Name: Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Öğrenin kalp doku mühendisliğinde iskele ücretsiz üç boyutlu doku oluşturma yöntemini. Sferoidleri kullanarak senkronize atış davranışı gösteren fonksiyonel kardiyak dokular geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar aşağıdaki finansman kaynağı kabul: Magic bu konularda Fonu kardiyovasküler araştırma için.

1. Cardiomyocytes hazırlanması
<ol><li>Kat 6-şey pilakalar ve membran matris ve kültür insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) daha önce17açıklandığı gibi.</li>
	<li>HiPSCs hiPSC-CMs içine önceden açıklanan yöntemleri18kullanarak ayırt etmek.</li>
	<li>16-18 d sonrası farklılaşma cardiomyocytes her şey 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 2 mL ile durulama tarafından kalsiyum ve magnezyum, kuluçka 1 mL/tripsin veya hücre ayrılma reaktif (bakınız tablo, bir de tarafından takip olmadan askıya alma Malzemeler) Oda sıcaklığında 5 min için.</li>
	<li>Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) B-27 (RPMI/B-27 hücre medya) ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) hücre medya eşit bir birim için. Yukarı ve aşağı pipet yapıştırılır hücreler gevşetmek için.</li>
	<li>10 mL serolojik pipet ile askıya alınmış cardiomyocytes toplamak ve 50 mL konik tüp aktarabilirsiniz.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 250 x g bir hücre Pelet elde etmek için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Pelet 10 mL RPMI/B-27 hücre medya resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon, 20 µL % 0,4 Trypan mavi çözüm eşit miktarda ile birleştirmek ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>El ile bir hemasitometre ve hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.</li>
</ol>2. fibroblastlar hazırlanması
<ol><li>Bir insan kalp fibroblast (HCF) (yetişkin ventrikül türü) hücre kültürünü daha önce16açıklandığı gibi kültürünü başlatın.</li>
	<li>HCFs onları tripsin veya hücre ayrılma reaktif uygun miktarda kuluçka tarafından askıya alma ( Tablo malzemelerigörmek) Oda sıcaklığında165 min için. Bir T175 şişesi için tripsin veya hücre ayrılma reaktif 10 mL kullanılmıştır.</li>
	<li>Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) orta eşit bir birimi kullanımı, sonra örnek 50 mL konik tüp aktarmak ve hücre süspansiyon 250 x g almak için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi bir Pelet.</li>
	<li>Pelet fibroblast büyüme orta 10 mL resuspend (bkz. Tablo malzeme).</li>
	<li>HCF hücre süspansiyon 20 µL % 0,4 trypan mavi çözüm eşit miktarda ile birleştirmek ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç veya el ile hemasitometre ve yeni hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.</li>
</ol>3. endotel hücreleri hazırlanması
<ol><li>17daha önce açıklandığı gibi bir insan göbek damar endotel hücre (HUVEC) çizgi kültürünü başlatın. HUVECs onları tripsin veya hücre ayrılma reaktif uygun miktarda kuluçka tarafından askıya alma ( Tablo malzemelerigörmek) Oda sıcaklığında173 dk için. Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) orta eşit bir birim için o zaman 50 mL konik tüp transferi ve hücre süspansiyon 250 x g bir Pelet elde etmek için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Not: 10 mL tripsin veya hücre ayrılma reaktif bir T175 şişesi için kullanıldı.</li>
	<li>Pelet endotel hücre büyüme orta 10 mL resuspend (bkz. Tablo malzeme).</li>
	<li>HUVEC süspansiyon 20 µL birleştirmek ve % 0,4 Trypan mavi çözüm eşit miktarda leke ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç veya el ile hemasitometre ve hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.</li>
</ol>4. açılan pulcuklarının asılı oluşturma
<ol><li>Asılı koyun steril 6-şey kalıplara 850 micropores (her çapı 350 µm) içeren açılan aygıt.</li>
	<li>Yukarıda açıklandığı gibi hücreleri üç tür izole: hiPSC-CMs, HCFs ve HUVECs. Onları RPMI/B-27 hücre medya mL başına 2,475,000 hücre bir konsantrasyon ile oranında % 70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs 50 mL konik tüp içinde birleştirir.</li>
	<li>Her şey bir 6-şey tabak içinde oturmuş damla sistemi (350 µm micropore çaplı) asılı Ultra düşük ek için hücre süspansiyon (mL başına 2,475,000 hücre) 4 mL dağıtmak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon içine asılı dağıtım 12 h içinde kendiliğinden pulcuklarının oluşturacak damla aygıt. Kültür toplam 72 h (3 d) 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem pulcuklarının olgunlaşma için devam ediyor.</li>
	<li>Kültür 72 h sonra asılı dibinde gözenekler yoluyla pulcuklarının hasat bırak sistem aygıt ile orta bir çanak içine yerleştirip yavaşça pulcuklarının asılı üzerinden yayın için dönen damla aygıt.</li>
</ol>5. 3-b yama oluşturma roman Net kalıp kullanarak
<ol><li>Kaidenin alt kare plaka alt net ve 10 katmanlı yan ağları bir çift steril forseps yardımıyla roman kalıp oluşturmak için monte edilir. İlk olarak, yığını hizalamak Bankası, alt kare plaka ve köşe mesaj kullanarak net alt. O zaman, yığını ve ince paslanmaz çelik dişleri bir ağ oluşturmak için talimatları dönüşümlü olarak 10 yan ağlar katman.</li>
	<li>PBS veya orta yüzey gerilimi azaltmak ve daha sonra birleştirilmiş kalıp doldurma Bankası üzerine aktarmak için temel dolgu floş.</li>
	<li>Net kalıp boşluğu ile PBS ya da aynı yöntemi ortamda ıslak. Yavaş yavaş pulcuklarının istediğiniz boyuta presupposed boşluğuna doldurun (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm veya 6 x 6 x 1 mm). Not: %120 pulcuklarının beklenen hacmi böylece hücre toplamları sıkı bağlantısı ve statik kalmak boşluğuna besleniyor emin olun.</li>
	<li>Üst net ve üst kare plaka köşe mesaj üzerine montajı ve stoper ve holding tüpler pulcuklarının fiyasko önlemek için güvenli.</li>
	<li>Dolgulu net kalıp sistemi 6-şey plaka ile 6 mL RPMI/B-27 hücre medya veya tüm birleştirilmiş kalıp karşılamak için yeterli orta ile steril bir kaba aktarın.</li>
	<li>6-şey plaka dolgulu kalıp sistemi üzerinde sallanan bir shaker ile 3.000-4.000 x g7-10 gün için kuluçkaya. Not: Kuluçka süresi kardiyak yamalar boyutu tarafından belirlenir. Daha büyük yamalar ile kuluçka süresi kardiyak yama olgunlaşma için arttırılması gerekecektir.</li>
</ol>6. düzeltme roman Net kalıp üzerinden kaldırılması
<ol><li>Kalıp sistemini medyadan kaldırıp steril işleme mat steril bir 10 cm tabak yerleştirin.</li>
	<li>Holding Metro, stoper, üst kare plaka ve üst net kaldırın. Dikkatle steril forseps ile bir çift katmanlı yan ağlar tek tek kaydırın. Decannulation sonra sağlam bir kalp yama belgili tanımlık dip net elde edilir.</li>
	<li>Net tabandan steril forseps kullanarak yama ile almak ve net alt 5 mL RPMI/B27 medya ile bir 35 mm çanak içine aktarın. Yavaşça yama net alttan yavaş yavaş yemek veya steril hücre sıyırıcı ile net dönen gevşetin. Net alttan dekolmanı sonra kalp dokusu ile RPMI/B27 medya kültürlü.</li>
	<li>35-mm çanak içinde yüzen 3-b kardiyak yama kuluçkaya devam'i tıklatın. Fonksiyonel zaman uyumlu dayak 24 h gibi erken kalıp kaldırılması sonra görülebilir.</li>
	<li>Yama net kalıp çıkarmadan sonra şekli bütünlüğü ve zaman ile zaman uyumlu dayak artar şiddeti ile korunur gözlemlemek. Not: Bileşen cardiospheres elektrik entegrasyon decannulation sonra 3-b net kalıp tabanlı kardiyak yamaları sergiledi. Biz 60 80 dakikada 60 günden fazla kalıcı arasında değişen bir dayak frekans gözlenen.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
<li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Microscale+Devices+to+3D+Printing%3A+Advances+in+Fabrication+of+3D+Cardiovascular+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues.</a> Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).</li>
<li>Tandon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+systems+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering.</a> Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).</li>
<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
<li>Lux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+large-scale+cardiac+patches+based+on+a+perfusable+starter+matrix+by+cyclic+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation.</a> Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix%3A+a+new+heart+muscle+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).</li>
<li>Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+seeded+with+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+promoted+the+regeneration+of+host+cardiomyocytes+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).</li>
<li>Caspi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+vascularized+cardiac+muscle+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.</a> Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-Free+Three-Dimensional+Bioprinting+of+Cardiac+Tissue+using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).</li>
<li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">3D culture for cardiac cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).</li>
<li>Langenbach, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+differentiation+of+microtissues+from+multipotent+precursor+cells+for+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture%3A+a+comparative+study+of+growth%2C+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntem önemi, tekrarlanabilirlik ve sonuç çok katmanlı kalp doku etkinliğini yatıyor. Kalp doku mühendisliği alanında, geçerli gol atan, çok katmanlı ve fonksiyonel 3-b kardiyak yamalar oluşturmak için bir yöntem belirlemektir. Biz cardiomyocytes, endotel hücreleri ve fibroblastlar içerebilen bir roman net kalıp içine oluşan pulcuklarının, doğrudan el ile tohum tarafından çok katmanlı kalp dokuları oluşturmak verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem raporu. Bu yöntemde kullanılan net kalıp çeşitli 6 x 6 x 1 mm için 2 x 2...

Geçerli kalp doku mühendisliği amacı değiştirebilir veya yapısı ve fonksiyonu yaralı miyokard doku1tamir için bir terapi geliştirmektir. 3-b kalp doku modelleri yerli kalp dokusunun önemli contractile ve elektrofizyolojik özellikleri sergileyen oluşturmak için yöntem hızla2,3genişletilmesi. Çeşitli stratejileri keşfedilmeyi ve çalışmalar4,5' te kullanılan. Bu yöntemler belirli sentetik ve doğal biyoaktif hydrogels, jelatin, kolajen, fibrin ve peptidler6gibi kullanımı ile arasındadır biyo-mürekkep ifade teknolojileri2 ve bioprinting teknolojileri7.
Bu iskele ücretsiz yöntemleri yabancı iskele malzeme8birleşmeyle dezavantajları olmadan biomaterial tabanlı yöntemi olarak karşılaştırılabilir doku üretebilir gösterilmiştir. Oren Caspi vd. , hücre türleri ortaklığın son derece bozukluklarına insan mühendislik kalp dokusu9nesil sağlar gösterdi. Çene ve ark. pulcuklarının kardiyak yama oluşturulması için 3-b bir yazdırma yöntemi geliştirdi. Sonuçta ortaya çıkan yamalar cardiomyocytes, fibroblastlar ve 70:15:15 oranı10endotel hücreleri oluşur. Pulcuklarının etkili "yapı taşları" İskele ücretsiz kalp doku yaratılış olarak onlar hipoksi karşı dirençli olması ve yeterli mekanik bütünlük implantasyon11,12sahip gösterilmiştir. Önceki çalışmalarda küresel oluşturmak için çeşitli imalat yöntemleri göstermiştir, idam kullanımı da dahil olmak üzere bırakma yöntemi, spinner şişeler13, mikrosıvısal sistemleri14ve yapışık olmayan kültür yüzeyler kaplamasız veya ile kaplı özel mikro-kalıpları15. Bu protokol için kullandığımız asılı pulcuklarının yüzlerce aynı anda yoğuşmalı için micropores içeren açılan aygıt.
Bu çalışmada bir roman ve el ile bir kare kalıp boşluğuna pulcuklarının tohum ve olgunlaşma için doku üzerinde bir shaker kuluçka içerir kalp doku oluşturmak için verimli iskele ücretsiz yöntemi sunar. Her zamanki gibi statik kültür koşullar altında oksijen difüzyon dış yönleri merkezi nekroz kaynaklanan doku yapısı ile sınırlıdır. Ancak, net kalıp ile medya için besin ve oksijen difüzyon artan sağlayan bir sürekli sıvı hareket ile kalıp içine seribaşı pulcuklarının daldırılır. Ayrıca, bu kalıp tabanlı yöntem farklı boyutta doku yamalar en az el ile çaba ile eşzamanlı oluşturulması için izin verir ve sonuç doku kalıptan kolayca kaldırılabilir. Bu roman yöntemi iskele-free, çok katmanlı kardiyak yamalar verimli ve tekrarlanabilir oluşturulması için izin verir.

<table><tbody><tr><td>İnsan Kardiyak fibroblastları (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 Bazal Besiyerine</td><td>Oluşur Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF kültür besiyeri</td></tr><tr><td>İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM + Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC kültür ortamı</td></tr><tr><td>E8 ortamı&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>HiPSC kültür besiyeri</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzimi (1X)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Tripsin ve Hücre ayrışması reaktifi</td></tr><tr><td>RPMI ortamı</td> B-27 takviyeli <td>invitrojen</td><td>11875093</td><td>RPMI ortamı hiPSC-CM kültür ortamıdır</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi (50x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>B-27 takviyeli RPMI ortamı hiPSC-CM kültür ortamıdır</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözelti,% 0.4</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Yeni ağ kalıbı ve nbsp;</td><td>TissueByNet Co., Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Asılı damla plakası</td><td>Kuraray Co., Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plakalar ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Bu iletişim kuralı bir roman ve üç boyutlu (3-D) kalp dokuları ek iskele malzeme olmadan oluşturmak için kolay net kalıp tabanlı yöntemini açıklar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes (IPSC-CMs), insan kalp fibroblastlar (HCFs) ve insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) izole ve hücre süspansiyon ile %70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs oluşturmak için kullanılır. Onlar aynı anda yüzlerce pulcuklarının yoğuşmalı için micropores içeren bir ultra düşük eki "asılı damla" sisteminde ortak kültürlenir. Hücreleri toplamak ve kendiliğinden dayak pulcuklarının ortak kültür 3 gün sonra oluşturur. Pulcuklarının roman kalıp boşluğuna tohumlari, hasat ve bir shaker kuluçka kültürlü. Pulcuklarının olgun fonksiyonel mendil tohum sonra yaklaşık 7 gün haline. Sonuç çok katmanlı dokuları yuvarlak pulcuklarının tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranış oluşur. Bu yeni yöntem gelecekte kalp yetmezliği tedavisi için tasarlanmış dokular oluşturmak için tekrarlanabilir ve düşük maliyetli bir yöntem olarak umut verici potansiyeli var.

Bizim deneylerde % 70 IPSC-CMs, HCFs ve % 15 HUVECs RPMI/B-27 hücre medya bir konsantrasyon mL başına 2,475,000 hücre, bir hücre süspansiyon kullanılmaktadır. Hücre süspansiyon oluşturduktan sonra biz protokol 4.3. adımında açıklandığı gibi her de açılan sistem, asılı Ultra düşük ek hücre süspansiyon 4 mL reçete. İdam kullanımı açılan sistem pulcuklarının 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem kültürünün 3 gün sonra dayak yüzlerce kendiliğinden oluşumu sonuçlandı. Pulcuklarının kolayca 4 ...

Bu iletişim kuralı tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranışı ile üç boyutlu iskele ücretsiz kalp doku oluşturmak için net bir kalıp tabanlı yöntemini açıklar.

Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Bu protokol, iskelesiz kardiyak doku oluşturma için bir araç olarak sferoidleri kullanan, üç boyutlu kardiyak doku oluşturma için yeni ve kolay küf tabanlı bir yöntemi tanımlar. Deneylerimizde, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler, insan kardiyak fibroblastları ve insan göbek veni endotel hücreleri olmak üzere üç tip hücre izole edildi ve bir hücre süspansiyonu oluşturmak için kullanıldı. 50 ML'lik konik bir tüpte% 70 kardiyomiyositler,% 15 fibroblastlar ve% 15 endotel hücreleri ile.Daha sonra hücre süspansiyonunu, üç gün sonra yüzlerce çırpıcı sferoidin kendiliğinden oluşumuna neden olacak olan ultra düşük bağlantılı asılı bir damla sisteminin her bir oyuğuna dağıtıyoruz. Sferoidler daha sonra toplanır ve yeni bir kalıp boşluğuna oturtulur. Doku daha sonra birkaç gün boyunca inkübatördeki bir çalkalayıcı üzerinde orta dereceli steril bir kapta tutulur.Kalıp daha sonra çıkarılır ve mekanik bütünlüğe sahip iskelesiz bir doku yaması ile sonuçlanır. Asılı bırakma cihazı, her biri 350 mikron çapında 850 mikro gözenekli yeniden kullanılabilir, ultra düşük bir bağlantı kuyusudur. Asılı damla, standart altı kuyulu plakalarla uyumludur.Hücre süspansiyonunu yaptıktan sonra, asılı damla sisteminin her bir kuyucuğuna 10 milyon hücre içeren dört mililitre hücre süspansiyonu dağıtıyoruz. Cihazlar 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 nemde kültürlenir. 72 saat sonra, ortalama 350 mikron çapında kendiliğinden çırpma sferoidleri oluşumu gözlenir.Sferoidler, asılı damla cihazını orta dereceli başka bir tabağa yerleştirerek ve sferoidleri serbest bırakmak ve asılı damla sisteminin altındaki gözeneklerden kaymalarına izin vermek için hafifçe döndürülerek hasat edilir. Bu, üç boyutlu, iskelesiz, kardiyak doku oluşturma için yeni kalıbın bir şemasıdır. Taşıma matı, doldurma tabanı ve yeni kalıp içerir.Yeni kalıp, bir taban, bir alt kare plaka, bir alt ağ, ince paslanmaz çelik çatallarla yapılmış 10 kat yan ağdan oluşur. Bir üst ağ, bir üst kare plaka, tutma boruları ve durdurucu pimler. Yeni Kalıp sistemi, iki x iki milimetre, dört x dört milimetre ve altı x altı milimetre dahil olmak üzere farklı boyutlarda dokular oluşturabilir.Taban alt kare plakası ve alt ağ, köşe direkleri kullanılarak istiflenir ve hizalanır. Daha sonra 10 kat yan ağ, bir çift steril forseps yardımıyla ince paslanmaz çelik tırnaklardan oluşan bir ağ oluşturmak için alternatif yönlerde istiflenir. Doldurma tabanı daha sonra, sferoidleri yeni kalıba oturtmadan önce yüzey gerilimini azaltmak için 1X fosfat tampon çözeltisi veya PBS ile yıkanır.Yeni kalıp boşluğu aynı metan içinde ıslatıldıktan sonra, sferoidler istenen büyüklükte varsayılan boşluğa oturtulur. Oturduktan sonra, fazla ortam ağ kalıbından akar ve sferoidlerin önceden tanımlanmış boşluğun şeklini doldurmasına ve şeklini almasına izin verir. Üst ağ ve üst kare plaka daha sonra köşe direklerine monte edilir ve sferoidlerin yıkanmasını önlemek için durdurma pimleri ve tutma boruları sabitlenir.Doldurulmuş yeni kalıp sistemi, altı milimetre B-27 takviyeli ortam ile altı kuyulu bir plakaya aktarılır ve daha sonra 30 ila 40 RPM'de yedi ila on gün boyunca sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübatörde tutulur. Kuluçka süresi, kalp yamasının boyutuna bağlı olarak değiştirilebilir. İnkübasyondan sonra sistem çıkarılır ve tutma borusu, tıpalar, üst kare plaka ve üst ağ çıkarılır.Katmanlı yan ağlar daha sonra dokuyu bozmamaya özen gösterilerek dikkatlice tek tek kaydırılır. Tüm yan fileler çıkarıldıktan sonra, alt filenin üstünde sağlam bir kalp yaması elde edilir. Fonksiyonel senkron atım 24 saat içinde gözlenir.Bu yeni kalıp tabanlı yöntem, minimum manuel çabayla üç boyutlu iskelesiz kardiyak dokular oluşturmanın verimli ve kolay bir yöntemidir. Elde edilen çok katmanlı dokular, tatmin edici yapısal bütünlüğe ve senkron çırpma davranışına sahip kaynaşmış sferoidlerden oluşur. Bu yeni kalıp bazlı yöntem, mühendislik dokularının mevcut biyo-fabrikasyon yöntemlerine uygun maliyetli ve ölçeklenebilir bir alternatif sunmaktadır.

a-net-mold-based-method-scaffold-free-three-dimensional-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokolde, kılcal kuvvet litografisi kullanılarak iki farklı polimerik malzemeden yapılmış biyomimetik kardiyak hücre kültürü substratının imalatını gösteriyoruz.  Açıklanan yöntemler, in vitro ve in vivo uygulamalar için makroskopik kardiyak dokuların yapısını ve işlevini tasarlamak için ölçeklenebilir, uygun maliyetli bir teknik sağlar.

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Hizalanmış miyokard doku nesil klinik açıdan yararlı amaçlar için kök hücre biyolojisi ile ilgili güncel gelişmeleri adapte için önemli bir gerekliliktir. Bu yazıda hücre şekli ve fonksiyonu hassas kontrolü için mikrokontak baskı yaklaşımı açıklar. Kardiyak progenitörler türetilmiş embriyonik kök hücre son derece saf popülasyonlarının kullanarak, biz sonra anizotropik fonksiyonel miyokard doku oluşturur.

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Bu çalışmalarda, biz rejeneratif çalışmalarda kullanılmak üzere yeni, yenidoğan murin kardiyak iskeleleri için bir yöntem sağlamak.

Yenidoğan Kardiyak iskeleleri: Rejeneratif Çalışmaları Roman Matrisler

Bu protokol, biyomalzemeler kullanılmadan kalp dokusunun 3D biyoprintini açıklamaktadır. 3D biyoprote edilmiş kalp yamaları bileşen küremsiklerin mekanik entegrasyonunu sergiler ve kalp dokusunun yenilenmesinde ve kalp hastalığının 3D modellerinde son derece umut vericidir.

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

Bu protokol, kalp hastalıkları için hücre implantasyon tedavisinin araştırılmasına olanak sağlamak için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen kardiyovasküler hücreleri içeren mesh şeklinde tasarlanmış kardiyak dokular üreder.

In Vivo Miyokardiyal Onarım için İnsan iPS Hücrelerinden Elde Edilen Örgü Şekilli Mühendislik Kardiyak Dokuların Hazırlanması

Burada, önceden ayırt edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücrelerinden oluşan 3D kendi kendine monte edilmiş kardiyak mikrotissue dizileri oluşturmak için kullanımı kolay bir metodolojiyi açıklıyoruz. Kardiyak mikrotissues üretmek için teknik gerektiren bu kullanıcı dostu ve düşük hücre, hastalık modellemesi ve ilaç gelişiminin erken aşamaları için uygulanabilir.

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Mühendislik dokuları, hayati besinleri ve gazları sağlamak ve metabolik atıkları gidermek için uygun vasküler ağlara büyük ölçüde güvenir. Bu çalışmada, endotel hücrelerinin ve destek hücrelerinin adım adım tohumlama protokolü, kontrollü bir 3D ortamda gelişen damar davranışını incelemek için yüksek verimli bir platformda son derece organize damar ağları oluşturur.

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF' ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

Hastaya özel modeller, cerrahi planlar geliştirirken veya öğrenirken cerrah ve arkadaş güvenini geliştirir. Üç boyutlu (3D) yazıcılar cerrahi hazırlık için yeterli ayrıntı üretir, ancak doku dokunsal doğruluğunu çoğaltamaz. Hastaya özgü, silikon kardiyak modellerin oluşturulmasını detaylandıran, 3D baskı hassasiyetini simüle edilmiş silikon doku ile birleştiren bir protokol sunulmaktadır.

Ameliyat Öncesi Planlarda ve Uygulamalı Eğitimde Uygulamalarla Hastaya Özgü Silikon Kardiyak Modellerin Oluşturulması

Eriyik elektrospinning yazma (MEW), polikaprolakton (PCL) iskeleleri ve fibrin hidrojelleri hiPSC türevi kardiyomiyositler ve fibroblastlarla birleştiren 3D miyokardiyal dokular oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Bu teknik, iskele mimarisi üzerinde hassas kontrol sağlar ve klinik öncesi ilaç testlerinde ve kalp hastalığı modellemesinde uygulanabilir.

Polikaprolakton İskelelerinin ve hiPSC'den Türetilmiş Kardiyak Hücrelerin Eriyik Elektrospinning Yazımı Kullanılarak 3D İnsan Miyokard Dokusu Üretimi

Öğrenin kalp doku mühendisliğinde iskele ücretsiz üç boyutlu doku oluşturma yöntemini. Sferoidleri kullanarak senkronize atış davranışı gösteren fonksiyonel kardiyak dokular geliştirin.

Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

Daha fazla video keşfet