roman miRNAs algılamak için kullanır.</li>
</ol>6. farklı ifade ve gen Ontoloji Analizi
<ol><li>Onların okuma sayıları dayalı miRNAs ifade düzeyleri karşılaştırın. miRNAs bir P-değeri (Fisher'ın tam testi) &lt; 0,05 ve bir mutlak günlük2 değeri &gt; 2 differentially ifade olarak değerlendirilir.</li>
	<li>Bir antianlamlı oligonükleotid hedef site seçim aracı (TargetFinder)30 potansiyel tamamlayıcı mRNA'ların (miRNA hedef genleri) için varsayılan parametreleri altında differentially ifade miRNAs tahmin etmek için kullanın.</li>
	<li>Gen Ontoloji kullanın (miRNA hedef genlerin Ontoloji (GO) ortaya çıkarmak için zenginleştirme analitik araç31 desenler altında bir Pgidin) - 0,05 istatistiksel anlamlılık için eşik değeri.</li>
</ol>

<ol><li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004243">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://journals.tubitak.gov.tr/havuz/bot-1404-115.pdf">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li>
<li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014116000030">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li>
<li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/43/3/730.full">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li>
<li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/44/7/1978.full">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li>
<li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004115">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li>
<li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11099-012-0002-1">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li>
<li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004462">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li>
<li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+%28N%29+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li>
<li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.actahort.org/books/1086/1086_26.htm">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li>
<li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9759-6">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li>
<li>Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurnbull%2C+CG+%22Plant+Developmental+Biology%22">Plant Developmental Biology</a>. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li>
<li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root%2C+stem%2C+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+%28Solanum+tuberosum+L.%29+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).</li>
<li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li>
<li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li>
<li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li>
<li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13562-015-0334-6">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11738-016-2070-5">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li>
<li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li>
<li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359(2013).</li>
<li>Song, G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/294376070_Development_of_2JC-350_automatic_grafting_machine_with_cut_grafting_method_for_vegetable_seedling">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+%28triticum+aestivum+l.%29+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li>
<li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851(2014).</li>
<li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://sacan.biomed.drexel.edu/cmteditor/program/download?confname=ssdbm2013&pid=k2&file=paper">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li>
<li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+draft+genome+of+watermelon+%28Citrullus+lanatus%29+and+resequencing+of+20+diverse+accessions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gourdbase%3A+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+%28lagenaria+siceraria%29%2C+an+economically+important+cucurbit+crop%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306(2018).</li>
<li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25(2011).</li>
<li>Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://sourceforge.net/projects/mireap/">http://sourceforge.net/projects/mireap/</a> (2008).</li>
<li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TargetFinder%3A+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li>
<li>Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015).</li>
<li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423815303794">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok. Küçük RNA sıralama veri katılım numarası SRP136842 altında GenBank yatırılır.

Bu protokol için homo - ve heterografts arasında karpuz ve kabak şişe yapmak için son derece verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Belirli hiçbir ekipman gerektiren bu yöntem, çok kolay ve genellikle aşılama, çok yüksek sağkalım oranı vardır. Yöntem karpuz, salatalık ve kabak arasında Greftler diğer cucurbits için yapmak için kullanılabilir.
Bu göreli boyutunu (Yaş) anaç ve "Soy" başarılı greft (adım 2.2 Protokolü) yapmak için önemlidir dikkati ...

Aşılama uzun bir tarımsal Teknik olarak bitkisel üretim ve biyotik ve abiyotik stres1,2,3dayanıklılık geliştirmek için istihdam edilmiştir. Heterografting sistemleri, elit anaç bitkiler su ve besin alımını artırmak, toprak patojenleri direnç güçlendirmek ve Greftler an arttırmak görüşmek metal toksisitesi4,5, olumsuz etkilerini sınırlamak büyüme canlılık ve çevresel stresleri artan tolerans. Birçok durumda, heterografting aynı zamanda bahçecilik bitkiler, geliştirilmiş meyve lezzet ve sağlık ile ilgili bileşikler6,7' nin artan içerik için önde gelen meyve özellikleri etkileyebilir. Bu etki, RNA'ların, peptidler ve proteinler uzun mesafe transferi anaç ve scion arasında büyüme ve Kalkınma "Soy" bitkiler8,9 yeniden programlama oransal temel bir mekanizma olduğunu bulundu ,10. Aşılama yaygın uzun mesafeli sinyal ve ulaşım ile ilgili çevresel adaptasyon11çalışmalarda kullanılmıştır. Aşılama deneyler özellikle doku veya vasküler sap ve harekete geçirmek veya bastırma sinyal iletim12nedeniyle moleküler hedeflerin almayı iletilen molekülleri kesin tespiti için güçlüdür.
Sigara kodlama RNA'lar, önemli düzenleyici fonksiyonları olan hücrelerde sarfetmek RNA'ın büyük bir sınıf abiyotik stres13bitki adaptasyon kolaylaştırıcı bir rol oynamaya bildirilmiştir. miRNAs küçük RNA'ların yaklaşık 20-24 kodlamayan endojen nt. çalışmalar miRNAs bitki faaliyetlerin çeşitli yönlerini düzenleyici rolünü ortaya, bu büyüme, ateş gibi kök oluşumu14,15,16, lateral besin alımı, sülfat metabolizma ve homeostasis17ve yanıt biyotik ve abiyotik18stres. Son zamanlarda, miRNAs ve onların hedef genlerin ifade ile ilgili stres toleransı heterografted salatalık fidan19tuz. Üzüm intervariety Greftler içinde miRNA ifade kuraklık strese yanıt genotip bağımlı20bulundu.
Hızlı bir gelişim ve yüksek işlem hacmi sıralama teknolojinin maliyeti azalan çifçiliği bitkiler yönetmeliğinde miRNA incelenmesi için büyük bir fırsat sağladı. Karpuz (Citrullus lanatus [lanatus.] Mansf.), dünya çapında yetiştirilen bir önemli cucurbit kırpma düşük sıcaklıklara maruz kalabilir. Şişe kabak (kabak siceraria [Molina] Standl.) ile karpuz greft için çiftçiler tarafından yaygın olarak kullanılan bir daha iklim esnek cucurbit var. Çalışmada birincil amacı bir standart, verimli ve heterografts karpuz (Citrullus lanatus [lanatus.] arasında yapmak için uygun yöntem oluşturmaktır Mansf.) ve şişe kabak (kabak siceraria [Molina] Standl). Bu protokolü de detaylı bir deneysel düzeni ve analitik işlemleri aşılama, takip miRNA ifadeleri Yönetmeliği eğitim için heterografting avantajları yatan mekanizmaları ifşa için yararlı olduğu sağlar.
Bu çalışmada kullanılan bitki malzemeleri karpuz çeşidinde ve kabak şişe landrace içerir. Karpuz çeşidinde düşük sıcaklığa duyarlı ama yüksek verim ile ticari bir güçlendirilmiş olduğunu. Kabak şişe landrace karpuz, salatalık ve onun mükemmel toleransı düşük sıcaklıklar21nedeniyle kabak şişe aşılama için popüler bir anaç var.

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>RNA içermeyen DNaz I</td><td>Takara</td><td>D2270A</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Küçük RNA numune hazırlama Kiti</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polimeraz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>UEA sRNA tezgahı 2.4 bitki versiyonu&nbsp; (yazılım)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Rfam 11.0 veritabanı&nbsp;( web sitesi)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://rfam.janelia.org</td></tr><tr><td>miRBase 22.0&nbsp;( web sitesi)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://www.mirbase.org/</td></tr> <tr><td>MIREAP(yazılım)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td></tr> <tr><td>TargetFinder&nbsp;( yazılım)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://targetfinder.org/</td></tr></tbody></table>

homo - ve heterografts arasında karpuz ve kabak şişe soğuk duyarlı mikrorna'lar çalışma için oluşturma

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

MikroRNA (miRNAs) küçük RNA'ların yaklaşık 20-24 kodlamayan endojen nt, bitki geliştirme ve uyum önemli rollerde oynamak için bilinir. Bazı miRNAs ifadelerin aşılama zaman değişmiş gösterilen bir biriktirme kanıt biyotik ve abiyotik stres kırpma hoşgörü geliştirmek için çiftçiler tarafından yaygın olarak kullanılan bir tarım uygulamaları. Kabak şişe karpuz da dahil olmak üzere, için ikinci en çok kullanılan anaç birini işleme birçok diğer büyük cucurbits, göre doğal iklim esnek bir üründür. Yüksek işlem hacmi sıralama teknolojileri son gelişme soğuk duyarlı miRNAs ve onların katkıları heterograft avantajları için araştırmak için büyük fırsatlar sağlamıştır; henüz, yeterli deneysel prosedürler bu amaç için bir önkoşuldur. Burada, verimli bir şekilde homo - ve soğuk duyarlı karpuz ve soğuk dayanıklı kabak şişe, yanı sıra doku örnekleme, veri oluşturma ve veri analizi yöntemleri arasında heterografts oluşturmak için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Sunulan yöntemleri Ayrıca miRNA düzenlemeler altında ısı, kuraklık ve tuzluluk gibi çeşitli çevresel streslere sorgulaması için diğer bitki-aşılama sistemleri yararlıdır.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Şekil 2: oda sıcaklığında ve soğuk vurguladı koşulları çeşitli greft fenotipleri. (bir) Bu panel homo - ve heterografted fidan oda sıcaklığında denetimi olarak gösterir. (b) Bu panel soğuk tedavi 48 h sonra homo - ve heterografted fidan gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bi...

Burada verimli bir şekilde homo - heterografts karpuz ve kabak şişe, yanı sıra soğuk duyarlı mikroRNA'lar incelenmesi için doku örnekleme, veri oluşturma ve veri analizi yöntemleri arasında hazırlamak için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut.

Homo - ve Heterografts arasında karpuz ve kabak şişe soğuk duyarlı mikroRNA'lar çalışma için oluşturma

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Bu yöntem, miRNA'nın karpuz şişesi kagrgreftlerinde soğuk stres altında nasıl düzenlendiği gibi bitki greftlerinde stres yeteneğine miRNA yanıtındaki anahtar soruların yanıtlaşmasında yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı homo ve heterogreft yapmak için son derece verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem olmasıdır. Bu özel bir ekipman gerektirir, gerçekleştirmek için çok kolaydır, ve genellikle aşılama çok yüksek bir sağkalım oranı ile sonuçlanır.Bu yöntem sayesinde, karpuz şişesi kagr greft sisteminde soğuk strese miRNA yanıtı içine fikir sağlayabilir. Ayrıca yerel ve uzun mesafe miRNA ulaşım mekanizmaları ortaya çıkarmak için diğer modern organizmalara uygulanabilir. Aşılama adımlarını öğrenmek zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.Bu adım gelişmiş beceriler gerekli ve aşılı bitkilerin hayatta kalma anahtarıdır. Başlamak için, 58 santigrat derece su 500 mililitrelik bir kabın şişe kaınır tohumları ıslatın. Su sıcaklığı 40 santigrat dereceye düşene kadar zaman zaman tohumları karıştırın.Su soğurken, bir naylon torbaya üç kilo turba toprağı koyun ve otoklavlayın. Su oda sıcaklığına ulaştığında, tohumları damıtılmış suda 2-3 kez durulayın ve fazla suyu boşaltın. Tohumların karanlık büyüme odasında 28 santigrat derecede gazlı bez torbasında filizlenmelerine izin verin.Çimlenme sonra, sterilize turba toprak ile dolu plastik tencere içine tohumları ekin. Şişe kamış fidesi iki basık cotyledon geliştirdiğinde, bu işlemi karpuz tohumu ile tekrarlayın. Bir büyüme odasında şişe kaını ve karpuz fideleri büyütün.Öğleden sonra günde bir kez fidelere su ekleyin. Sonra, karpuz fidelerinin hipokotillerini cotyledonların 2-3 santimetre altında kesin. Yan şişe gourd fide üst kesin, hemen cotyledons yukarıda.Sonra kesilmiş şişe gourd fide üst bir delik yapmak için bir kürdan kullanın. Heterogreftler yapmak için deliğe kesilmiş karpuz fideleri yerleştirin. Bundan sonra, homogreftleri daha önce açıklanan yöntemi kullanarak hazırlayın.İlk olarak, nispeten yüksek nem korumak için şeffaf polietilen torbalar aşılanmış fideler sarın. Sonra yedi gün boyunca bir büyüme odasında sarılmış fideler korumak. Yedinci günden sonra, çanta kaldırmak ve bitkiler yedi ila 10 gün boyunca aynı koşullar altında büyümeye izin.Fideleri biri soğuk tedaviler, diğeri kontrol için olmak üzere iki gruba ayırın. Kontrol fidelerini aynı çevre koşullarına geri döndürün. Kontrol grubu ile aynı açık karanlık koşullarda altı derece santigrat ayarlanmış bir büyüme odasına soğuk işlenmiş fide yerleştirin.48 saat sonra, greftlerden scion ve anaç örnekleri bırakın. Numuneleri hemen sıvı nitrojenle dondurun ve eksi 70 derecede saklayın. Dondurulmuş numuneyi sıvı nitrojen içinde iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Her numune tüpüne paslanmaz çelik boncuk ekleyin ve dokuları ince bir tozla homojenize edin. Her aşılama kombinasyonu için, 10 fideden eşit miktarda zemin numunesi alın ve bunları 10 mililitrelik bir santrifüj tüpünde karıştırın. Guanidium hidroklorür reaktifuygun miktarda ekleyin.Daha sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derecede mililitre başına 1 ila 150 adet RNA içermeyen DNase ekleyin. Daha sonra mikrokapiller elektroforez sistemindeki toplam RNA miktarını belirleyin. Bundan sonra, kitaplık normalleştirme reaktifleri ve bağdaştırıcıları çözültün.Sonra beş asal ve üç asal adaptörleri ile küçük RNase ligate ve onları elute ve arındırmak. Üreticinin yönergelerine uygun olarak beş asal ve üç prime ligated küçük RNase ters transkripsiyonu. Ardından, üreticinin protokolünü izleyerek PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.Daha sonra RNA bütünlük numarasının yediden büyük olduğundan emin olmak için mikrocaillary elektroforez sistemini kullanın. RNA bütünlük sayısının yediden büyük olmasını sağlamak için bir RNA kütüphanesinin bir mikrolitresini mikrokapiller elektroforez sistemine yükleyin. Son olarak, küçük RNA kitaplıklarını yüksek bir iş elde sıralama aleti üzerinde sıralayın.Bu protokol kullanılarak aşılama için %98 sağkalım oranı ve oda sıcaklığı ve soğuk stres koşulları için fenotipler elde edilmiştir. 24 nükleotitin sRNA'ları, sıcaklık tedavisine bakılmaksızın tüm greftleme kombinasyonlarında en büyük sRNA sınıfını oluşturur. 48 saatlik soğuk tedaviden sonra sırasıyla 30 ve 268 mikroRNA yukarı ve aşağı düzenlenmiştir.Heterogreftlerde scion yapraklarında, tersine, anaç yapraklarında, 31 ve 12 mikroRNA'lar sırasıyla yukarı ve aşağı düzenlenirdi. Karpuz-karpuz homogreftlerinde sırasıyla 64 ve 83 mikroRNA'lar yukarı ve aşağı düzenlenmiştir. Bu, heterogreftlemenin mikroRNA ekspresyonlarının derin bir şekilde yeniden programlanmasına neden olduğunu göstermiştir.Bu işlemi denerken, kız sapının göreceli boyutunu ve yaşını hatırlamak önemlidir ve scion başarılı bir greft yapmak için çok önemlidir. Bu işlemden sonra lncRNA dizilimi, proteomik profilleme gibi diğer yöntemler de lncRNA ve proteinin düzenlenmesive aşılama sistemindeki kodlama sisteminin araştırılması için yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik Cucurbitaceae ve ötesinde bitki aşılama avantajı mekanizmasını keşfetmek için bitki abiyotik tolerans alanında araştırma için yol açtı.Guanidin hidroklorür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemin gerçekleştirilmesi nde her zaman uygun önlem alınması gerektiğini unutmayın.

generating-homo-heterografts-between-watermelon-bottle-gourd-for

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Bu videoda, transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır. Örnekte, CRISPR bazlarının gen düzenlemesi için bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonu göreceğiz.

Gonad Mikroenjeksiyonu: C. elegans'ın Germ Hattına Doğrudan Bileşik Verme Yöntemi

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Bu protokol, CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanarak çoklu gen nakavtları yaratmada özel olarak kullanılan bir kılavuz RNA konformemer vektörüne birden fazla tekli kılavuz RNA'yı klonlamak için gereken aşamaları açıklar. Bağırsak organoitlerinde çift nakavt üretimi bu yöntemin olası bir uygulaması olarak gösterilmiştir.

Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

Bu protokolün amacı, embriyonik doku aşılama teknikleri kullanılarak Cas9-mutajenize donör dokusundan elde edilen haploid forelimbs ile şimerik axolotls üretmektir.

Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi

Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Tilki kuyruğu mozaik virüsünün ve şeker kamışı mozaik virüslerinin mısır fidelerine aşılanması için Agrobacterium bazlı enjeksiyon (agroinjection) protokolü sunulmaktadır. Bu şekilde aşılama viral enfeksiyona, belirteç genlerinin virüs kaynaklı gen susturmalarına ve GFP'nin viral aşırı ekspresyonuna yol açar.

Rekombinant Foxtail Mozaik Virüs ve Şeker Kamışı Mozaik Virüs Bulaşıcı Klonlar ile Enjeksiyon ile Mısır Fidelerinin Doğrudan Agroinokokülasyonu

Bu protokol, fare yumurtalık kanalında bölgesel olarak kısıtlanmış CRISPR aracılı genom düzenlemesi için mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyonu tanımlar.

In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri

Bu çalışma, tatlı su elma salyangozu Pomacea canaliculata için stabil mutant hatların oluşturulması ve bakımı için bir iş akışı geliştirdi. Protokoller, zigotların toplanması, genom düzenlemesini teşvik etmek için CRISPR/Cas9 sistem bileşenleriyle mikroenjeksiyon, embriyoların ex ovo kültürü ve kontrollü çaprazlamalardan sonra genotipleme gibi konuları içerir.

Altın Elma Salyangozu Pomacea canaliculata: Zigotlardan Stabil Mutant Hatlara

Keşfedin karpuz ve kabak şişe arasında homo- ve heterograft oluşturma yöntemini. Bu verimli teknik, soğuk stresine yanıt veren mikroRNA'ları incelemek için kullanılır ve yüksek canlılık oranı sağlar.

Homo - ve Heterografts arasında karpuz ve kabak şişe soğuk duyarlı mikroRNA'lar çalışma için oluşturma

Daha fazla video keşfet