Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil
28 Ağustos 2018
Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.
Bu yöntem, hangi ilaçların veya genetik değişikliklerin PCSK9'un Proteolitik Fonksiyonunu etkilediği gibi PCSK9 Biyokimya Alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, doğası gereği düşük frekanslı bir biyokimyasal olayın hızlı ve amplifiye edilebilir bir şekilde okunmasına izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri Aterosklerotik Kalp Hastalığına kadar uzanır, çünkü PCSK9 Proteolitik Fonksiyonu, Serum kolesterol seviyeleri üzerindeki nihai etkisi için gereklidir.
Bu yöntem PCSK9'un kendisi hakkında bilgi sağlayabilse de, doğası gereği düşük Proteolitik aktiviteye sahip diğer Proteazlar gibi diğer biyokimyasal sistemlere de uygulanabilir. Başlamak için, her HEK293 T hücresinden Ortamı aspire edin. PBS ile yıkayın ve minimum hacimde% 0.5 Tripsin-EDTA ile muamele edin.
Ve hücreleri ana şişeden ayırmak için 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin. Tripsin-EDTA'yı etkisiz hale getirmek için% 10 FBS ile desteklenmiş iki hacim DMEM ekleyin. Daha sonra şişedeki sıvıyı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin, yapışan hücreleri yerinden çıkarın ve hücreleri steril bir tüpe aktarın.
Ardından, küçük bir hücre alikotunu çıkarın. Eşit hacimde Tripan Mavisi ile boyayın ve lekeli hücreleri bir slayta aktarın ve hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Hücreleri kurtarmak için tüpü beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.
Bundan sonra, Ortamı aspire edin ve hücreleri ve Kültür Ortamını istenen konsantrasyona yeniden oluşturun. Çok kanallı bir pipet ve steril bir oluk kullanarak, her bir oyuktaki hücrelerin 100 mikrometresini beyaz bir 96 Kuyulu Plakaya aktarın. Daha sonra, hücreleri 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, Plazmit plakasını, pozitif kontrol Plazmidi, negatif kontrol Plazmidi ve Plazmid içermeyen Tampon için her biri dört kuyucuk dahil olmak üzere, transfeksiyon için istenen konsantrasyona hazırlayın. İlk olarak, Seyreltilmiş Lipid Transfeksiyon Reaktifinin bir Ana Karışımı ve DNA Ön Kompleksleştirme Reaktifinin bir Ana Karışımı hazırlayın. Daha sonra, çok kanallı bir pipet ve steril bir oluk kullanarak, 16.8 mikrolitre Seyreltilmiş DNA Ön Kompleksleştirme Reaktifini bir Derin Kuyu Plakasının her bir oyuğuna alikot edin.
Bundan sonra, her bir Plazmidin 3.2 mikrolitresini Ana Plakadan Derin Kuyu Plakasının her bir kuyusuna aktarmak için çok kanallı pipeti kullanın. Ardından, plakanın her bir oyuğuna 20 mikrolitre Seyreltilmiş Lipid Transfeksiyon Reaktif Karışımı eklemek için pipeti kullanın ve iyice karıştırın. Plakaları örtün ve Lipid DNA Kompleksleri oluşturmak için oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika bekletin.
Bundan sonra, 96 Kuyulu plakadaki 293 T hücresinden Ortamı nazikçe çıkarmak için çok kanallı pipeti kullanın. Ardından, Ortamı %10 FBS ile desteklenmiş 95 mikrolitre DMEM ile değiştirin. Ardından, her uygun kuyucuğa 10 mikrolitre Transfeksiyon Karışımı eklemek için çok kanallı pipeti kullanın.
Daha sonra, hücreleri 24 saat boyunca% 5 Karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İlk olarak, PBS'de üç molar sodyum askorbat, damıtılmış suda beş molar sodyum klorür, PBS'de mililitre başına 10 miligram BSA ve asitlendirilmiş metanolde iki milimolar Coelenterazine dahil olmak üzere Çift Mukavemetli Coelenterazine Test Reaktifini yapmak için gerekli Stok Çözeltilerini hazırlayın. Ardından, Lusiferaz okuması için yeterli Coelenterazine Reaktifi hazırlayın.
Ortamdaki hücrelerin her biri için ayrı bir reaktif ile. Ardından, Coelenterazine için beklenen tüm reaktifleri karıştırın. Karışımı 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden süzün.
Ve sonra filtrelemeden sonra Coelenterazine'yi ekleyin. Transfeksiyondan 24 saat sonra hücreleri inkübatörden çıkarın. Ardından, her bir kuyucuktan 50 mikrolitre Şartlandırılmış Ortamı taze beyaz 96 Kuyulu Plakaya aktarmak için çok kanallı pipeti kullanın.
Yalnızca Şartlandırılmış Ortam içeren plakaya 50 mikrolitre Çift Mukavemetli Litik Olmayan Coelenterazine Reaktifi eklemek için çok kanallı pipeti kullanın. Ardından, plakayı karanlıkta oda sıcaklığında beş ila 10 dakika hafifçe çalkalayın. Ardından, hücreleri içeren plakaya Çift Güçlü Litik Coelenterazine Reaktifini ekleyerek bu adımı tekrarlayın.
İnkübasyonlardan sonra, bir Plaka Okuyucuda yalnızca Orta plakanın ve Hücre içeren plakanın lüminesansını ölçün. Son olarak, plakaları atın ve daha fazla veri analizi için dosyaları kaydedin. Lusiferaz Reaktifini yalnızca Orta Plaka ve Hücre İçeren Plaka ile aynı süre boyunca inkübe etmek önemlidir, çünkü bu plakalara ilişkin veriler doğrudan karşılaştırılır.
Bu protokolde, P6 ila P6 Prime Substrat Bölgelerindeki PCSK9 Proteazının Bölünme Dizisi Özgüllüğü, bir Lusiferaz Testi ile değerlendirildi. P6 ve P4 ile P1 Prime arasındaki konumlardaki Bölünme Dizisindeki değişiklikler Proteaz tarafından zayıf bir şekilde tolere edilir. Ancak P5 ve P2 Prime'dan P6 Prime'a kadar olan konumları değiştirmek için daha esnektir.
Ek olarak, sonuçlar, optimal Bölünme Dizilerinin esasen Vahşi tip Dizi ile aynı olduğunu göstermektedir. Klinikte bulunan yanlış gönderilen keskin nişancılardan oluşan bir kütüphanenin nispi Bölünme Aktivitesi, Vahşi tip Proteaz ile karşılaştırıldı. Değerlendirilen 84 keskin nişancının yarısından fazlası, Yabani tip Proteaz'a kıyasla aktivitede önemli değişiklikler gösterdi, bu da Proteaz Aktivitesindeki değişikliklerin klinik popülasyonda sıklıkla gözlendiğini düşündürdü.
Bu prosedürü takiben, PCSK9'un LDL Reseptörü üzerindeki etkisi üzerindeki PCSK9 Proteolitik Yeteneğindeki değişiklikleri değerlendirmek için hepatositlerde akış sitometrisi veya Kolesterol Alım Testleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, lipid metabolizmasının temel itici gücü olan PCSK9'un proteolitik aktivitesini değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, hiperkolesterolemide PCSK9'un rolünü anlamak için kritik olan düşük frekanslı biyokimyasal olayların hızlı bir şekilde okunmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Proteolitik Enzimoloji
- Lipid Metabolizması
Arka Plan
- PCSK9, serum kolesterol seviyelerinin düzenlenmesi için gereklidir.
- Proteolitik fonksiyonunun anlaşılması, ilaç geliştirmeye temel oluşturabilir.
- Yöntem, düşük aktiviteye sahip diğer proteazlara da uygulanabilir.
- Bu araştırmanın aterosklerotik kalp hastalığı üzerinde etkileri vardır.
Çalışmanın Amacı
- PCSK9'un proteolitik aktivitesini hücresel bir bağlamda değerlendirmek.
- İlaçların veya genetik değişikliklerin PCSK9 fonksiyonu üzerindeki etkilerini belirlemek.
- Diğer biyokimyasal sistemler için uygulanabilir içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- HEK293 T hücrelerindeki besiyerini aspire edin.
- Hücreleri PBS ile yıkayın.
- Hücreleri %0,5 Trypsin-EDTA ile muamele edin.
- Proteolitik aktivitenin amplifiye edilebilir okumalarına izin veren bir yöntem kullanın.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, düşük frekanslı proteolitik olayları başarıyla değerlendirmektedir.
- Elde edilen bulgular, kolesterol yönetimine yönelik terapötik stratejileri etkileyebilir.
- Potansiyel uygulamalar diğer proteazları da kapsamaktadır.
Sonuçlar
- Bu teknik, PCSK9'un lipid metabolizmasındaki rolunun anlaşılmasını geliştirir.
- Diğer düşük aktiviteli proteazların incelenmesi için bir çerçeve sunar.
- Bulgular, aterosklerotik kalp hastalığının tedavisindeki ilerlemelere katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Alakası
PCSK9 gibi tek döngülü (single-turnover) proteazların proteolitik fonksiyonunun değerlendirilmesi, kardiyovasküler ilaç keşfinde hedef doğrulaması için kritik öneme sahiptir. Bu analiz, genetik ve farmakolojik pertürbasyonların yüksek kapasiteli sorgulanmasına olanak tanıyarak mekanistik risk azaltma ve öncü bileşik tanımlamasında öngörücü güvenilirliği destekler. Proteaz aktivitesini salgılanan lusiferaz okumasıyla ilişkilendirerek, biyokimyasal mekanizma ile fenotipik sonuç arasında köprü kurar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Genetik varyantların veya bileşiklerin PCSK9 proteolitik fonksiyonunu nasıl etkilediğini test ederek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Hücresel bağlamda düşük frekanslı biyokimyasal olayların hızlı ve amplifiye edilebilir şekilde okunmasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Portföy elemeleri için klinik missense SNP'lerin ve inhibitör etkinliğinin değerlendirilmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kantitatif, homojen saptama için intermoleküler proteolizi salgılanan lusiferaz aktivitesiyle ilişkilendirir.
- Operasyonel Değer: 96 kuyucuklu formatla uyumludur; mutant kütüphanelerinin veya küçük molekül koleksiyonlarının taranmasına olanak tanır.
- Analiz Hazırlığı: Lize gerektirmeyen ölçüm için kondisyonlu besiyeri kullanır, böylece değişkenliği azaltır ve kinetik profilleme imkanı sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: İn vitro proteolitik aktivite ile hepatositlerdeki LDL reseptörü ve kolesterol alımı üzerindeki alt etkileri birbirine bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Yapı-fonksiyon ilişkilerini açıklayarak, inhibitör tasarımı için hangi substrat konumlarının mutasyona tolerans gösterdiğini ortaya koyar.
- Öngörüsel Güven: Klinik SNP'lerin yarısından fazlasının aktiviteyi değiştirdiğini kanıtlayarak, hasta stratifikasyonundaki varyant yorumlamasına bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, hedef modülasyonunu hücresel veya fenotipik analizlere geçmeden önce değerlendirmek için erken keşif aşamasına uygundur ve hedef etkileşimi ile fonksiyonel sonuç arasında mekanistik bir köprü sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Pertürbasyonların proteaz fonksiyonunu nasıl etkilediğini test ederek hipotez odaklı hedef doğrulamayı destekler.
- Tarama: Proteolitik kesimin bir göstergesi olarak lusiferaz salgılanmasını kullanarak genetik varyantların veya bileşiklerin yüksek çıktılı değerlendirmesine olanak tanır.
- Analizler: Kondisyonlu ortamdan kantitatif lüminesans okumaları üreterek farklı koşullar arasında karşılaştırma yapılmasına ve hücre sayısına göre normalizasyona imkan sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Proteolitik değişikliklerin fizyolojik uygunluğunu değerlendirmek için hepatositlerde kolesterol alımı gibi takip analizlerine temel oluşturur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Düşük aktiviteli diğer proteazlara uyarlanabilir; farklı terapötik alanlarda proteolitik hedef doğrulama için bir platform görevi görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Proteolitik fonksiyonu fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda doğrudan ölçerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Minimum manuel işlem süresi gerektiren, plaka okuyucu aracılığıyla ölçeklenebilir okuma sağlayan, standardize edilmiş ve tekrarlanabilir iş akışı.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonunu biyokimyasal mekanizmaya bağlayarak go/no-go (devam/dur) kararlarını iyileştirir ve geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Proteolitik etkinlik temelinde, PCSK9 hedefli terapötiklerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Memeli hücre kültürü, geçici transfeksiyon ve lusiferaz tabanlı analizler konusunda uzmanlık gerektirir.
- Lüminesans deteksiyon özellikli plaka okuyucuya ve HEK293 T hücrelerinde transfeksiyon verimliliğinin optimizasyonuna bağımlıdır.
- Litik ve non-litik sinyaller arasında doğru karşılaştırma yapabilmek için kondisyonlu ortam yönetimi ve reaktif inkübasyon sürelerinin standartlaştırılması gerekir.
- Diğer proteazlara adaptasyon, substratın yeniden tasarlanmasını ve lusiferaz raporer bağlantısının kesim olayına doğrulanmasını gerektirir.
- Kesimin lusiferaz salınımıyla ilişkilendirilebildiği proteazlarla sınırlıdır; modifikasyon yapılmadan hücre içi veya çok döngülü proteazlar için uygun değildir.
