Name: Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, HEK293 T hücreleri kullanarak PCSK9'un proteolitik aktivitesini yüksek hassasiyetli luciferase tahlili ile değerlendirme yöntemini. Bu teknik, düşük frekanslı biyokimyasal olayları hızlıca ölçerek lipid metabolizması ve hiperkolesterolemi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar NHLBI/NIH (K08 HL124068 ve LRP HMOT1243), NCATS/NIH UCSF klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü Catalyst programı (UL1 TR000004), UCSF akademik Senato Hellman Vakfı aracılığıyla cömert finansman desteğinden teşekkür bir Gilead Sciences araştırma bilim adamı Ödülü, bir Pfizer ASPIRE kardiyovasküler Ödülü (tüm John S. Chorba) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü (için Adri M. Galvan ve Kevan M. Shokat).

1. site yönettiği Mutagenesis proteaz vektör
<ol><li>Bir mutasyon ilgi standart site yönettiği mutagenesis protokolleri12bir değişiklik kullanarak yüklemek için tasarım ve düzen özel sentez oligonucleotides. (Olmadan ek arıtma) standart desalted astar tamamen kabul edilebilir. Not: Astar tasarımlar için genel bir yaklaşım faiz polimeraz için belirli bir erime sıcaklık (Tm) hesaplama kullanarak Tablo 1, gösterildiği gibi kısmen üst üste astar oluşturma içerir.</li>
	<li>Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) kadar site yönettiği mutagenesis için buza, Tablo 2' de gösterildiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>PCR Tablo 3' te gösterildiği gibi döngüsü.</li>
	<li>Her PCR 2-5 µL % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak ve başarılı bir amplifikasyon onaylamak için ürünler görselleştirin. Not: Başarılı bir PCR şablonu (~7.8 kB) yaklaşık boyutu işareti bir tek, önde gelen DNA bant gösterecektir.</li>
	<li>DpnI (başına 25-µL reaksiyon) 0.5 µL ekleyin ve 1 h için 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya.</li>
	<li>Reaksiyon kimyasal olarak yetkili Escherichia coliiçine 2 µL dönüşümü. Not: Bir hızlı büyüyen e.coli suşu kuluçka süreleri azaltmak ama klonlama herhangi bir zorlanma kabul edilebilir olacaktır.</li>
	<li>50-100 µg/mL carbenicillin içeren Luria-Bertani (LB) agar üzerine dönüşümleri plaka. Plakayı gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>2-4 kolonileri küçük ölçekli Kültür (2-5 mL LB orta ile 50-100 µg/mL carbenicillin) büyümeye seçin. Bulanık kadar 220 rpm'de 37 ° C'de kültür kuluçkaya.</li>
	<li>Plazmid üretici yönergelerine göre bir plazmid DNA arıtma (yani, "miniprep") kit kullanarak hücrelerden DNA izole et. Eluted DNA microvolume spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçmek.</li>
	<li>Plazmid DNA kapsamlı bir Sanger sıralama Servisi (çekirdek veya gibi ticari tesis) kullanarak sıra. DNA örnekleri hizmetin belirtimlerine göre hazırlayın. Önceki sıralama tepkileri başarıyla kullanılan astar Tablo 4' te belirtilmiştir. Not: tüm plazmid PCR güçlendirme nedeniyle tüm PCSK9 Kodlayıcı bölge sıralama her mutant için önerilir.</li>
</ol>2. yüksek-den geçerek Luciferase tabanlı proteolizis tahlil
<ol><li>
Hücre kaplama (0 gün)
	<ol>
<li>Düşük-geçit HEK293T hücreleri deneyler için kullanın ve Dulbecco'nın bir kültür kartal Orta (DMEM) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS) değiştirilebilir. Gerçekleştirmek tüm cep doku kültürü başlıklı steril koşullarda iş luciferase etkinliği tahlil için hazır kadar. Wells ve transfections nüsha test her koşul için gerçekleştirilecek tahmin deney için gerekli tabak sayısını tahmin ediyoruz.</li>
		<li>Bir üst şişesi HEK293T hücrelerden en az hacmi % 0.05 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA hücreleri kapsayacak şekilde) ile tedavi bunları ayırmak. Tripsin-EDTA DMEM FBS ve transferi ile desteklenmiş 2 hacimleri ile devre dışı bırakabilirsiniz bir steril tüp hücrelere. Hücreleri saymak bir otomatik hücre sayaç (ve trypan ile mavi boyama). 500 x g hücreleri kurtarmak 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Tripsin içeren orta Aspire edin ve 2 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon kültür ortamına hücrelerde sulandırmak. Bir çok kanallı pipet kullanarak, hücrelerin 100 µL 2 x 104 hücreleri/iyi bir son tohum konsantrasyon verir bir beyaz (opak-alt) 96-şey plaka, her şey için transfer. Not: ilk deneyler için bir kız kardeşi, temiz-alt 96-şey plaka, hücre büyümesi ve bağlılık iletişim kuralı ve sorun giderme kılavuzu gelecekteki sırasında izlemek için Ayrıca temel yararlı olabilir.</li>
		<li>Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Plazmid bir 96-iyi biçimde ana bir tabak hazırla. Her plazmid elüsyon arabelleği (Tris-HCl, pH 8,5) 50 ng/µL bireysel bir iyi bir 96-şey plaka için sulandırmak.<ol>
<li>4 kuyu olumlu denetim (WT) plazmid8, negatif kontrol (S386A) plazmid8ve plazmid ücretsiz tampon (için sahte transfections) hazırlayın. Eğer ilaç ya da diğer hücresel dayalı tedaviler planlanmaktadır, o zaman her şey olumlu denetim (WT) plazmid ile ana plaka hazırlamak, 4 ile birlikte her negatif kontrol (S386A) plazmid ve plazmid ücretsiz tampon kuyuları.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection (1. gün)
	<ol>
<li>Derin-şey 96-şey plakaları kullanarak bir 96-şey plaka biçimde transfection karışımı hazırlayın. Transfections pipetting ve transfer kayıplar için hesabınıza yeterli reaktifler hazırlamak emin olun nüsha gerçekleştirin. Not: Aşağıdaki hesaplamaları (420 kuyular için konservatif tahmini) nüsha bir 96-şey plaka çalıştırmak için yeterli reaktif hazırlayın.<ol>
<li>Reaktif 50.4 µL azaltılmış-serum orta 2050 µL için ekleme bir seyreltilmiş lipid transfection reaktif ana bir karışımını yapmak. Bir DNA precomplexation reaktif reaktif 33.6 µL azaltılmış-serum orta 1730 µL ekleme, ana bir karışımını yapmak.</li>
			<li>Bir çok kanallı pipet, aliquot 16.8 µL derin-şey plaka her kuyuya seyreltilmiş DNA precomplexation reaktif karışımı kullanarak.</li>
			<li>Bir çok kanallı pipet, aliquot 3.2 µL kullanarak (160 ng), her plazmid derin-şey plaka her kuyuya ana plaka.</li>
			<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak, her seyreltilmiş lipid transfection reaktif karışımı aliquot 20 µL tabak iyi ve her şey çok kanallı pipet kullanarak içeriği karıştırın. Kuruyucu ve onlara oda sıcaklığında (RT) oturup formu lipid: DNA komplekslerinde için 10-15 dk için. Not: transfection iyi başına son bileşenleri aşağıdaki gibi olacaktır: 40 ng DNA, transfection reaktif 0,12 µL ve 0,08 µL DNA pre-complexation reaktif ve içerik her şey-ecek var olmak 10 µL toplam hacim (azaltılmış-serum orta).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yavaşça hücreleri bozmaya değil dikkat çekici bir çok kanallı pipet kullanarak 96-şey plakaları 293T hücrelerde ortamda değişimi. DMEM % 10 ile desteklenen 95 µL emişli orta yerine FBS. Not: Bu ilgi herhangi bir ilaç hücrelerle tedavi için uygun bir zaman olacaktır.</li>
		<li>Her uygun iyi üzerinden için çok kanallı pipet 10 µL transfection karışımı ekleyin. Yavaşça kuyuları içeriğini karıştırmak için plaka girdap. Plaka %5 CO2 24 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Wells son hacim 105 µL için buharlaşma için 24 h üzerinden hesap gelir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tahlil (2 gün)
	<ol>
<li>Bir hisse senedi çözüm coelenterazine kimyasalları hazırlamak: [taze hazırlanan fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde (PBS), çözünmüş] 3 M sodyum askorbat, 5 M NaCl, 10 mg/mL Sığır serum albumin (BSA; içinde çözünmüş PBS, taze hazırlanmış) ve 2 mM coelenterazine (içinde çözünmüş acidified metanol) 3 N HCL 10 mL başına 200 µL içeren. Not: 2 mM coelenterazine 2 hafta ne zaman-80 ° c ve ışık yokluğunda tutulur depolanabilir.</li>
		<li>2 x coelenterazine reaktifler bir ayrı reaktif her hücre ve orta, ile luciferase okuma için Tablo 5göre hazırlayın. İlk coelenterazine kurtarmak tüm reaktifler karışımı karışımı bir 0,22-µm şırınga filtre ve coelenterazine ekleyin. Plakalar için eklenecek hazır olana reaktifleri ışıktan korumak. Not: eriyik--dan filtrasyon kaybı nedeniyle, filtrasyon, hem de transferler için kaybı her iki hesap için yeterli reaktif olun. Tablo 5 son konsantrasyonu 2 x reaktifler (aynı zamanda bir reaktif bir 96-şey plaka okumak için eklemek için hisse senedi çözüm miktarı) gösterir.</li>
		<li>Hücreleri kuluçka 24 saat sonra transfection kaldırın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 50 µL şartına orta her kuyudan taze, beyaz popolu (opak) bir 96-şey plakasına aktarın.<ol>
<li>Tabak ister orta veya hücreleri içeren olarak etiketleyin. Eğer birden fazla 96-şey plaka transfected, böylece her Orta içeren plaka hücreleri onun üst plaka ile eşleştirilmiş olan sağlamak için tabak etiketleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak 2 x litik sigara coelenterazine reaktif 50 µL sadece şartına orta içeren plaka ekleyin. Yavaşça rock veya plaka için 5-10 dk RT. az ışık yokluğunda sallamak</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak 2 x litik coelenterazine reaktif 50 µL hücreleri içeren plaka ekleyin. Yavaşça rock veya plaka için 5-10 dk RT. az ışık yokluğunda sallamak</li>
		<li>Kuluçka sonra plaka okuyucu yalnızca orta plaka ışıldama okumak. Sonra aynı plaka okuyucu hücreyi içeren plaka ışıldama okumak.</li>
		<li>Tabakları atmak ve veri analizi için dosyaları kaydetmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. veri analizi
<ol><li>Elektronik tablo yazılımı kullanarak bir ilk veri çözümlemesi gerçekleştirin. Hücre ve orta plakaları sonuçlarını içeren bir elektronik tablo oluşturun.</li>
	<li>El ile kötü transfected kuyu tanımlamak için hücre plakaları verilerden inceleyin. &lt; %5 - 10 göstermek Wells % negatif kontrol (S386A) plazmid okuma kabul edilmelidir olarak kötü transfected, bu veri şüpheli yorumu yapma.</li>
	<li>Her plaka sahte transfected kuyulardan ortalama arka plan ışıldama hesaplayın. Bu plaka değerleri her tabaktan arka plan çıkarma. Not: Bu değer kullanılan plaka okuyucu bağlı olarak önemsiz olabilir.</li>
	<li>İşlem luciferase etkinliği genel luciferase faaliyet her şey için karşılaştırıldığında orta oranda hesaplayarak verileri. Çünkü her iki klimalı ortam ek olarak hücreleri hücre plaka içeren ve salt orta plaka hücre plaka şartına orta aynı miktarı içerir, aşağıda ki formül kullanmak uygundur: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq1.jpg"> Burada, RLU göreli ışıldama birimleri, arka plan düşülen okuma plaka okuyucu =.</li>
	<li>Ortalama salgılanan luciferase pozitif kontrol (WT) ve negatif kontrol (S386A) kuyu hesaplayın.</li>
	<li>Bir Z-faktör13hesaplayarak deneme genel kalitesini değerlendirmek: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq2.jpg"> Not: Etkin değerleri pozitif denetiminden (WT) ve etkin olmayan değerler negatif kontrol (S386A) kuyulardan gelir. 1'e yakın değerler daha deneysel kaliteli belirtir. Deneme yinelenen veya değeri 0 ise iş akışı en iyi duruma getirme düşünün.</li>
	<li>Verileri elektronik tablo programından bilimsel veri analiz yazılımı aktarın.</li>
	<li>Pozitif kontrol (WT) ve negatif kontrol (S386A), ortalama değerleri pozitif kontrol 1 ve negatif kontrol 0 ayarlanması salgılanan luciferase faaliyete normalleştirmek.</li>
	<li>En büyük yanlış bulma oranı % 1'e ayarlama regresyon ve aykırı kaldırma (bozgun) yöntemini kullanarak outliers için verileri temizlemek.</li>
	<li>İçin istatistiksel olarak anlamlı fark mutant her koşul (veya mutant) için verileri karşılaştırarak WT etkinliği (1 değeri için normalleştirilmiş) ortalaması değerlendirin. Birden çok unpaired tgerçekleştirmek-α ve Holm-Sidak yöntemini kullanarak birden çok karşılaştırmaları için düzeltme testleri, 0,05 =.</li>
</ol>

<ol><li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9a+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li>
<li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+PCSK9%2C+low+LDL%2C+and+protection+against+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li>
<li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li>
<li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li>
<li>Pettersen, D., Fjellström, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li>
<li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li>
<li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li>
<li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NARC-1%2FPCSK9+and+its+natural+mutants%3A+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+%28LDL%29+receptor+and+LDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91(2008).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li>
<li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9+%28PCSK9%29+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li>
<li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+%28PC%29+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and%2For+PC5%2F6A%3A+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıda açıklanan deneysel prosedürler tek-ciro proteaz PCSK9 özünde düşük etkinlik üstesinden gelmek ve proteolitik işlevini sağlam bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Tahlil anahtar kavramı enzimatik güçlendirilmiş bir okuma bir tek-ciro olay dönüştürme üzerine dayanır. Güçlü bir tahlil nispeten kısa zaman dilimi ve rahatlık-in kullanma luciferase muhabir, hem de onun ölçeklenebilirliği yüksek üretilen iş yaklaşımlara içerir. Buna ek olarak, tahlil proteolizis onun yerli, hücresel bağlamda değerlendirir...

PCSK9 hedefi LDL reseptör (LDL-R) bozulması için LDL kolesterol (LDL-C) yükselterek ve aterosklerotik kalp hastalığı1,2sürüş. Tedavi hedefleme PCSK9 sağlam LDL-C daha düşük ve kardiyovasküler sonuçlar hastalar için bile bir saldırgan lipid düşürücü tedavi statinler3,4ile eklendiğinde geliştirmek. Şu anda onaylanmış tedaviler antikor tabanlı yaklaşımlar, sınırlı ancak ve maliyet-etkililik5,6bir eksikliği muzdarip. Bu sorunu çözmek için daha az maliyetli tedavi alternatifleri, hastalar daha büyük yararlar elde etmek büyük olasılıkla tanımlamak için bir yol ya da her ikisi, gereklidir.
Küçük molekül yaklaşımlar hücre içi PCSK9 hedef, geliştirilmiş bir rota yönetim sağlamak ve onları yapma "Kutsal kase" içinde bu alan7maliyetleri azaltmak. Ancak, PCSK9 küçük moleküller tarafından uyuşturucu için zor kanıtlamıştır. Öz-proteolizis PCSK9 olgunlaşma8 hızı sınırlaması adım ve LDL-R9üzerindeki maksimal etkisi için gerekli gibi bir proteaz PCSK9'ın proteolitik işlevi hedefleme çekici bir strateji vardır. Bugüne kadar ancak, bu strateji büyük olasılıkla PCSK9'ın benzersiz Biyokimya nedeniyle başarılı olmamıştır: PCSK9 cleaves yalnızca kendisini10, bir tek-ciro tepki gerçekleştirme ve öz-bölünme sonra prodomain PCSK9 aktif bölgesinde bağlı kalır bir herhangi bir daha fazla proteaz aktivitesinin okuma engelleyen otomatik inhibitörü11.
Bu makale PCSK9 proteolitik işlevi yüksek üretilen iş moda8değerlendirmek için bir yöntem sunar. Site yönettiği mutagenesis Müfettişler bu tahlil onları proteolizis, PCSK9 olgunlaşma hızı sınırlaması adım üzerindeki etkileri için değerlendirmek için klinikte buldum SNPs kodlama etkilerini araştırmak için kullanabilirsiniz. Ayrıca, bu yöntem hangi sonuçta LDL-r PCSK9 sunumunu bozabilir (ve PCSK9'ın hypercholesterolemic etkisi modüle için) beklenen PCSK9 proteolizis, modülatörler tanımlamak için yüksek üretilen iş ekranlar tasarımında yararlı olacaktır . Son olarak, i) bir belirli substrat-proteaz çift bulunabilir ve uygun II) bir hücre içi bağlantı için belgili tanımlık substrate kurulabilir koşuluyla bu iletişim kuralı ile özünde düşük etkinlik, diğer proteaz için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>PCR Tüpleri</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start</td><td>için New England Biolabs</td><td>M0493L</td><td>Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz</td></tr><tr><td>Deoksinükleotid Çözelti Karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTP'ler (PCR için)</td></tr> <tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td><td>Yazarlar</td><td>n/a</td><td>Yazarlardan edinilebilir</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td><td>Yazarlar</td><td>n/a</td><td>Yazarlardan temin edilebilir</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-201-100</td><td>DNA jelleri için</td></tr><tr><td>Mavi Işık Bazlı E-Jel Görüntüleyici Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4466612</td><td>DNA jellerini görüntülemek için</td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA Jel Lekesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>DNA jelleri için</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>DNA jeli çalışan tampon için</td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>DNA jel çalışma tamponu için</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit çözeltisi</td><td>Millipore Sigma</td><td>3690</td><td>EDTA, DNA jeli çalışan tampon</td></tr><tr><td>için 1 kb DNA merdiveni</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>D010</td><td>DNA merdiveni</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Kısıtlama enzimi</td></tr><tr><td>100 & mikro ile LB Agar plakaları; g/mL karbenisilin</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td>LB-Karbonhidrat plakaları</td></tr><tr><td>Tek Atış Mach1 T Faj Dirençli Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C862003</td><td>Kimyasal olarak yetkin hücreler</td></tr><tr><td>LB Et suyu, Miller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>LB</td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>C-103-5</td><td>Seçici antibiyotik</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plazmid Mini Kit I</td><td>Omega BioTek</td><td>D6942-02</td><td>DNA Saflaştırma Miniprep kiti</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spektrofotometre</td></tr><tr><td>293T Hücreleri</td><td>Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonu (ATCC)</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T hücreleri</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, piruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>DMEM, memeli hücresi medya</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Sera</td><td>Axenia Biologix</td><td>F001</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td>Tripsin, hücre ayrışması için</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Kontes otomatik hücre sayacı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td>Otomatik hücre sayımı</td></tr><tr><td>Kontes hücre sayma odası slaytları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Hücre sayımı için slaytlar</td></tr><tr><td>CELLSTAR Doku Kültürü Plakaları, Beyaz, Beyaz Altlı, Kapaklı</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655083</td><td>Beyaz, beyaz tabanlı 96 kuyulu plaka</td></tr><tr><td>TempPlate eteksiz 96 oyuklu PCR plakası, doğal</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9596</td><td>Ana plazmid plakası için 96 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>Nunc 2.0mL DeepWell Plakalar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>278743 96 kuyu derin kuyu plakası</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>Lipid transfeksiyon reaktifi, Lf3K</td></tr><tr><td>P3000 Reaktifi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td> Lf3K OptiMEM I İndirgenmiş Serum Ortamı <td>ile sağlanan DNA ön kompleksleştirme reaktifi</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Azaltılmış serum ortamı transfeksiyon için</td></tr> <tr><td>(+) - Sodyum L-askorbat</td><td>Millipore Sigma</td><td>A4034</td><td>Sodyum askorbat</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Albümin, Sığır Serumu, Fraksiyon V, Düşük Ağır Metaller</td><td>Millipore Sigma</td><td>12659</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Metanol (HPLC)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4524</td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>VWR</td><td>JT9535-2</td><td>Konsantre HCl</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>CZ2.5</td><td>Lusiferaz substrat</td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi, Steril</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-720-3</td><td>Steril filtre, PVDF, 0.22 ve mikro; m gözenekli</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013810</td><td>Çok Kanallı pipet</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013808</td><td>Çok Kanallı Pipet</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-10XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013807</td><td>Çok Kanallı pipet</td></tr><tr><td>Reaktif rezervuarı</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Reaktifler</td></tr> <tr><td>için olukSantrifüj tüpleri, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td>15 mL tüpler</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL tüpler</td></tr><tr><td>Spark Mikroplaka Okuyucu</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Plaka Okuyucu</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2016 for Mac</td><td>Elektronik tablo yazılımı</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td>v7</td><td>Bilimsel veri analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

tek-ciro proteaz pcsk9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek luciferase tahlil

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein konvertaz subtilisin/kexin 9 (PCSK9) türüdür serum düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) düzeyleri düzenleyen bir tek-ciro proteaz ve sonuç olarak, kalp-damar hastalıkları. PCSK9 proteolizis tam hypercholesterolemic etkisi için gerekli olmasına rağmen proteolitik işlevini değerlendirilmesi zordur: PCSK9 sadece kendisini ayırmak için bilinen, sadece tek bir ciro uğrar ve proteolizis sonra substrat korur onun aktif bir otomatik inhibitörü olarak. Burada sunulan yöntemleri bu zorlukların üstesinden gelir bir tahlil açıklanmaktadır. Cins proteolizis bir hücre tabanlı içerik ve bağlantılar başarılı bölünme klimalı ortamda kolayca okunabilir salgılanan luciferase etkinlik için tahlil odaklanır. Via sıralı adımları mutagenesis, geçici transfection ve bir luciferase okuma tahlil PCSK9 proteolizis ya da moleküler genetik pertürbasyon koşullar altında bir yüksek-den geçerek şekilde sonda. Bu sistem klinik olarak keşfedilen missense tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs), de PCSK9 proteolizis küçük molekül inhibitörleri ile taranması gelince biyokimyasal değerlendirme için son derece uygundur.

Yüksek işlem hacmi proteolizis tahlil üç büyük zorlukların üstesinden üzerine dayanır. İlk olarak, bir tek-ciro PCSK9 proteaz inhibitör eksik bir PCSK9 proteaz özünde düşük çıktı aşmak için prodomain, bölünme serisi prodomain kuyruğunu, salgılanan14olabilir bir luciferase bağlantılı kullanılır. İkinci olarak, pas proteaz ihtiyacını karşılamak için onun inhibitör kompleksi prodomain, iki polipeptitler olan trans içinde bir hücresel bağlam1...

Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Bu yöntem, hangi ilaçların veya genetik değişikliklerin PCSK9'un Proteolitik Fonksiyonunu etkilediği gibi PCSK9 Biyokimya Alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, doğası gereği düşük frekanslı bir biyokimyasal olayın hızlı ve amplifiye edilebilir bir şekilde okunmasına izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri Aterosklerotik Kalp Hastalığına kadar uzanır, çünkü PCSK9 Proteolitik Fonksiyonu, Serum kolesterol seviyeleri üzerindeki nihai etkisi için gereklidir.Bu yöntem PCSK9'un kendisi hakkında bilgi sağlayabilse de, doğası gereği düşük Proteolitik aktiviteye sahip diğer Proteazlar gibi diğer biyokimyasal sistemlere de uygulanabilir. Başlamak için, her HEK293 T hücresinden Ortamı aspire edin. PBS ile yıkayın ve minimum hacimde% 0.5 Tripsin-EDTA ile muamele edin.Ve hücreleri ana şişeden ayırmak için 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin. Tripsin-EDTA'yı etkisiz hale getirmek için% 10 FBS ile desteklenmiş iki hacim DMEM ekleyin. Daha sonra şişedeki sıvıyı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin, yapışan hücreleri yerinden çıkarın ve hücreleri steril bir tüpe aktarın.Ardından, küçük bir hücre alikotunu çıkarın. Eşit hacimde Tripan M

a-high-throughput-luciferase-assay-to-evaluate-proteolysis-single

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Video, lusiferaz etiketli proteinleri ölçmek için kullanılan lusiferaz testini göstermektedir. Tahlil, ilgilenilen bir protein ile konjuge edilen küçük parçaya bağlanan büyük bir parçadan oluşan tasarlanmış bir lusiferaz enzimi kullanır. Bağlı alt birimler, substratın varlığında ışıldayan bir sinyal yayan aktif bir enzim oluşturur. Bu sinyal daha sonra bir luminometre kullanılarak ölçülür.

Lusiferaz Testi: Tasarlanmış Nanolusiferaz Sistem Tabanlı Biyomuhabirler Kullanarak Lüminesan Sinyalleri Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Test

Bu video, florojenik peptitler kullanılarak proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir testi göstermektedir. Proteaz, peptit üzerindeki bölünme bölgesini tanır, onu parçalar ve söndürücüyü florofordan ayırarak floresan emisyonunu sağlar. Floresan sinyali, farklı peptit varyantlarının bölünme verimliliğini kontrol etmek için tespit edilir ve analiz edilir.

Proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir florojenik peptit bölünme testi

Bu video, tetrasiklin ile indüklenebilir bir sistem kullanılarak genetik olarak değiştirilmiş insan hücrelerinde γ-sekretaz aktivitesini ölçme prosedürünü göstermektedir. İşlem, tetrasiklin ile APP gen ekspresyonunun indüklenmesini, amiloid β peptitlerin üretilmesini ve lusiferaz üretiminin aktive edilmesini içerir. Lusiferaz-substrat reaksiyonundan kaynaklanan biyolüminesans daha sonra ölçülür ve γ-sekretaz aktivitesini yansıtır.

İnsan Hücrelerinde γ-Sekretaz Aktivitesini Ölçmek için Lusiferaz Testi

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

İki substrat özgü γ-secretase deneyleri başarılı bir şekilde üretilip. Burada sunulan her iki hücre tabanlı deneyleri γ-secretase enzimatik faaliyetleri yolu ile ateş böceği luciferase gazetecilere verim ölçmek için tasarlanmıştır.

Amiloid habercisi γ-Secretase-aracılı Protein ve çentik bölünme hücre tabanlı Luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm

Burada büyük tümör baskılayıcı (Latı) kinaz aktivitesinin ölçmek için bir luciferase tabanlı biyoalgılayıcı mevcut-Merkez kinaz yolu sinyal Hippo içinde. Bu biyoalgılayıcı temel ve translasyonel araştırma Hippo yol regülatörleri vitro ve in vivoaraştıran yönelik çeşitli uygulamalar vardır.

Hippo Luciferase tabanlı büyük tümör baskılayıcı (Latı) biyoalgılayıcı kullanarak yolu etkinliğini sinyal izleme

Burada, N-terminal hexahistidine/maltoz-bağlayıcı protein ve nikel-nitrilotriacetic yüzeye bağlı floresan protein erimiş rekombinant yüzeylerde kullanan bir son zamanlarda geliştirilen proteaz tahlil platform ayrıntılı yordam mevcut asit manyetik özel boncuk. Bir sonraki jel analiz Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez tarafından ayrılmış tahlil örnekleri de sunulmaktadır.

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Öğrenin, HEK293 T hücreleri kullanarak PCSK9'un proteolitik aktivitesini yüksek hassasiyetli luciferase tahlili ile değerlendirme yöntemini. Bu teknik, düşük frekanslı biyokimyasal olayları hızlıca ölçerek lipid metabolizması ve hiperkolesterolemi araştırmalarına katkı sağlar.

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Daha fazla video keşfet