Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

Bu protokol, iskelesiz kardiyak doku oluşturma için bir araç olarak sferoidleri kullanan, üç boyutlu kardiyak doku oluşturma için yeni ve kolay küf tabanlı bir yöntemi tanımlar. Deneylerimizde, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler, insan kardiyak fibroblastları ve insan göbek veni endotel hücreleri olmak üzere üç tip hücre izole edildi ve bir hücre süspansiyonu oluşturmak için kullanıldı. 50 ML'lik konik bir tüpte% 70 kardiyomiyositler,% 15 fibroblastlar ve% 15 endotel hücreleri ile.

Daha sonra hücre süspansiyonunu, üç gün sonra yüzlerce çırpıcı sferoidin kendiliğinden oluşumuna neden olacak olan ultra düşük bağlantılı asılı bir damla sisteminin her bir oyuğuna dağıtıyoruz. Sferoidler daha sonra toplanır ve yeni bir kalıp boşluğuna oturtulur. Doku daha sonra birkaç gün boyunca inkübatördeki bir çalkalayıcı üzerinde orta dereceli steril bir kapta tutulur.

Kalıp daha sonra çıkarılır ve mekanik bütünlüğe sahip iskelesiz bir doku yaması ile sonuçlanır. Asılı bırakma cihazı, her biri 350 mikron çapında 850 mikro gözenekli yeniden kullanılabilir, ultra düşük bir bağlantı kuyusudur. Asılı damla, standart altı kuyulu plakalarla uyumludur.

Hücre süspansiyonunu yaptıktan sonra, asılı damla sisteminin her bir kuyucuğuna 10 milyon hücre içeren dört mililitre hücre süspansiyonu dağıtıyoruz. Cihazlar 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 nemde kültürlenir. 72 saat sonra, ortalama 350 mikron çapında kendiliğinden çırpma sferoidleri oluşumu gözlenir.

Sferoidler, asılı damla cihazını orta dereceli başka bir tabağa yerleştirerek ve sferoidleri serbest bırakmak ve asılı damla sisteminin altındaki gözeneklerden kaymalarına izin vermek için hafifçe döndürülerek hasat edilir. Bu, üç boyutlu, iskelesiz, kardiyak doku oluşturma için yeni kalıbın bir şemasıdır. Taşıma matı, doldurma tabanı ve yeni kalıp içerir.

Yeni kalıp, bir taban, bir alt kare plaka, bir alt ağ, ince paslanmaz çelik çatallarla yapılmış 10 kat yan ağdan oluşur. Bir üst ağ, bir üst kare plaka, tutma boruları ve durdurucu pimler. Yeni Kalıp sistemi, iki x iki milimetre, dört x dört milimetre ve altı x altı milimetre dahil olmak üzere farklı boyutlarda dokular oluşturabilir.

Taban alt kare plakası ve alt ağ, köşe direkleri kullanılarak istiflenir ve hizalanır. Daha sonra 10 kat yan ağ, bir çift steril forseps yardımıyla ince paslanmaz çelik tırnaklardan oluşan bir ağ oluşturmak için alternatif yönlerde istiflenir. Doldurma tabanı daha sonra, sferoidleri yeni kalıba oturtmadan önce yüzey gerilimini azaltmak için 1X fosfat tampon çözeltisi veya PBS ile yıkanır.

Yeni kalıp boşluğu aynı metan içinde ıslatıldıktan sonra, sferoidler istenen büyüklükte varsayılan boşluğa oturtulur. Oturduktan sonra, fazla ortam ağ kalıbından akar ve sferoidlerin önceden tanımlanmış boşluğun şeklini doldurmasına ve şeklini almasına izin verir. Üst ağ ve üst kare plaka daha sonra köşe direklerine monte edilir ve sferoidlerin yıkanmasını önlemek için durdurma pimleri ve tutma boruları sabitlenir.

Doldurulmuş yeni kalıp sistemi, altı milimetre B-27 takviyeli ortam ile altı kuyulu bir plakaya aktarılır ve daha sonra 30 ila 40 RPM'de yedi ila on gün boyunca sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübatörde tutulur. Kuluçka süresi, kalp yamasının boyutuna bağlı olarak değiştirilebilir. İnkübasyondan sonra sistem çıkarılır ve tutma borusu, tıpalar, üst kare plaka ve üst ağ çıkarılır.

Katmanlı yan ağlar daha sonra dokuyu bozmamaya özen gösterilerek dikkatlice tek tek kaydırılır. Tüm yan fileler çıkarıldıktan sonra, alt filenin üstünde sağlam bir kalp yaması elde edilir. Fonksiyonel senkron atım 24 saat içinde gözlenir.

Bu yeni kalıp tabanlı yöntem, minimum manuel çabayla üç boyutlu iskelesiz kardiyak dokular oluşturmanın verimli ve kolay bir yöntemidir. Elde edilen çok katmanlı dokular, tatmin edici yapısal bütünlüğe ve senkron çırpma davranışına sahip kaynaşmış sferoidlerden oluşur. Bu yeni kalıp bazlı yöntem, mühendislik dokularının mevcut biyo-fabrikasyon yöntemlerine uygun maliyetli ve ölçeklenebilir bir alternatif sunmaktadır.