Name: Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Keşfedin, yağ dokusunun üç boyutlu yapısını koruyarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan Adipo-Clear doku temizleme yöntemini. Bu teknik, adipositlerin karmaşık etkileşimlerini incelemek için araştırmacılara yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Christina Pyrgaki, Tao Tong ve Bioimaging Kaynak Merkezi yardım için Rockefeller Üniversitesi'nde kuzeyden Alison teşekkür ediyoruz ve destek. Biz de Xiphias Ge Zhu film düzenleme için teşekkür ederiz. Bu eser insan sınır bilim programı organizasyonu (PC) tarafından desteklenmiştir.

Hayvan bakımı ve deney hayvan Kurulusları ve Rockefeller Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yordamlara göre yapıldı.
1. doku hazırlık
<ol><li>Kan tamamen dokudan kaldırılana kadar standart intrakardiyak perfüzyon ile ~ 20 mL 1 x 4 ° C'de fosfat tamponlu tuz (PBS) gerçekleştirin.</li>
	<li>Boyun ve kuyruk önemli ölçüde kasıldı kadar perfusate ~ 20 mL sabitleştirici çözeltisi (% 4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS içinde) 4 ° C'de geçin. Dikkat: PFA zehirlidir. Cilt, göz ve müköz membran ile temasından sakının. Çözümleri bir duman başlık içinde yapılmalıdır.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde zarar vermeden tüm yağ yastığı çıkarın ilgi yağ yastıkları incelemek. Künt uçlu forseps pinching veya doku sıkma önlemek için kullanın. Herhangi bir kürk ile disseke doku bulaşıcı kaçının.</li>
	<li>Dokuya %4 1 x PBS PFA gecede 4 ° C'de sonrası fix Her yağ yastığı, ~ 10 mL fiksasyon çözeltisi 15 mL konik tüp ile sonrası düzeltme için.</li>
	<li>Doku oda sıcaklığında (RT) 3 kez (1 h her) 1 x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Kısa süreli (en fazla 2 hafta) için doku 1 x PBS 4 ° C'de depolayın ve ışıktan korunan. (Örneğin, 1-2 yıl) uzun süreli depolama için arabellek 1 x PBS ile % 0.05 sodyum azid (koruyucu olarak) geçiş yapar. Dikkat: Sodyum azid sözlü olarak yutulur veya deri yoluyla emilir çok zehirli. Sodyum azid çözümleri (% 5 ya da daha fazla) bir duman başlık altında ele alınmalıdır yoğunlaşmıştır.</li>
</ol>2. Delipidation ve Permeabilization
Zamanlama: 1-2 gün
<ol><li>% 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol degradeyle B1n arabellek (Tablo 1) (v/v), Örneğin, % 20 metanol/B1n arabelleği için hazırlamak, mix 20 mL metanol ve B1n arabelleği 80 mL. Tüm arabellekleri 4 ° C'de depolayın Glisin kristalleri doygunluk nedeniyle % 60 ve % 80 metanol/B1n arabellekleri çökelti. Kristalleri kaldırma kaçının; sıvı çözüm için aşağıdaki yıkar kullanın. Dikkat: Metanol uçucu, tahriş edici ve yanıcı. Cilt ve göz temasından kaçının.</li>
	<li>Yavaşça saç örnek bir diseksiyon mikroskop altında kaldırın. Herhangi bir saç, tüysüz veya örneğe bağlı enkaz gölgeler görüntüleme sırasında neden olur. Temizlenmiş örnek yeni bir tüp içine aktarın.</li>
	<li>Aksi belirtilmedikçe buz veya 4 ° C'de tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Küçük örnekleri için (Örneğin, posterior subkutan/perigonadal yağ yastıkları genç yalın fareler üzerinden), 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri ya da yüksek lipid içerikli (Örneğin, obez farelerin gelen yağ yastıkları) örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın.<ol>
<li>Yatay olarak ayarlanan bir orbital çalkalayıcı üzerinde örnekleri içeren tüpler yer ~ 100 rpm. Örnekleri tüp içinde özgürce hareket edebilirsiniz emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>% 20, % 40, %60, % 80 ve % 100 metanol/B1n arabellek kademeli bir dizi örnek belirtilen süre (Tablo 2) kurutmak. Etkilenmişimdir çözüm en aza indirmek.</li>
	<li>Delipidate ile % 100 diklorometan (DCM) örnek (3 kez), her kuluçka süresi ile Tablo 2' de belirtti. Örnek ikinci ve üçüncü DCM yıkar, sonundaki tüp altına lavabo. Aksi takdirde, tam delipidation emin olmak için kuluçka süresini uzatmak (Örneğin, 1-2 h 30 dk genişletmek). Dikkat: DCM duman çuval içinde ele alınmalıdır. Polipropilen incubations için yapılmış depolama ve microcentrifuge tüpler için cam kaplar kullanın. Microcentrifuge tüpler DCM uzun süreli depolama için kullanılmamalıdır. Petri yemekler ve polistiren yapılan serolojik pipetler DCM ile uyumlu değildir. DCM çok kırılgandır. Örnek hızlı kuruma önlemek için taze çözüm aktarın.</li>
	<li>İki kere % 100 metanol ile belirtilen süre (Tablo 2) yıkayın.</li>
	<li>İsteğe bağlı: örnek iyi perfused değilse, kalan kırmızı kan hücreleri hemoglobin rengini güçlü autofluorescence neden olabilir. Metanol (metanol, 5 cilt için % 30 H2O2 1 birim) içinde % 5 H2O2 ile gecede 4 ° C'de çamaşır suyu.</li>
	<li>Örnek bir ters metanol/B1n arabellek dizi rehydrate: %80, % 60, %40, % 20 metanol/B1n ve %100 B1n (2 kez) belirtilen süre (Tablo 2) arabellek.</li>
	<li>PTxwH arabellek (Tablo 1) için 2 h ile örnek RT. yıkama</li>
	<li>Delipidated örnek PTxwH arabellek 4 ° c (en fazla 1 yıl) depolamak veya hemen immunostaining adıma geçin.</li>
</ol>3. bütün Dağı Immunostaining
Zamanlama: 8-10 gün
Not: Aşağıdaki adımların tümünü RT aksi, sallayarak ve ışık koruma ile belirtilmediği sürece yapılmalıdır. Küçük örnekleri için 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın. Bu ilk küçük parçalar halinde dokusu veya doku metanol tedavi bölümleri üzerinde antikorlar doğrulamak için tavsiye edilir.
<ol><li>Önerilen konsantrasyonu PTxwH arabellekte birincil antikor sulandırmak. ~ 20.000 x g tanıtımı antikor precipitates veya toplamalardan önlemek 10 dk de seyreltilmiş antikor çözüm santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Delipidated örnek birincil antikor çözüm ile belirtilen süre (Tablo 2) için kuluçkaya.</li>
	<li>PTxwH arabellek ile örnek bir dizi kuluçka adımı yıkama: 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 1 h, 2 h, 4 h ve geceleme.</li>
	<li>Önerilen konsantrasyonu PTxwH arabellekte ikincil antikor sulandırmak. ~ 20.000 x g tanıtımı antikor precipitates veya toplamalardan önlemek 10 dk de seyreltilmiş antikor çözüm santrifüj kapasitesi. Not: kırmızı ve far-red bölgelerinde ışık yayarlar fluorophores ile Birleşik ikincil antikorları yüksek arka plan doku autofluorescence tarafından neden önlemek için tavsiye edilir. Lazer bir mikroskobunun kullanılabilir hatları sayısına bağlı olarak en çok 3-4 işaretleri aynı anda bir örnek yansıma.</li>
	<li>Örnek ikincil antikor çözüm ile belirtilen süre (Tablo 2) için kuluçkaya.</li>
	<li>PTxwH arabellek kuluçka adımları bir dizi ile yıkama örnek: 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 1 h, 2 h, 4 h ve geceleme.</li>
	<li>İsteğe bağlı: kırılgan doku türleri için %4 1 x PBS PFA gecede 4 ° C doku morfoloji korumaya yardımcı olmak ile lekeli doku düzeltmek. Not: Bu adım görüntüleme arka plan artabilir. Yağ dokusu için bu adımı gerçekleştirmek gerekli değildir.</li>
	<li>1 x PBS ile örnek bir dizi kuluçka adımı yıkama: 5 dk, 10 min ve 30 dak.</li>
	<li>Yavaşça tüysüz bir diseksiyon mikroskop altında örnek kaldırın.</li>
</ol>4. doku takas
Zamanlama: 1-2 gün
<ol><li>İsteğe bağlı: örnek örnek montaj ışık sayfalık Mikroskopi için kolaylaştırmak için özel katıştırın. Not: Bu adımı sırasında görüntüleme şeklini dengelemeye yağ dokusu için önemle önerilir.<ol>
<li>1 x PBS (w/v) % 1'özel gömme çözümle hazırlayın. Gömme çözümü cool ~ 40 ° C arasında aşırı sıcağa örnek kullanılmasını önlemek için.</li>
		<li>Temizlenmiş örnek (Örneğin, Petri kabına veya tekne tartı) bir kalıp yerleştirin ve istediğiniz pozisyona düzenlemek. Herhangi bir sıvı ertelenmiş kaçının. Yavaşça gömme çözüm örnek dökün. Herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.</li>
		<li>Tam olarak örnek içeren bir bloğun RT. keser kuvvetlendirmek özel izin. Not: Tüm gece incubations de dahil olmak üzere aşağıdaki adımları RT, sallayarak ve ışık koruma ile yapılmalıdır. Küçük örnekleri için 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Metanol gradient H2O: % 25, % 50, % 75 ve % 100 (3 kere) örnekte belirtilen süre (Tablo 2) kurutmak. Not: Örnek gecede %100 metanol adımda bırakılabilir.</li>
	<li>% 100 DCM (3 kere) sallayarak ile 1 h için örnekte kuluçkaya. Örnek tüp her DCM yıkama sonunda altına lavabo. Eğer değilse, metanol tam kaldırılmasını sağlamak için kuluçka süresini uzatmak. Örnek bir gecede %100 DCM adımda bırakılabilir.</li>
	<li>Örnek dibenzyl eter (DBE) gecede kırılma indisi eşleştirme elde etmek için hafif sallayarak ile kuluçkaya. Not: Örnek sonunda görünür ışık şeffaf olacak. Dikkat: DBE zararlıdır. Herhangi bir cilt ile temasından sakının. Çift katmanlı eldiven ile duman örtünün içinde hallederim. En kısa zamanda DBE ile kontamine eldiven atma. Cam kaplar için depolama ve microcentrifuge tüpler (Polipropilen) incubations için kullanın. Microcentrifuge tüpler DBE uzun süreli depolama için kullanılmamalıdır. Petri yemekler ve polistiren yapılan serolojik pipetler DBE ile uyumlu değildir. Temiz bir % 100 etanol ile bile ziyan.</li>
	<li>Taze ete ile örnek 2 h. deposu için örneği RT'karanlıkta sallayarak hafif kuluçkaya veya doğrudan görüntüleme için devam edin. Not: Örnekleri bir ay içinde yansıması için tavsiye edilir. Bazı fluorophores diğerlerinden daha kararlıdır olmakla birlikte, bu aşamada örnekleri uzun süreli depolama tavsiye edilmez.</li>
</ol>5. mikroskobu
<ol><li>DBE ile uyumlu olan ışık sayfalık mikroskop ile görüntüleme. Not: organik solvent bazlı görüntüleme için onaylanmış ve DBE kırılma indisi ile eşleşen tek amaçları hedefleri DBE dalmış görüntülemede daldırma olarak kullanılabilir.<ol>
<li>Görüntüleme sırasında hareketi engelleyen bir tutucu üzerine özel katıştırılmış örnek bağlayın. Örnek DBE dolu bir odaya sokmak.</li>
		<li>Bir z-yığın (Örneğin, 1-2 X büyütme) Bütün doku dağıtım/yapısı işaretin ilgi elde etmek için tüm örnek kapsayan toplamak.</li>
		<li>Bir amaç (Örneğin, 4-12 X büyütme) faiz detaylı yapıları görüntü bölgelerinde yakınlaştırmak için daha yüksek büyütme ile geçin. Not: Kollajen tüm yağ hücrelerinin13çevreleyen yağ dokusu hücre dışı matriks için büyük bir katkıda bulunuyor. Kolajen vardır yaklaşık 400 arasında değişen bir tipik emisyon spektrum nm 550 nm14. Örnek (yeşil) 488 lazer çizgi ile görüntüleme ve kollajen (Örneğin, 525-550 nm) emisyon spektrum içinde yatıyor bir dalga boyu aralığı verilmiş ışık toplama için daha önce gösterilen doku autofluorescence sinyal sağlayacak yağ hücre kontur ve genel doku mimari12betimlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir ters confocal görüntüleme veya iki fotonlu mikroskop.<ol>
<li>Özel katıştırılmış örnek cam alt odası slaytla herhangi bir plastik parçalar (veya mühürleyebilirsiniz diğer DBE uyumlu görüntüleme odası) dokunmadan yerleştirin. DBE kaçak değil emin olun.</li>
		<li>Objektif ile daha derin nüfuz elde etmek için daha uzun çalışma mesafeler seçin. Not: Görüntüleme odası slayt cam alt aracılığıyla ters bir confocal veya iki fotonlu mikroskop ile yapılmalıdır. Örnek ve daldırma DBE tabanlı görüntüleme için önerilen değil hedefleri arasında doğrudan temastan kaçının.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3934003/">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li>
<li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development%2C+expansion+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li>
<li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li>
<li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li>
<li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+A+Simple%2C+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li>
<li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis%3A+Role+of+Collagen+VI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging%3A+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry+EJH%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li>
<li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li>
<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Adipo-temiz yağ dokusu, normal laboratuar kurulumunda kolayca gerçekleştirilebilir temizlenmesi için bir basit ve sağlam yöntemdir. İDISCO gibi diğer solvent bazlı temizleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear özellikle yağ dokusu ve diğer doku yüksek yağ içeriği ile temizlenmesi için optimize edilmiştir. Delipidation adım lipitler yağ tamamen kaldırır ve bu nedenle immunolabeling tüm doku boyunca...

Yakın zamana kadar yağ dokusu ve yağ hücrelerinin amorf bir topluluğu olarak tasarlandı. Son birkaç on yıl içinde anladığımız kadarıyla şimdi farklı türde adiposit yanı sıra adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, damarlara ve sinir projeksiyonlar içeren karmaşık bir organ olduğu kabul yağ ile daha sofistike büyüdü. Bu yağ yerleşik hücreler arasındaki etkileşimler yağ dokusu ve organizma fizyolojisi ve patofizyolojisi1etkileri belirgin. Her ne kadar ortaya çıkan çalışmalar bazı etkileşimler yatan önemli moleküler mekanizmaları sökülmüş, daha kapsamlı bir anlayış tüm doku üç boyutlu (3D) güvenilir yapısal profilleme gerektirir.
Geçerli bilgimizi yağ dokusu morfolojisi histolojik Analize ince kesitler (5 mikron) nispeten yüksek büyütme görüntüleme (daha--dan 10 X) ile büyük ölçüde dayalı2,3. Ancak, bu yaklaşım bazı önemli sınırlamaları vardır. İlk, karmaşık ipliksi yapılar adipose işlev4,5,6,7' önemli roller oynamak için bilinir, sempatik sinirler ve damarlara gibi değerlendirmek zordur ince kesitler. İkinci olarak, görünüşte amorf şeklini ve odaklanmak için temsilcisi yapısal birim eksikliği nedeniyle, yalnızca bölüm boyama temel yağ dokusu yapıları takdir etmek zordur. Üçüncü olarak, yağ dokusu 3D anatomik imar, tüm beyin morfoloji8çalışma için kullanılan geleneksel bir yöntem için uygun tutarlı seri bölümler elde etmek zorluklar oluşturma bir çok yüksek lipid içeriğe sahiptir. Bu faktörler göz önüne alındığında, hala hücresel çözünürlük elde ederken tüm yağ depo 3D görselleştirme sağlayabilir bir bütün-mount yaklaşım için büyük bir ihtiyaç var.
3D hacimsel görüntüleme tüm bir organ ışık saçılım belirsiz etkileri nedeniyle meydan okuyor. Biyolojik dokuların içinde ışık saçılım önemli bir kaynağı lipid sulu arabirimlerden geliyor. Çabaları dağılım lipidler kaldırarak ortadan kaldırmak için bir yüzyıl boyunca devam edecek olmasına rağmen çok sayıda son yenilikleri9olmuştur. Bir tür yeni geliştirilen doku Temizleme immunolabeling etkin 3D görüntüleme solvent seçilmemiş organların yöntemidir (iDISCO / iDISCO +)10,11. Ancak, yağ dokusu lipidler, onun yüksek düzeyde verilen belirli bir meydan okuma sunuyor ve bu nedenle, iDISCO ek değişiklikler / iDISCO + Protokolü tamamen çöken gelen doku koruyarak lipidler ayıklamak için gereklidir. Geliştirdiğimiz, şimdi Adipo-temiz, adı değiştirilmiş Protokolü metanol/diklorometan tabanlı delipidation yağ dokusunun en iyi şeffaflık yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleme12için uygun elde etmek için kullanır. Çünkü büyük ölçüde endogenously ifade quenches floresan proteinler GFP ve RFP gibi delipidation adım, görselleştirme gibi proteinlerin immunolabeling tarafından sağlanmalıdır. Genel olarak, bu basit ve sağlam iletişim kuralı yağ yerleşik hücre, doku düzeyinde organizasyon eğitim için uygulanabilir adipocyte progenitör hücrelerin ve yağ morfogenez soy izleme geliştirme sırasında.

<table><tbody><tr><td>1x fosfat tamponlu tuzlu</td><td>su Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit %30</td> <td>Fisher Scientific</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>Benzil eter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-Tirozin Hidroksilaz</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Keçi poliklonal anti-CD31 / PECAM-1</td><td>R & D Sistemleri</td><td>AF3628</td><td>2 ve mikro nihai konsantrasyon; g / mL</td></tr><tr><td>Sıçan monoklonal anti-CD68, Klon FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>2 ve mikro nihai konsantrasyon; g / mL</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan IgG (H + L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>5-10 ve mikro nihai konsantrasyon; g / mL</td></tr><tr><td>Eşek anti-keçi IgG (H + L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Nihai konsantrasyon 5-10 & mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Eşek anti-sıçan IgG (H + L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>Nihai konsantrasyon 5-10 & mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Görüntüleme odası</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>Işık tabakası mikroskobu</td><td>LaVision BioTec Ultramikroskop</td><td>II</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopi görselleştirme yazılımı</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-clear: bir doku yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Yağ dokusu enerji homeostazı ve termoregülasyon merkezi bir rol oynar. Adipositler, hem de adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, kan damarları ve sinir projeksiyonlar farklı türde oluşur. Her ne kadar hücre türü belirtimi moleküler kontrolü ve bu hücreler arasındaki etkileşimle giderek tarif, bu yağ yerleşik hücreler daha kapsamlı bir anlayış, kendi dağıtım ve mimari görselleştirme tarafından elde edilebilir Bütün doku. Adipose Histoloji analiz etmek için varolan immünhistokimya ve ayirt yaklaşımlar üzerinde ince parafin gömülü kısımlar dayanmaktadır. Ancak, ince kesitler doku yalnızca küçük bir bölümünü yakalamak; Sonuç olarak, sonuçları doku hangi bölümünü analiz tarafından önyargılı. Bu nedenle teknik, moleküler ve hücresel kalıplarının kapsamlı üç boyutlu görselleştirme içinde tüm yağ doku izin vermek için Adipo-temiz, takas bir yağ dokusu geliştirdik. Adipo-net iDISCO adapte / iDISCO +, belirli değişiklikler ile yapılan için tamamen doğal doku morfoloji koruyarak doku içinde depolanan lipid kaldırmak. Işık sayfalık floresans mikroskobu ile birlikte, biz burada tüm bir yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüler elde etmek için Adipo-Clear yöntemi kullanımını göstermektedir.

Adipo-Clear tüm Yağ yastıkları 3D doku Morfoloji ve hücresel etkileşimlerin yalın ve obez Amerika'da nasıl etkilendiğini analiz etmek için yansıma hazırladı. Bu yöntem doku autofluorescence sinyal yeşil kanal toplayarak genel yağ yapısı analiz etmek için kolayca uygulanabilir. Biz daha önce autofluorescence göstermiştir sinyal olumlu perilipin boyama, Olgun adiposit12anahat için yaygın olarak kullanılan bir marker ile yağ bindirmeleri. Örneğin, bir ışık sayfalık mi...

Yüksek lipid içeriği nedeniyle yağ dokusu geleneksel histolojik yöntemlerle görselleştirmek için zor oldu. Adipo-temiz sağlam etiketleme ve yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel floresan görüntüleme sağlayan tekniği temizleyerek bir dokudur. Burada, numune hazırlama, ön, boyama, takas ve montaj için görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Bu yöntem, Yağ Dokusunun farklı bileşenlerinin tüm bir dokuda nasıl etkileşime girdiği gibi Yağ Dokusu Biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, üç boyutlu mimarisini korurken Yağ Dokusunda depolanan fazla lipitleri tamamen uzaklaştırmasıdır. Bu yöntem, Yağ Dokusunun bu üç boyutlu organizasyonu hakkında bilgi verebilirken, genellikle hafıza bezi ve lenf bezi gibi yüksek lipid içeriğine sahip diğer dokulara da uygulanabilir.Delipidasyon ve temizleme adımları, belirlenmesi zor olabilen yeterli inkübasyon süreleri gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Taze perfüze edilmiş bir hayvan modelinden ilgilenilen yağ pedini incelemek için künt uçlu forseps kullanarak başlayın. Dokuyu sıkıştırmadan veya sıkmadan veya disseke edilmiş dokuyu kürkle kirletmeden tüm fad pedini dikkatlice çıkarın.Yağ pedini 15 mililitrelik konik bir tüpte yaklaşık 10 mililitre sabitleme solüsyonuna yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Numuneyi PBS ile yıkadıktan sonraki gün, numunedeki kalıntıları bir diseksiyon mikroskobu altında nazikçe temizleyin. Numuneye yapışan saç, tüy veya diğer kalıntılar, görüntüleme sırasında gölgelere neden olur.Temiz numuneyi buz gibi, yüzde 20 metanol B1N tamponu içeren bir polipropilen tüpe aktarın. Numuneyi içeren tüpü yatay olarak bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin, 100 RPM'ye ayarlayın ve numunenin boyutuna bağlı olarak 30 dakika ila 1 saat arasında çalkalayın. Numunelerin tüpün içinde serbestçe hareket edebildiğinden emin olun.B1N tamponunda yüzde 40, yüzde 60 ve yüzde 80 metanol ve ardından yüzde 100 metanol içeren kademeli bir dizi ile numuneleri dehidre etmeye devam edin. Taşıma çözümünü en aza indirin. Dehidrasyonun ardından, numuneyi delipide etmek için yüzde 100 metanol çözeltisini yüzde 100 diklorometan veya DCM ile değiştirin.Tablo 2'de listelenen inkübasyon sürelerini takip ederek yıkamayı iki kez tekrarlayın. Numune, ikinci ve üçüncü DCM yıkamalarının sonunda tüpün dibine batmalıdır. Değilse, tam delipidasyonu sağlamak için inkübasyon süresini uzatın.Delipidasyondan sonra, tablo 2'de belirtilen süre boyunca yüzde 100 metanol ile iki kez yıkayın. Numuneyi, tablo 1'de belirtilen süreler için ters çevrilmiş bir metanol B2N tampon serisinde yeniden sulandırın. Rehidrasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 2 saat boyunca PTXWH tamponu ile yıkayın.Numune artık immün boyama için hazırdır veya 1 yıla kadar 4 santigrat derecede PTXWH tamponunda saklanabilir. İlk olarak, PTXWH tamponundaki birincil antikoru önerilen konsantrasyona seyreltin. Daha sonra, antikor çökeltilerinin veya agregasyonlarının girmesini önlemek için seyreltilmiş antikor çözeltisini 20 bin G'de 10 dakika santrifüjleyin.Metanol ve DCM tedavisi ile uyumlu uygun primer antikorların seçilmesi önemlidir. Yeni antikorlar, küçük doku parçaları veya metanol ile muamele edilmiş doku bölümleri ile doğrulanmalıdır. Delipidlenmiş numuneyi, numunenin boyutuna bağlı olarak 3 ila 5 gün boyunca birincil antikor çözeltisi ile inkübe edin.Birincil inkübasyondan sonra, numuneyi birkaç PTXWH tamponu değişikliği ile yıkayın. Ertesi gün, PTXWH tamponundaki ikincil antikoru önerilen konsantrasyona seyreltin. Seyreltilmiş antikor çözeltisini daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.Numuneyi, numunenin boyutuna bağlı olarak 3 ila 5 gün boyunca ikincil antikor çözeltisi ile inkübe edin. Yine, numuneyi daha önce olduğu gibi bir dizi inkübasyon adımında PTXWH tamponu ile yıkayın. Ertesi gün, numuneyi 1XPBS ile 5 dakika, 10 dakika ve ardından 30 dakika yıkayın.Hafif tabaka mikroskobu için numune montajını kolaylaştırmak için Yağ Dokusunu agaroza gömün. İlk olarak, 1XPBS'de yüzde 1 agaroz içeren gömme çözeltisini hazırlayın. Numuneyi aşırı ısıya maruz bırakmaktan kaçınmak için gömme solüsyonunu yaklaşık 40 santigrat dereceye kadar soğutun.Sıvı taşınmasını önlerken, temizlenmiş doku örneğini bir kalıba yerleştirin ve istenen konuma yerleştirin. Ardından, hava kabarcıklarından kaçınarak gömme solüsyonunu numunenin üzerine nazikçe dökün. Agaroz katılaşmadan önce herhangi bir hava kabarcığı çevreye taşınmalıdır.Agaroz tamamen katılaştıktan sonra, numuneyi içeren bir blok kesin. Numuneyi sudaki yüzde 25 metanole aktarın, ışıktan koruyun ve tablo 2'de gösterilen süre boyunca çalkalayarak inkübe edin. Numuneyi bir metanol gradyanı ile kurutmaya devam edin.Numuneyi çalkalayarak 1 saat boyunca yüzde 100 DCM'de inkübe edin. DCM Yıkanmış numuneler havada kolayca kurur, bu da numunenin berraklığını etkiler ve bulanık görüntülere neden olur. Kurumayı önlemek için numunelerin hızlı bir şekilde taze çözeltiye aktarılması önemlidir.Numune, her DCM yıkamasının sonunda tüpün dibine batmalıdır. Kırılma indisi eşleşmesini elde etmek için numuneyi gece boyunca Dibenzil eter veya DBE'de hafif çalkalama ile inkübe edin. Numune sonunda şeffaf, görünmez ışık haline gelecektir.Ertesi gün, numuneyi 2 saat boyunca hafif çalkalanarak taze DBE ile inkübe ettikten sonra, numuneyi oda sıcaklığında karanlıkta saklayın veya doğrudan görüntülemeye devam edin. Numuneyi DBE ile uyumlu bir ışık tabakası mikroskobu ile görüntülemek için, agaroz gömülü numuneyi, görüntüleme sırasında hareketi önleyebilecek bir tutucuya monte edin. Numuneyi ters çevrilmiş konfokal veya iki fotonlu bir mikroskopla görüntülemek için, agaroz gömülü numuneyi cam tabanlı bir oda kızağına yerleştirin.Düşük büyütmeli bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak posterior subkutantiöz yağ yastığının taranması, Adipositlerin lobüler organizasyonunu gösterir. Adipositlerin boyutu gibi daha ayrıntılı bilgiler, daha yüksek büyütme ile ilgilenilen bölgelere yakınlaştırma yapılarak ortaya çıkarılabilir. Sempatik sinir sistemi için bir belirteç olan Tirozin Hidroksilaz ile boyanmış posterior subkutantöz yağ yastıkçığı, ışık tabakası floresan mikroskobu ile görüntülendi.TH boyama, buradaki okla gösterildiği gibi büyük sinir demetleri olarak görünen yapıları ortaya çıkardı. Kan damarı innervasyonu ve doku parankiminde yoğun terminal arborizasyon da TH boyaması ile ortaya çıkar. Kan damarlarını etiketlemek için bir belirteç olarak CD31 olarak da bilinen trombosit endotel hücresi adezyon molekülü veya PCAM1 kullanılarak, tüm Adipositlerin tüm doku boyunca kılcal damarlarla temas halinde olduğu ve Adipozda verimli besin ve oksijen değişimi için yüksek talebi desteklediği gözlenmiştir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Adipoz Biyolojisi alanındaki araştırmacıların, Adiposit Progenitörlerinin erken doku morfogenezi ve kader haritalaması gibi ek soruları keşfetmelerinin yolunu açtı. İnsan Yağ Dokusunun histolojisini incelemek için de uygulanabilir. Paraformaldehit, metanol, diklorometan ve Dibenzil eter ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken çeker ocak ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Büyük dokular içindeki floresan etiketli hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için, ideal olarak, biyolojik numuneler kesitlere ayrılmadan görüntülenmelidir. 3DISCO, organik çözücülerle sıralı inkübasyona dayanan basit bir doku temizleme prosedürüdür. Temizlendikten sonra, organlar şeffaf hale gelir ve numunenin uçtan uca lazer taramasına izin verir.

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Nedeniyle obezite ve diğer yandaş arasındaki şiddetli ve negatif bağlantı, rol adipoz araştırma hastalığında oynadığı ve genel sağlık garantilidir. Biz izolasyon ve yerinde kullanarak adipoz çalışması için izin yağ depolarında eksizyonu ve in vitro yöntemler bir protokol mevcut.

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Yağ dokusu mimarisi ve hücresel bileşeni 3D görüntüleme için ideal bir yöntem olarak bütün Dağı immunostaining ve görselleştirme tekniği göstermek için çalışmanın odak noktasıdır.

Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Yeni kan damarı oluşumu ve sempatik innervasyon yağ dokusu remodeling içinde önemli rol oynarlar. Ancak, görselleştirme ve kantitatif yağ dokusu ölçme teknik sorunlar kalır. Burada başarılı bir şekilde etiketleyin ve kantitatif kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ dokularında yoğunlukları karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut.

Kan damarları ve sinir lifleri yağ dokusu içinde Co boyama

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Burada, hem fare hem de insan beyaz yağ dokusunun 3Boyutlu yapısını çözüme kavuşturmak için basit, ucuz ve hızlı bir temizleme yöntemi tanımlıyoruz.

Metiyatisilin Temizleme ve 3D Görüntüleme ile Yağ Dokusu Yapısının Araştırılması

Preadipositler, yenidoğan farelerden alınan interskapular kahverengi yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir ve lipid damlacıkları biriktiren, moleküler belirteçleri eksprese eden ve olgun kahverengi adipositlerin mitokondriyal morfolojisini gösteren hücrelere farklılaşır. Bu hücreler ayrıca immünofloresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilir.

Yenidoğan Farelerden İnterskapular Yağ Dokusunun Stromal Vasküler Fraksiyonundan Kahverengi Adipositlerin Farklılaşması ve Görüntülenmesi

Burada, insan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC'ler) mikrovasküler endotel hücrelerinin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modelini açıklıyoruz.

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Burada, murin aortunu üç boyutlu (3D) olarak görüntülemek için optimize edilmiş doku temizleme protokolleri sunuyoruz. Aterosklerozda adventiti ve aterosklerozda periferik sinir sisteminin aterosklerotik plaklarla anatomik yakınlığını tanımlamak amacıyla immün boyama, optik temizleme ve görüntüleme için son teknoloji prosedürleri betimliyoruz.

Aterosklerozda Aort Dokularının Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Proteinler, farklı aktin bağlayıcı modüller aracılığıyla ipliksi aktin (F-aktin) bağlanır. Bu video in vitro testinin rutin olarak, F-aktin bağlayan proteinler ya da belirli etki analiz etmek için kullanılan bir co-sedimantasyon, aktin prosedürü göstermektedir.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

Keşfedin, yağ dokusunun üç boyutlu yapısını koruyarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan Adipo-Clear doku temizleme yöntemini. Bu teknik, adipositlerin karmaşık etkileşimlerini incelemek için araştırmacılara yeni olanaklar sunar.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Daha fazla video keşfet