Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Bu yöntem, Yağ Dokusunun farklı bileşenlerinin tüm bir dokuda nasıl etkileşime girdiği gibi Yağ Dokusu Biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, üç boyutlu mimarisini korurken Yağ Dokusunda depolanan fazla lipitleri tamamen uzaklaştırmasıdır. Bu yöntem, Yağ Dokusunun bu üç boyutlu organizasyonu hakkında bilgi verebilirken, genellikle hafıza bezi ve lenf bezi gibi yüksek lipid içeriğine sahip diğer dokulara da uygulanabilir.

Delipidasyon ve temizleme adımları, belirlenmesi zor olabilen yeterli inkübasyon süreleri gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Taze perfüze edilmiş bir hayvan modelinden ilgilenilen yağ pedini incelemek için künt uçlu forseps kullanarak başlayın. Dokuyu sıkıştırmadan veya sıkmadan veya disseke edilmiş dokuyu kürkle kirletmeden tüm fad pedini dikkatlice çıkarın.

Yağ pedini 15 mililitrelik konik bir tüpte yaklaşık 10 mililitre sabitleme solüsyonuna yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Numuneyi PBS ile yıkadıktan sonraki gün, numunedeki kalıntıları bir diseksiyon mikroskobu altında nazikçe temizleyin. Numuneye yapışan saç, tüy veya diğer kalıntılar, görüntüleme sırasında gölgelere neden olur.

Temiz numuneyi buz gibi, yüzde 20 metanol B1N tamponu içeren bir polipropilen tüpe aktarın. Numuneyi içeren tüpü yatay olarak bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin, 100 RPM'ye ayarlayın ve numunenin boyutuna bağlı olarak 30 dakika ila 1 saat arasında çalkalayın. Numunelerin tüpün içinde serbestçe hareket edebildiğinden emin olun.

B1N tamponunda yüzde 40, yüzde 60 ve yüzde 80 metanol ve ardından yüzde 100 metanol içeren kademeli bir dizi ile numuneleri dehidre etmeye devam edin. Taşıma çözümünü en aza indirin. Dehidrasyonun ardından, numuneyi delipide etmek için yüzde 100 metanol çözeltisini yüzde 100 diklorometan veya DCM ile değiştirin.

Tablo 2'de listelenen inkübasyon sürelerini takip ederek yıkamayı iki kez tekrarlayın. Numune, ikinci ve üçüncü DCM yıkamalarının sonunda tüpün dibine batmalıdır. Değilse, tam delipidasyonu sağlamak için inkübasyon süresini uzatın.

Delipidasyondan sonra, tablo 2'de belirtilen süre boyunca yüzde 100 metanol ile iki kez yıkayın. Numuneyi, tablo 1'de belirtilen süreler için ters çevrilmiş bir metanol B2N tampon serisinde yeniden sulandırın. Rehidrasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 2 saat boyunca PTXWH tamponu ile yıkayın.

Numune artık immün boyama için hazırdır veya 1 yıla kadar 4 santigrat derecede PTXWH tamponunda saklanabilir. İlk olarak, PTXWH tamponundaki birincil antikoru önerilen konsantrasyona seyreltin. Daha sonra, antikor çökeltilerinin veya agregasyonlarının girmesini önlemek için seyreltilmiş antikor çözeltisini 20 bin G'de 10 dakika santrifüjleyin.

Metanol ve DCM tedavisi ile uyumlu uygun primer antikorların seçilmesi önemlidir. Yeni antikorlar, küçük doku parçaları veya metanol ile muamele edilmiş doku bölümleri ile doğrulanmalıdır. Delipidlenmiş numuneyi, numunenin boyutuna bağlı olarak 3 ila 5 gün boyunca birincil antikor çözeltisi ile inkübe edin.

Birincil inkübasyondan sonra, numuneyi birkaç PTXWH tamponu değişikliği ile yıkayın. Ertesi gün, PTXWH tamponundaki ikincil antikoru önerilen konsantrasyona seyreltin. Seyreltilmiş antikor çözeltisini daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.

Numuneyi, numunenin boyutuna bağlı olarak 3 ila 5 gün boyunca ikincil antikor çözeltisi ile inkübe edin. Yine, numuneyi daha önce olduğu gibi bir dizi inkübasyon adımında PTXWH tamponu ile yıkayın. Ertesi gün, numuneyi 1XPBS ile 5 dakika, 10 dakika ve ardından 30 dakika yıkayın.

Hafif tabaka mikroskobu için numune montajını kolaylaştırmak için Yağ Dokusunu agaroza gömün. İlk olarak, 1XPBS'de yüzde 1 agaroz içeren gömme çözeltisini hazırlayın. Numuneyi aşırı ısıya maruz bırakmaktan kaçınmak için gömme solüsyonunu yaklaşık 40 santigrat dereceye kadar soğutun.

Sıvı taşınmasını önlerken, temizlenmiş doku örneğini bir kalıba yerleştirin ve istenen konuma yerleştirin. Ardından, hava kabarcıklarından kaçınarak gömme solüsyonunu numunenin üzerine nazikçe dökün. Agaroz katılaşmadan önce herhangi bir hava kabarcığı çevreye taşınmalıdır.

Agaroz tamamen katılaştıktan sonra, numuneyi içeren bir blok kesin. Numuneyi sudaki yüzde 25 metanole aktarın, ışıktan koruyun ve tablo 2'de gösterilen süre boyunca çalkalayarak inkübe edin. Numuneyi bir metanol gradyanı ile kurutmaya devam edin.

Numuneyi çalkalayarak 1 saat boyunca yüzde 100 DCM'de inkübe edin. DCM Yıkanmış numuneler havada kolayca kurur, bu da numunenin berraklığını etkiler ve bulanık görüntülere neden olur. Kurumayı önlemek için numunelerin hızlı bir şekilde taze çözeltiye aktarılması önemlidir.

Numune, her DCM yıkamasının sonunda tüpün dibine batmalıdır. Kırılma indisi eşleşmesini elde etmek için numuneyi gece boyunca Dibenzil eter veya DBE'de hafif çalkalama ile inkübe edin. Numune sonunda şeffaf, görünmez ışık haline gelecektir.

Ertesi gün, numuneyi 2 saat boyunca hafif çalkalanarak taze DBE ile inkübe ettikten sonra, numuneyi oda sıcaklığında karanlıkta saklayın veya doğrudan görüntülemeye devam edin. Numuneyi DBE ile uyumlu bir ışık tabakası mikroskobu ile görüntülemek için, agaroz gömülü numuneyi, görüntüleme sırasında hareketi önleyebilecek bir tutucuya monte edin. Numuneyi ters çevrilmiş konfokal veya iki fotonlu bir mikroskopla görüntülemek için, agaroz gömülü numuneyi cam tabanlı bir oda kızağına yerleştirin.

Düşük büyütmeli bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak posterior subkutantiöz yağ yastığının taranması, Adipositlerin lobüler organizasyonunu gösterir. Adipositlerin boyutu gibi daha ayrıntılı bilgiler, daha yüksek büyütme ile ilgilenilen bölgelere yakınlaştırma yapılarak ortaya çıkarılabilir. Sempatik sinir sistemi için bir belirteç olan Tirozin Hidroksilaz ile boyanmış posterior subkutantöz yağ yastıkçığı, ışık tabakası floresan mikroskobu ile görüntülendi.

TH boyama, buradaki okla gösterildiği gibi büyük sinir demetleri olarak görünen yapıları ortaya çıkardı. Kan damarı innervasyonu ve doku parankiminde yoğun terminal arborizasyon da TH boyaması ile ortaya çıkar. Kan damarlarını etiketlemek için bir belirteç olarak CD31 olarak da bilinen trombosit endotel hücresi adezyon molekülü veya PCAM1 kullanılarak, tüm Adipositlerin tüm doku boyunca kılcal damarlarla temas halinde olduğu ve Adipozda verimli besin ve oksijen değişimi için yüksek talebi desteklediği gözlenmiştir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Adipoz Biyolojisi alanındaki araştırmacıların, Adiposit Progenitörlerinin erken doku morfogenezi ve kader haritalaması gibi ek soruları keşfetmelerinin yolunu açtı. İnsan Yağ Dokusunun histolojisini incelemek için de uygulanabilir. Paraformaldehit, metanol, diklorometan ve Dibenzil eter ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken çeker ocak ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.