Name: İnsanlaşmış NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) fare modeli HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Keşfedin, insanlaşmış NSG fare modeli oluşturma yöntemini HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için. Bu teknik, insan hematopoietik kök hücrelerinin intrahepatik enjeksiyonuyla güvenilir bir araştırma modeli sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal [numaraları R01AI29329, R01AI42552 ve R01HL07470 J.J.R. için vermek] Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [grant numarası P30CA033572 şehir umut bütünleştirici genomik desteklemek için Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir Analitik Farmakoloji ve analitik sitometresi çekirdek]. Aşağıdaki reaktif NIH AIDS araştırma ve başvuru reaktif Program, bölünme AIDS, NIAID, NIH elde edildi: HIV BaL virüs.

Tüm hayvan bakımı ve yordamları gözden geçirilmiş ve şehir, umut hayvan Kurulusları tarafından onaylanmış iletişim kuralları ve kullanım Komitesi (IACUC) (Dr. John Rossi, IACUC #12034) Bu çalışmada yürütücü tarafından düzenlenen göre gerçekleştirilmiş. İnsan fetal karaciğer dokusu gelişmiş Bioscience kaynaklardan (Alameda, CA), kar amacı gütmeyen bir organizasyon, federal ve eyalet düzenlemelerine uygun olarak elde edildi. Satıcının kendi kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) ve insan konu koruma gereksinimleriyle uyumlu. İnsan PBMCs atılan periferik kan örnekleri ile ilgili yaş, ırk, cinsiyet ya da etnik kimliği ile şehir umut kan bağış Merkezi (Duarte, CA), anonim sağlıklı donör etkilenmezsiniz. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. general içinde aseptik uygulama
<ol><li>Doku kültürü deneyleri belirlenen laminer akış kabinleri içinde gerçekleştirin.</li>
	<li>Doku kültürü orta ve takviyeleri Steril koşullar altında tutmak ve kullanmak için bir 0,22-µm filtrasyon ünitesi önceden kullanarak filtre uygulama.</li>
	<li>Steril tüpler hazır insan HSCs korumak ve buza enjeksiyon kadar tutun.</li>
	<li>Şiddetli bağışıklık yetersizliği sonucunda, aseptik NSG fareler başa. Tek kullanımlık cerrahi önlük, saç kap, yüz maskesi, galoş ve kontaminasyonu önlemek için eldiven giymek. Tezgah yüzeyine, ışınlama tutucu ve klor dioksit dayalı sterilant (Örneğin, Clidox) ile anestezi indüksiyon odası öncesi ve deney sonrası sterilize.</li>
	<li>Petrol bazlı göz merhem kuru göz önlemek için retro-orbital kanama sonra uygulanır.</li>
	<li>Değiştirmek için antibiyotik içeren diyet retro-orbital kanama nedeniyle enfeksiyonu önlemek için.</li>
</ol>2. işleme HIV virüsü, enfekte kemirgenler ve virüs içeren kan/doku örnekleri
Dikkat: 3. sınıf insan patojen HIV olduğunu; işleme kuralları tam olarak izlenmesi gerekir.
<ol><li>HIV virüsü içeren örneklerinde belirlenmiş bir BSL2 başa +/ 3 laboratuvar alanı. Virüs içeren reaktifler ikincil bir kap içinde güvenli bir şekilde taşıma sırasında kilitleyin. Tüm kapsayıcılara dış yüzeyinin % 10 çamaşır suyu ve isopropanol ulaşım önce ayrıntılı silerek dezenfekte.</li>
	<li>2-3 kat biyolojik atık torbaları ile belirlenen atık kaplarda tüm virüs içeren atıkların tutmak. Atık bertaraf önce cömertçe iyot/ethoxylated nonylphenol çözüm (Örneğin, Wescodyne) ve otoklav ile atık püskürtme dezenfekte.</li>
	<li>Kişisel koruyucu donanımları: saç kap, yüz kapağı, Anti-splash yüz kalkan, galoş, tek kullanımlık ameliyat elbisesi ve çift katmanlı eldiven.</li>
	<li>Çok dikkatli ile enfekte kemirgenler başa. Fareler (adım 5.1-5.2, 6,3-6.5, 7.3 ve 8.1 8.2) anestezi altında iken iğne ve kan koleksiyonları yürütmek.</li>
</ol>3. yalıtım hematopoetik kök hücre
<ol><li>Collagenase/dispase çözüm doku sindirim için hazırlayın.<ol>
<li>100 mg/mL konsantrasyonu hisse senedi çözüm yapmak collagenase/dispase toz geçiyoruz ve collagenase/dispase hisse senedi çözüm 150 µL aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Collagenase çözüm çalışmak için collagenase/dispase hisse senedi 150 µL ile RPMI % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin ile 1640 15 mL seyreltik. Not: Collagenase/dispase doku sindirim için son konsantrasyonu 1 mg/mL ' dir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril bir tıraş bıçağı ile Oda sıcaklığında 30 dakika collagenase/dispase çözüm (1 mg/mL) ile sindirim ardından fetal karaciğer dokusu (16-24 hafta gebelik) (yaklaşık 2-3 mm3 boyutunda) küçük parçalara kesilmiş. Böylece tüm doku parçaları tamamen sular altında sindirim çözüm ses düzeyini ayarlayın. Arka uç şırınga pistonu hafifçe sindirimi kolaylaştırmak için doku örneği öğütmek için kullanın.</li>
	<li>Sindirim karışımı bir tek hücre süspansiyon elde etmek için bir 70 µm steril naylon mesh filtreden geçmek.</li>
	<li>CD34 + HSCs bir Mac sistem üreticisinin yönerge başına kullanarak için zenginleştirmek.</li>
	<li>Zenginleştirilmiş CD34 + HSCs bir hemacytometer28 kullanarak uygun yüzdesi saymak ve neonatal NSG fareler içine intrahepatic enjeksiyon devam edin.</li>
	<li>Kalan zenginleştirilmiş CD34 + medya (Örneğin, CryoStor CS2) dondurma HSCs donma ve sıvı azot tankı hücreleri korumak. İleride kullanmak çözdürülen CD34 + HSCs enjeksiyon önceki uygulanabilir yüzdesi anlattıklarında. Ortam buz gibi kullanılmasıyla, arasında % 80-90 sonrası tezcan canlılığı var.</li>
</ol>4. yenidoğan NSG farelerde HSCs insan CD34 + intrahepatic enjeksiyon
Not: bağışıklık sistemleri tamamen engelliler için genç iken yarı-öldürücü doz, ışınlama dayanmak güçlü oldukları gibi Neonatal NSG fareler doğumdan 2-3 gün bu yordam için en uygundur. Anestezi yok HSC enjeksiyon için gereklidir.
<ol><li>Yenidoğan NSG fareler (genellikle 5-10 fareler, her iki cinsiyette) tüm çöp steril turta şekilli ışınlama kafese koyun ve 200-250 cGy Gama-ışın radyasyon toplam bir doz sezyum-137 radyasyon kaynağından bulaşmasına neden. Önemli kilo kaybı ya da ölüm bile NSG fareler için yüksek doz radyoterapi otelde sunulan görülebilir gibi bu radyasyon doz aralığı içinde olduğundan emin olun. 12 Not: Radyasyon bir sağlık tehlikesi, radyasyona karşı kişisel koruma alınmalıdır.</li>
	<li>Işınlama, her yenidoğan NSG fare 5 x 105 ile enjekte uygun insan CD34 + bir şırınga/iğne kurulumu (Şekil 1) kullanarak HSCs. Doğrudan hücre karaciğer enjekte.</li>
</ol>5. engraftment doğrulama Retro-Orbital kanama ve Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>10-12 hafta sonrası HSC enjeksiyon fareler bir isoflurane/oksijen solunum cihazı kullanarak anestezi. Oksijen akışı İsoflurane yüzde 4-%5 korumak için ayarlayın. Anestezi bireysel fare bağlı olarak 3-5 dakika sürer. Düzgün imzalat fareler bir yavaş ve derin nefes alma desen ve parmak pinching stimülasyon tepki vermiyor göster.</li>
	<li>50-100 µL periferik kan her fare retro-orbital örnekleme28ile toplamak. Kan örnekleri K2EDTA ya da heparinized kan toplama tüpler koagülasyon önlemek için saklayın. Not: Kan toplama tüpler için fare PBMCs-ebilmek var olmak tam kan Akış Sitometresi Analizi için yalıtılmış antikoagülan kaplama olması gereklidir. EDTA PCR ve qRT-PCR gibi Enzimatik reaksiyonları inhibe olduğu bilinmektedir; aşağı akım Enzimatik reaksiyonları gerekiyorsa, böylece, bir heparinized kan toplama aparatı kullanın.</li>
	<li>Kan örnekleri 2.000 x g de 4 ° C'de kan hücreleri cips için 20 dakika süreyle santrifüj kapasitesi.<ol>
<li>Sitokin analiz gerekli ise plazma supernatants yeni microcentrifuge tüpler Santrifüjü ve mağaza-80 ° C'de sonra aktarın.</li>
		<li>Kırmızı kan hücreleri (RBCs) içinde kan hücresi Pelet oda sıcaklığında 10 dakika kırmızı kan hücre lizis tampon (Tablo reçetesi) kullanarak parçalayıcı. Not: Plazma numuneleri gerekli değilse, doğrudan lizis çözüm olmadan Santrifüjü tam kan parçalayıcı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>300 x g de RBC lizis 4 ° C'de 5 dakika sonra kalan kan hücreleri cips; süpernatant Aspire edin. DPBS, 4 ° C'de 5 dakika santrifüj 300 x g de içeren % 0,01 BSA ile hücre topakları yıkama ve süpernatant Aspire edin. Çamaşır bir kez daha yineleyin.</li>
	<li>1 x engelleme 100 µL kokteyl tarifi için (Tablo 3 ) 4 ° C'de 20 dakikadır Hücrelerle taşı</li>
	<li>Engelleme sonra doğrudan bir konsantrasyon 2 µL/106 hücre, hücre süspansiyon içine her antikor çözüm ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya. Engraftment doğrulama için antikor vardır: Anti-insan CD45 (lökosit, RRID: AB_2732068), Anti-insan CD3 (T-hücreleri, RRID: AB_396896), Anti-insan CD4 (yardımcı T hücreleri, RRID: AB_397037), Anti-insan CD8 (sitotoksik T hücreleri, RRID: AB_2722501), Anti-insan CD14 (monosit, RRID: AB_10373536) ve anti-insan CD19 (B-hücreleri, RRID: AB_10373382). Önerilen akışı panel için Tablo 4 ve Tablo reçetesi katalog numaraları, RRIDs ve lot numaraları için lütfen bakın. Not: Çözüm engelleme antikor boyama non-spesifik bağlama fare yüzey işaretleri doğru anti-insan antikorların ortadan kaldırır, çeşitli yüzey imleyicileri Homoloji insan arasında paylaşmak ve fare.</li>
	<li>İnsan PBMCs sağlıklı bağışçılardan yalıtmak ve tek lekeli akış sitometresi tazminat kontroller arıtılmış insan PBMCs. alternatif olarak kullanarak hazırlamak, tazminat29kontrolleri gibi floresan etiketli mikroküreler kullanın.</li>
	<li>Akış Sitometresi kullanarak periferik kan örnekleri analiz ve insan CD45 + hücreleri, insan CD3 + hücreleri, insan CD14 + hücreleri ve insan hücreleri CD19 + toplam periferik kan hücreleri yüzdesi ölçmek.<ol>
<li>Aşağı akım HIV enfeksiyonu ve gecikme süresi çalışmalar için T hücreleri CD4 + ve CD8 + T-hücrelerin CD3 + hücrelerin içindeki yüzdesini hesaplamak. Not: Genellikle, HIV enfeksiyonu30önce CD4:CD8 oranı 1,5 ve 2,5 arasında görülmektedir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. analiz HIV enfeksiyonu hu-NSG fareler ve plazma Viral yük qRT-PCR kullanarak
<ol><li>İnsan PBMCs sağlıklı bağışçılardan HIV BaL viral stok yaymak, hasat 10 gün sonrası enfeksiyon ve titre p24 kullanarak ELISA kiti31.</li>
	<li>Seçme hu-NSG fareler ile % 20'den fazla insan CD45 + HIV enfeksiyonu için periferik kan hücreleri.</li>
	<li>Hu-NSG fareler isoflurane/oksijen solunum aparatı (adım 5.1) kullanarak anestezi.</li>
	<li>Hayvan anestezi, teyit sonra 200 doz, HIV BaL virüs enjekte p24 mayi rota üzerinden fare başına ng. Not: iğne ile son derece dikkatli olun, değil iğne yeniden ve hemen sonra kullanım belirlenen keskin konteyner içine atmak. Virüs yönetim sonra enjeksiyon alanı dezenfekte.</li>
	<li>Üç hafta sonrası enfeksiyon, hu-NSG fareler anestezi ve retro-orbital ile periferik kan toplamak kullanarak kanama heparinized kılcal tüpler ve koleksiyon tüpler.</li>
	<li>Ayrı plazma ve kan hücreleri tarafından 2.000 x g de Santrifüjü 20 dakikadır.</li>
	<li>RBCs. blok parçalayıcı ve kalan kan hücreleri antikorları için Akış Sitometresi Analizi (Bölüm 5.3-5,8) ile leke. Not: Akış Sitometresi Analizi öncesi ve sonrası enfeksiyon CD4:CD8 oranı karşılaştırma üzerinde odaklanmalıdır. CD4 + hücre sayısı önemli azalma bekleniyor, CD4 antijeni viral giriş için ortak bir reseptör olarak hizmet vermektedir.</li>
	<li>HIV viral analiz etmek için kullanım plazma numuneleri qRT-PCR kullanarak yükleyin. Plazma numuneleri bir viral RNA mini kit kullanarak üzerinden viral RNA yalıtmak. QRT-PCR HIV-1 lt. özgü astar ile gerçekleştirmek ve sonda ayarlar ( Tablo 5sıra ayrıntılarda), üreticinin iletişim kuralını kullanarak.</li>
</ol>7. oral yönetim sepeti ve doğrulama, Viral bastırma (isteğe bağlı)
Not: Bu akut enfeksiyon aşamasında HIV prognoz, Viroloji veya enfeksiyon ile ilgili patofizyolojisi ile ilgili araştırmalar için isteğe bağlı bir adımdır. HIV enfekte hu-NSG sepeti tedavisi HIV gecikme insan hasta arabası alma özetlemek için kullanılır. Başarıyla HIV enfekte hu-NSG fareler sepeti 4 hafta süreyle verilir. Sepeti rejimi tenofovir disoproxil fumarat (TDF; 300 mg/kapsül), emtricitabine (MTK; 200 mg/kapsül) ve raltegravir (RAL; 400 mg/kapsül) oluşur. HIV enfekte hu-NSG fareler tedavisi için sepeti doz vücut yüzey alanı (Tablo 1, denklem 1, Tablo 2)32göre ayarlanır.
<ol><li>Su şişesi, fareler her kafes sayısı ve ortalama bir fare başına 4 mL ve su alımı günlük hacmi dikkate alınarak tedavinin bir hafta boyunca her kafes için gerekli her ilaç miktarını hesaplamak. Not: Bu adımda anahtar nokta her fare onun günlük doz 4 mL içme suyu içinde edinme sağlamaktır.</li>
	<li>Tüm üç ilaçlar ayarlanmış dozlarda ince toz haline eziyet ve şekerli su (Örneğin, Medidrop Suralose) toz karışımı geçiyoruz. Su şişesi her hafta taze çözünmüş sepeti şekerli su verilen kokteyl ile değiştirin. Not: Uyuşturucu toz olmayabilir hemen çözülür, holding kafese şişe döndürmeden önce homojen bir süspansiyon ulaşmak için şiddetle çalkalanır.</li>
	<li>Retro-orbital iki haftada kanama ile periferik kan örnekleri toplamak ve her ikisi de CD4:CD8 oranı akış sitometresi (Bölüm 5.3-5,8) ve qRT-PCR (Bölüm 6,6) kullanarak plazma viral yük kullanarak çözümleyebilirsiniz. Not: Genellikle tedavi 4 hafta sonra plazma viral yük için algılama sınırın altına azalır ve tipik CD4:CD8 oranı geri yüklenir.</li>
</ol>8. Viral Rebound sepeti çekilme (isteğe bağlı) üzerine doğrulama
Not: viral rebound sepeti çekilmesi üzerine doğrudan bir gecikme süresi rezervuar kanıtı olarak bu adımı gecikme süresi modeli doğrulanırken kritik olur. Ayrıca HIV rebound suppressants üzerine tedavi araştırmalar için bir denetim deney olarak hizmet etmek için önerilir.
<ol><li>Sepeti çekilmesi için periferik kan örneklerinden plazma viral yük algılama sınırın altına ve CD4:CD8 oranı 1,5 ve 2,5 arasında bir Aralık için geri yüklendikten sonra planı.</li>
	<li>Retro-orbital sepeti çekilmesinden sonra 2 haftada kanama ile periferik kan örnekleri toplamak. Yakından plazma viral yük (Bölüm 6,6) değişikliği CD4:CD8 oranı (Bölüm 5.3-5,8) yanı sıra monitör.</li>
</ol>

<ol><li>Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCID+mouse+models+of+human+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">SCID mouse models of human stem cell engraftment.</a> Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nature. 32 (4), 364-372 (2014).</li>
<li>Walsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mouse+Models+of+Clinical+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Humanized Mouse Models of Clinical Disease.</a> Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+immune+system+investigation%3A+progress%2C+promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nature reviews. Immunology. 7, (2007).</li>
<li>Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+in+HIV+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells in HIV infection and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).</li>
<li>McCune, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCID-hu+mouse%3A+murine+model+for+the+analysis+of+human+hematolymphoid+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function.</a> Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).</li>
<li>Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+functional+human+immune+system+to+mice+with+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency.</a> Nature. 335, 256(1988).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).</li>
<li>Ohbo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+hematopoiesis+in+mice+with+a+truncated+mutant+of+the+interleukin-2+receptor+gamma+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain.</a> Blood. 87 (3), 956-967 (1996).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2Fgamma%28c%29%28null%29+mouse%3A+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Ishikawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+human+blood+and+immune+systems+in+NOD%2FSCID%2FIL2+receptor+%7Bgamma%7D+chain%28null%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice.</a> Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+the+functions+of+human+B+and+T+cells+in+humanized+NOD%2Fshi-scid%2Fgammac%28null%29+%28NOG%29+mice+%28hu-HSC+NOG+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+immunology%22%5BJournal%5D)">The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice).</a> International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).</li>
<li>McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+cord+blood+engraftment+between+immunocompromised+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains.</a> Blood. 116 (2), 193-200 (2010).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nature. 9 (7), 959-963 (2003).</li>
<li>Melkus, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nature medicine. 12, 1316(2006).</li>
<li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus%2Fliver+and+CD34%2B+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li>
<li>Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/299390362_Humanized_Mice_in_Translational_Immunology">Humanized Mice in Translational Immunology.</a> Translational Immunology. , 285-326 (2016).</li>
<li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2710598/">Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC.</a> Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).</li>
<li>Halkias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+aspects+of+human+T-cell+development+and+migration+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice.</a> Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).</li>
<li>Satheesan, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29343582">HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART.</a> Journal of virology. , (2018).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-targeted+aptamer-siRNA+conjugate-directed+transcriptional+regulation+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1.</a> Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+RNA+aptamer+against+human+CCR5+specifically+targets+HIV-1+susceptible+cells+and+inhibits+HIV-1+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity.</a> Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).</li>
<li>Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+highly+active+antiretroviral+therapy+%28HAART%29+in+patients+with+advanced+HIV+infection%3A+impact+on+medical%2C+palliative+care%2C+and+quality+of+life+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pain+and+symptom+management%22%5BJournal%5D)">The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes.</a> Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).</li>
<li>Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+of+Finding+a+Cure+for+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection.</a> Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).</li>
<li>Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoirs+and+latency+models%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV reservoirs and latency models.</a> Virology. 411 (2), 344-354 (2011).</li>
<li>Van Herck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sampling+from+the+retro-orbital+plexus%2C+the+saphenous+vein+and+the+tail+vein+in+rats%3A+comparative+effects+on+selected+behavioural+and+blood+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables.</a> Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).</li>
<li>Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+12-color+flow+cytometry+panel+to+study+lymphocyte%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+subsets+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans.</a> Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).</li>
<li>Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%3ACD8+ratio+as+a+frontier+marker+for+clinical+outcome%2C+immune+dysfunction+and+viral+reservoir+size+in+virologically+suppressed+HIV-positive+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+International+AIDS+Society%22%5BJournal%5D)">CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients.</a> Journal of the International AIDS Society. 18, 20052(2015).</li>
<li>van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+HIV-1+on+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells.</a> Nature protocols. 3, 363(2008).</li>
<li>Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+translation+from+animal+to+human+studies+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dose translation from animal to human studies revisited.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).</li>
<li>Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+approaches+to+the+study+of+HIV-1+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental approaches to the study of HIV-1 latency.</a> Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).</li>
<li>Marsden, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Latency+in+the+Humanized+BLT+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">HIV Latency in the Humanized BLT Mouse.</a> Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).</li>
<li>Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT+humanized+mice+as+a+small+animal+model+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection.</a> Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).</li>
<li>Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+strategies+for+HIV-1+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Developing strategies for HIV-1 eradication.</a> Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).</li>
<li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transcription+and+latency%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67(2013).</li>
<li>Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+stem+cell+memory+T+cells+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+hematology+%26+oncology%22%5BJournal%5D)">The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies.</a> Journal of hematology & oncology. 8, 113(2015).</li>
<li>Chun, T. -W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).</li>
<li>Redel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+regulation+of+latency+in+the+monocyte-macrophage+lineage+and+in+CD4%2B+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes.</a> Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).</li>
<li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+the+Latent+Reservoir+for+HIV-1+Using+a+Viral+Outgrowth+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay.</a> PLoS pathogens. 9 (5), e1003398(2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ifşa.

İmmün fare insan hücreleri/dokusu ile engrafted insan benzeri fizyolojik özellikleri sunmak ve insan özgü hastalıklar ile ilgili patoloji, patofizyolojisi ve İmmünoloji çalışmalar için çok büyük bir değeri vardır. İmmün fareler, NOD birden fazla suşları arasında. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modelidir en immünyetmezligi3,12,19 sinyal ablated fare özgü sitokin yanı sıra doğuştan gelen ve edinilmiş bağı...

İnsan hastalıkları uygun hayvan modellerinde kurulması için bir çare bulma anahtar olduğundan, uygun hayvan modelleri uzun edilmiş takip ve zaman içinde geliştirilmiş. Birden fazla immün fare modelleri suşların engraftment insan hücreleri ve/veya doku ve insanlaşmış işlevleri1,2sonraki yürütülmesine izin veren geliştirdik. İnsanlaşmış fare modelleri gibi insan özgü hastalıklar3,4,5araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
Edinilmiş bağışıklık yetersizliği Sendromu (AIDS) enfeksiyon human Immunodeficiency virus (HIV) ile sonuçlanan bir örnektir. İnsanlaşmış fare modelleri kurulması önce etik ve teknik sınırlamalar HIV/AIDS preklinik hayvan çalışmaları insan dışı primatlar3sınırlı. Ancak, yüksek gider ve bu tür hayvan için özel bakım için gereksinimleri normal akademik ayarlar çalışmalarda HIV/AIDS engel. HIV öncelikle insan CD4 + T-hücreleri bozar ve gelişme ve bağışıklık yanıtı B-hücreler, makrofajlar ve dendritik hücreleri6gibi diğer insan bağışıklık hücrelerinin etkiler; Bu nedenle, fonksiyonel insan bağışıklık sistemleri ile nakledilen küçük hayvan yüksek talep modellerdir.
Bir atılım CB17 -scid fareler Prkdcscid mutasyon ile geliştirilmiş olup, insan bağışıklık sistemi1' in başarılı engraftment gösterdi otelde 1988'de geldi. Arızalı T ve B hücre fonksiyonları Prkdcscid mutasyon sonuçlarında ve farelerde ablated edinilmiş bağışıklık sistemi, böylece insan periferik engraftment etkinleştirme kan mononükleer hücreler (PBMCs), hematopoetik kök hücre (HSCs), ve Fetal hematopoetik doku7,8. Yine de, engraftment seviyesinin düşük sık sık bu modelde gözlenen; olası nedenleri şunlardır 1) kalan doğuştan gelen bağışıklık etkinlik doğal öldürücü (NK) yolu ile modüle-hücreleri ve 2) fare T ve B hücreleri (leakiness)5son aşama geliştirilmesi. Obez olmayan diyabetik (NOD) sonraki gelişimi-scid fare modeli elde dramatik aşağı-Yönetmeliğin NK hücre faaliyet; Böylece, daha yüksek bir seviyeye ve insan bağışıklık sistemi bileşenleri9daha fazla sürdürülebilir engraftment desteklemek yapabiliyor. Daha fazla bastırmak veya kesilmesi veya interleukin-2 reseptör γ-zinciri (Il2rg) Toplam nakavt (sallama) taşıyan fare modelleri doğuştan gelen bağışıklık, gelişimine engel -scid arka plan kuruldu. Il2rg, olarak da bilinen ortak sitokin reseptör γ-zinciri, çeşitli sitokin reseptörleri10,11,12,13, vazgeçilmez bir bileşenidir. Suşları başını sallamak gibi. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) ve NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (takoz) mevcut fare sitokin sinyal sağlam bozulma ve tam ablasyon NK hücre gelişimi içinde edinilmiş bağışıklığın14,15,16ağır bozukluğu için ek.
Mutasyon ve Il2rg nakavt scid taşıyan üç insanlaşmış fare modelleri sık HIV/AIDS araştırma istihdam edilmektedir: BLT (kemik iliği/karaciğer/timus) model PBL (periferik kan lökosit) model ve SRC (SCID kullanıma hücre) modeli 3. BLT modeli insan fetal karaciğer ve timus fetal karaciğer HSCs3,17,18İntravenöz enjeksiyon ile eşlik fare böbrek kapsülü altında cerrahi nakli yoluyla oluşturulur. BLT fare modeli yüksek engraftment yeterlik, Bütün soy insan hematopoetik hücrelerin gelişimi ve güçlü bir insan bağışıklık sistemi kurulması sunar; Ayrıca, T-hücreleri bir insan otolog timus eğitimli ve HLA-sınırlı bağışıklık yanıtı4,5,17,19sergi. Ancak, cerrahi işlemler gereksinimini BLT modelinin önemli dezavantajı kalır. PBL fare modeli ile insan periferik lenfoid hücreleri Intravenöz enjeksiyon tarafından kurulmuştur. PBL modeli kolaylık sunuyor ve başarılı T-hücre engraftment verir, ancak uygulama yetersiz B-hücre ve myeloid hücre engraftment, düşük engraftment seviyeleri genel ve ağır graft - versus - host hastalığı (GVHD)3 başlangıçlı nedeniyle sınırlıdır ,20. SRC fare modeli insan HSCs enjeksiyonuyla yeni doğan veya Genç Yetişkin SCID fareler içine kuruldu. Bu ortalama engraftment verimliliği % 25 (periferik kan CD45 yüzde değerlendirildi) yukarıda sergiler ve enjekte HSCs çoklu-lineage gelişimi ve doğuştan gelen bir insan bağışıklık sistemi hazırlama destekler. Ancak, SRC model T hücreli yanıt olduğunu fare olduğunu H2 tarafından kısıtlanmış insan HLA-sınırlı14,21yerine kısıtlamasıdır.
SRC fare modeli tarafından bir insan bağışıklık sistemi ve başarılı hematopoetik geliştirme engraftment tutarlı örneği preklinik HIV/AIDS küçük hayvan çalışmaları için facile ve güvenilir bir model olarak kabul edilir. Biz daha önce bir NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) fare modeli kurulması bildirdi ve HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları22,23,24kendi uygulamasında açıklanan. Bu hu-NSG fare modeli kemik iliği posta, HIV enfeksiyonu duyarlılık düzeyi yüksek ve HIV enfeksiyonu ve Patogenez Rekapitülasyon sergiler. Ayrıca, hu-NSG fare modeli uygun şekilde Kombinatorik antiretroviral tedavi (sepeti) yanıt verir ve plazma viral rebound sepeti çekilmesi, bir HIV gecikme süresi rezervuar25,26 kurulması teyit üzerine tablodur ,27. Bu HIV gecikme süresi rezervuar daha fazla insan CD4 + T-hücreleri enfekte ve sepeti tedavi hu NSG fareler izole dinlenme tarafından indüklenen çoğaltma yetkili HIV virüs ex vivo üretim tarafından kanıtlanmış.
Burada, yenidoğan NSG fare gecikme süresi Kalkınma HIV enfeksiyonu ve sepeti tedavisi ile ilgili yordamları da dahil olmak üzere, hu-NSG fare modelinden kurulması için detaylı protokolü açıklar. Yeni HIV hayvan çalışmaları HIV Viroloji, gecikme süresi ve tedavi ile ilgili yaklaşımlar sunar için bu iletişim kurallarını bekliyoruz.

<table><tbody><tr><td>CD34 Mikro Boncuk Kiti, insan</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-046-703</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS2</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07932</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>005557</td><td>Deneysel fareler yerine yetiştiriciler sipariş</td></tr> edin <tr><td>IsoFlo</td><td>Patterson Veteriner</td><td>07-806-3204</td><td>Hayvan tesisi aracılığıyla sipariş, kısıtlı ürün</td></tr><tr><td>Clidox dezenfektan</td><td>Fisher Sicentific</td><td>NC9189926</td><td></td></tr><tr><td>Wescodyne</td><td>Fisher Sicentific</td><td>19-818-419</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 80508 şırınga / iğne</td><td>Hamilton</td><td>80508</td><td>Özel yapım</td></tr><tr><td>Kan alma tüpü (K2EDTA)</td> <td>BD Bioscience</td><td>367843</td> Kan alma tüpü (Heparin) BD Bioscience 365965 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kılcal tüp (Heparinize edilmiş)</td> <td>Fisher Sicentific</td><td>22-362574</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast VIrus 1 adımlı Master Mix</td><td>Thermofisher</td><td>4444434</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 P24 ELISA (5 Plaka kiti)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>İnsan serumundan IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506-100MG</td><td></td></tr><tr><td>IgG fare serumu</td><td>Sigma Aldrich'ten</td><td>I5381-10MG</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Fare Anti-İnsan CD45 (klon HI30)</td><td>BD Biosciences</td><td>564586</td><td>RRID: AB_2732068, LOT 6347696</td></tr><tr><td>PE-CY7 Fare Anti-İnsan CD3 (Klon SK7)</td><td>BD Biosciences</td><td>557851</td><td>RRID: AB_396896, LOT 6021877</td></tr><tr><td>Pasifik Mavi Fare Anti-İnsan CD4 (Klon RPA-T4)</td><td>BD Biosciences</td><td>558116</td><td>RRID: AB_397037, LOT 6224744</td></tr><tr><td>BUV395 Fare Anti-İnsan CD8 (Klon RPA-T8)</td><td>BD Biosciences</td><td>563795</td><td>RRID: AB_2722501, LOT 6210668</td></tr><tr><td>APC-Alexa Fluor 750 Fare Anti-İnsan CD14 (TuK4)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1427</td><td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan CD19 (SJ25-C1)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1904</td><td>RRID: AB_10373382, LOT 1725304B</td></tr></tbody></table>

İnsanlaşmış nod/scid/il2rγnull (hu-nsg) fare modeli hiv çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Etik kuralları ve teknik sorunlar için araştırma insan patoloji, immünoloji ve terapötik geliştirme küçük hayvan modelleri yüksek talep soktuk. Yakın bir genetik ve davranışsal benzerlik ile insanlar, fare gibi küçük hayvan insan hastalık modelleri, hangi aracılığıyla insan benzeri belirtiler ve yanıt-e doğru recapitulated için iyi adaylardır. Ayrıca, fare genetik arka plan çeşitli talepleri karşılamak için değiştirilebilir. NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) fare en çok kullanılan immün fare suşları biridir; engraftment ile insan hematopoetik kök hücre ve/veya insan doku ve işlevsel bir insan bağışıklık sisteminin sonraki geliştirme sağlar. Bu prognoz ve insan özgü hastalıklar HIV/AIDS gibi Patofizyoloji anlama ve tedavi için arama yardım önemli bir kilometre taşıdır. Burada, hematopoetik kök hücre transplantasyonu radyasyon şartına yenidoğan NSG fare içine tarafından bir insanlaşmış NSG fare modeli (hu-NSG) oluşturmak için ayrıntılı bir protokol rapor. Hu-NSG fare modeli çoklu soy gelişme HIV-1 viral enfeksiyon duyarlılık ve transplante insan kök hücreleri gösterir. Ayrıca Kombinatorik antiretroviral tedavi (sepeti) karşılık olarak anahtar biyolojik özellikleri beyannamedir.

Akış Sitometresi Analizi sık izole HSCs saflığı doğrulamak, engraftment seviyesini, viral enfeksiyon, profil bağışıklık yanıtlarını ve sepeti etkinliği anket yapılır. Tipik antikor panelinde 4-6 bireysel fluorescently etiketli antikorlar bulunur; Böylece, bir akış sitometresi birden çok lazerler ve filtreleri geniş bir seçki ile doğru sonuçlar elde edilmesi için önemlidir.
</str...

Bu iletişim kuralı radyasyon şartına yenidoğan NSG fareler içine insan hematopoetik kök hücre intrahepatic enjeksiyon yoluyla insanlaşmış fareler (hu-NSG) kurmak için bir yöntem sağlar. Hu-NSG fare duyarlı HIV enfeksiyonu ve kombinatorik antiretroviral tedavi (sepet) ve HIV çoğaltma ve gecikme süresi incelemeler için uygun bir patofizyolojik model olarak hizmet vermektedir.

İnsanlaşmış NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) fare modeli HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Bu konular, HIV/AIDS araştırmalarında, hiv enfeksiyonunun moleküler mekanizması ve prognozu ve gecikme rezervuarının nasıl ve nerede kurulduğu gibi temel soruların yanıtlatılanına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı non-invaziv olmasıdır, ve HIV enfeksiyonuna duyarlı ve cART duyarlı olan nakledilen insan kök hücreleri üzerinde bir çok soy gelişimi tedavi etmek gerekir bir hu-NSG fareler kurdu. Sindirilmiş, insan, fetal, karaciğer dokusu, bulamaç örneğini steril, 70 mikrometre, naylon, örgü süzgeç üzerinden filtreleyerek tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için başlayın ve üreticinin talimatlarına göre manyetik aktif hücre sıralaması ile CD34+HSC'ler için zenginleştirin.Saydıktan sonra, hsc'yi buzdaki taze DPBS'de mililitre konsantrasyonu başına iki kez-on-yedinci canlı hücrelerde yeniden askıya alın. Sonraki yer steril içine bir bütün neonatal insan NOD / SCID / gama veya NSG fare çöp, pasta şeklinde, ışınlama kafesi, ve bir sezyum-137 radyasyon kaynağından gama ışını 200 ila 250 santigrat derece ile hayvanlar tedavi. Sonra özel yapım içine hücreleri yükleyin, Hamilton 80508 50-mikrolitre şırınga 30-gauge iğne ile donatılmış, ve beş-on-on-beşinci canlı insan CD34 + HSC ve DPBS 25 mikrolitre ile karaciğer doğrudan her yenidoğan hayvan enjekte.On-on iki hafta enfeksiyon sonrası, retro-orbital aşağı spin, periferik, santrifüj ile her fareden kan örnekleri, ve deneysel olarak uygun olarak negatif 80 santigrat depolama için mikrosantrifüj tüpleriçin plazma supernates aktarın. HSC engraftment doğrulama için, kırmızı kan hücresi lisis tampon 200 mikrolitre ile pelet yeniden askıya almak ve oda sıcaklığında on dakikalık kuluçka için 1,5 milimetre mikrosantrifüj tüp hücre süspansiyonlar çekin. Daha sonra kalan beyaz kan hücrelerini, yıkama başına DPBS'de 0,5 mililitre taze, yüzde 0,01 büyükbaş hayvan serum albumini veya BSA'da iki yıkama için santrifüj ile toplayın.İkinci yıkamadan sonra, 4 santigrat derece yirmi dakika boyunca engelleme kokteyl 100 mikrolitre ile hücreleri bloke ve bir kez-bir-bir-altıdan altıncı hücre konsantrasyonu başına anti-vücut 2 mikrolitre ilgi uygun anti-vücut kokteyl ile etiketleme izledi. 4 santigrat derecede 30 dakika sonra hücreleri taze DPBS artı BSA'da iki kez yıkayın ve numune başına insan CD45+CD3+CD14+veya CD19+hücrelerinin yüzdesini ölçmek için standart protokollere göre akış sitometrisi ile periferik kan örneklerini değerlendirin. Daha sonra CD4+-CD8+T hücrelerinin oranını hesaplayın ve plazma örneklerindeki viral yükü standart, nicel, ters transkriptaz, PCR protokollerine göre değerlendirin.HIV enfeksiyonunun etkilerini değerlendirmek için, hiv balya virüsünü anestezi, insan, NSG farelere periferik kanlarında yüzde 20'den fazla insan CD45+hücre popülasyonu ile, intraperitoneal uygulama yoluyla fare konsantrasyonu başına 200 nanogram P24'te, her iki haftada bir retro-orbital kanama yoluyla kan örnekleri toplayarak ve hem CD4-TO-CD8 oranını hem de plazma yükünü analiz etmek için , gösterildiği gibi. Viral bastırma doğrulama kaynağı için taze, kombinatoryal, anti-retroviral tedavi veya cART ile enfekte, insan NSG hayvanlar, tatlı suda her hafta 4 hafta boyunca, retro-orbital kanama ile kan örnekleri toplama her iki haftada bir ve hem CD4-to-CD8 oranı ve plazma viral yük olarak gösterildiği gibi analiz. Plazma viral yükleri algılama limitinin altında olduğunda ve CD4-TO-CD8 oranı 1.5 ile 2.5 arasında geri yüklendiğinde viral rebound'u değerlendirmek için cART çekilmesinden sonra her 2 haftada bir retro-orbital kanama yoluyla periferik kan örnekleri toplanır ve örnekleri gösterildiği gibi değerlendirir.İlk engraftment doğrulama sırasında, insan CD45 + hücre sayısı yüzde 20 ila 80 arasında olmalıdır, ve insan lökosit alt kümeleri akış sitometrik analiz ile ayrık popülasyonlar olarak görünmelidir. Sağlıklı bireylerde CD4+-CD8+hücrelerin inkişafı ise tipik olarak viral enfeksiyon da gözlenirken, cd4+-CD8+hücrelerin oranı 1.5 ile 2.5 arasında kalmaktadır. Özellikle cART tedavisine yanıt olarak sağlıklı oran geri kazanılır.Enfeksiyon ve cART rejimi boyunca kantitatif RT PCR ile plazma viral yüklerin tespiti çizilebilir ve viral doğum ve anti-viral tedavi verimliliğini değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla. Bu yöntem HIV / AIDS viroloji çalışmaları ve terapötik gelişimi içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda kanser, diyabet gibi insan hastalığı ile ilgili diğer çalışmalara uygulanabilir, ve oto-immün hastalıklar. Hu-NSG fare modeli geliştirme immünoloji ve onkoloji araştırmacılar için insanlarda yeni bir disfonksiyon ve patoloji keşfetmek için yol açtı, hiv kronik enfeksiyon ve gecikme rezervuar hedefleyen özellikle mekanistik ve terapötik çalışmalar.

humanized-nodscidil2rnull-hu-nsg-mouse-model-for-hiv-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Video, insan immün yetmezlik virüsüne (HIV) karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir fare modeli oluşturma tekniğini göstermektedir. İnsan fetal timus dokusu ve tasarlanmış hematopoietik kök hücreler (HSC'ler), bağışıklığı ciddi şekilde baskılanmış bir farenin böbrek kapsülüne implante edilir. HIV'e karşı kimerik antijen reseptörlerini (CAR'lar) eksprese eden HSC'ler, timus dokusu ile birlikte lokalizasyonlarını destekleyen jelatinimsi bir protein karışımı...

HIV'e Karşı Tasarlanmış Bağışıklığa Sahip İnsanlaştırılmış Bir Fare Modeli Oluşturma

Bu protokol, HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir kemik iliği/karaciğer/timus fare modeli oluşturma yöntemlerini açıklar.

Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

Bu protokol, hem insan bağışıklık sistemi hem de karaciğer hücreleri ile insanlaşmış fareler kurmak için güvenilir bir yöntem sağlar. İnsan hepatositlerinin intrasplenik enjeksiyonu ve CD34+ hematopoetik kök hücrelerin insplektik enjeksiyonu ile elde edilen çift immünoeksik fareler insan immün yetmezlik virüsü-1 enfeksiyonuna yatkındır ve gözlendiği gibi karaciğer hasarına recapitulate HIV bulaşmış hastalar.

HIV ile ilişkili Karaciğer Patogenezi için Çift İnsanize TK-NOG Fare Modelinin Oluşturulması

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

Burada insanlaşmış farelerde HIV enfeksiyonu dinamikleri incelenmesi için üç deneysel yaklaşımlar açıklanmıştır. İlk ivedi kronik enfeksiyon olaylarının incelenmesine izin vererken, ikincisi primer enfeksiyon veya viral reaktivasyon sonrası akut olayların incelenmesine izin verir.

Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu

Biz nesil ve insanlaşmış ve insan immün yetmezlik virüs enfekte NOG fare modeli kök hücre nakli, intravajinal insan immün yetmezlik virüsü maruz kalma ve damlacık dijital PCR RNA dayalı değerlendirilmesi için bir protokol geliştirdik Miktar.

Intravajinal HIV Maruziyeti ve HIV Enfeksiyonu Tedavisi için İnsanize NOG Fareler

Bu protokol, insanlaştırılmış farelerde HIV-1 RNA replikasyonunu başarılı bir şekilde baskılayan oral kombinasyonel antiretroviral ilaçlar vermek için yeni bir yöntemi açıklamaktadır.

HIV-1 Enfekte İnsanlaştırılmış Farelerde Oral Kombinasyonel Antiretroviral Tedavi

Bu protokol, EcoHIV enfeksiyonunun Tmem119-EGFP fareleri ile kombinasyonunun, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozuklukların kemirgen modellerinde mikroglial değişiklikleri ve viral rezervuarları araştırmak için nasıl değerli bir biyolojik sistem sunduğunu açıklar.

Mikroglia ile Manipüle Edilmiş Transgenik Farelerde EcoHIV ile Enfekte Hücrelerin Tanımlanması

HIV tropizm viral zarf V3 bölge anlaşılmaktadır. V3 PCR, iç içe geçmiş RT-PCR, sıralı kullanarak üç nüsha olarak amplifiye ve biyoinformatik yazılımı kullanılarak yorumlanır. Örnekleri dizisi G2P puanları düşük olan 1 veya daha fazla (ler) ile non-R5 virüsü olarak sınıflandırılır.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Keşfedin, insanlaşmış NSG fare modeli oluşturma yöntemini HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için. Bu teknik, insan hematopoietik kök hücrelerinin intrahepatik enjeksiyonuyla güvenilir bir araştırma modeli sağlar.

İnsanlaşmış NOD/SCID/IL2rγ^null (hu-NSG) fare modeli HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için

Daha fazla video keşfet