Protein Bazlı Hydrogels karakterize için kuvvet-kelepçe Rheometry

Bu tekniğin ana avantajları, protein hidrojel numunelerine kontrollü kuvvet protokolleri uygulamak için orantılı bir integral türev sistemi olan bir PID kullanması ve küçük numune hacmi kullanmasıdır. Kuvvet kelepçesi protokolleri, verilerin doğrudan yorumlanmasına izin verirken, yalnızca küçük miktarlarda mevcut olan proteinleri üretmek için zor olanlarla çalışırken düşük hacimler kritik öneme sahiptir. Bu tekniğin etkileri, proteinler için aşağı katlama, yeniden katlanma geçiş karakteristiği kullanarak, dayanıklı esnekliğe sahip yeni biyometrik malzemelerin geliştirilmesine ve karakterize edilmesine kadar uzanır.

Bu yöntem, milyarlarca protein molekülünün tek bir çekimde ölçülmesini sağlayarak ve biyolojik dokulara özgü kalabalık ortamları simüle ederek doku ve biyomalzeme mekaniğindeki sorulara cevap verebilir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi reaktif çözeltilerinin hazırlanması ile başlayın. Protein bazlı hidrojeli sentezlemek için, önce 23 gauge bir iğneyi preslenmiş bir pistonla bir mililitrelik bir şırıngaya sabitleyin.

Ardından, bir tıraş bıçağı kullanarak 10 santimetrelik bir politetrafloroetilen veya PTFE tüpü kesin. İğneyi ve şırıngayı PTFE tüpünün bir ucuna takın. Tüpün ikinci ucunu bir silan çözeltisine yerleştirin ve şırınga pistonunu geri çekerek tüpü doldurun.

Tüpü yaklaşık 30 dakika bekletin. Ardından, silan çözeltisini çıkarın ve tüpü basınçlı hava ile kurulayın. Şimdi, protein çözeltisini APS ve Tris(bipiridin)rutenyum(II)klorür ile sabit bir hacim oranı kullanarak 1.5 mililitrelik bir tüpte karıştırın.

Fotoaktif çözeltiyi tamamen karışana kadar vorteksleyin. Ardından, çözeltideki kabarcıkları gidermek için karışımı maksimum hızda santrifüjleyin. Hidrojel fotoaktif karışım Teflon tüpe yüklenirken kabarcıklar oluşabilir ve bu da numunenin hasar görmesine neden olabilir.

Kabarcık oluşumunu önlemek için, yükleme işlemi sırasında Teflon tüp ucunu çözelti karışımında tutun ve şırınga pistonunu yavaşça geri çekin. İşlem görmüş PTFE tüpünün açık ucunu fotoaktif karışıma yerleştirin ve şırınga pistonunu geri çekerek çözeltiyi tüpe çekin. Şimdi, yüklü tüpü ısınmasını önlemek için 100 watt'lık bir cıva lambasından yaklaşık 10 santimetre uzağa yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakikaya kadar orada tutun.

Tüpü iğneden çıkarın ve tüpün hidrojel uçlarının yakınındaki kenarlarını bir tıraş bıçağıyla kesin. Ardından, hidrojeli Tris çözeltisine ekstrüde etmek için körelmiş 24 gauge bir iğne kullanın. Jelleri ekstrüzyon sırasında veya kabarcıklar nedeniyle oluşabilecek herhangi bir kusur açısından görsel olarak inceleyin ve kusurlu jelleri atın.

Enstrüman kontrol programını başlatın ve ses bobini motorunu açın. Ardından, bobin konumunu aralığın sonuna doğru bir değere ayarlayın. Kancaları Z yönünde yerinden çıkarın ve X yönündeki kıvrımda hizalayın.

Ardından, X yönü için mikrometre vidalarının değerlerini kaydedin. Şimdi, dikiş ipliğinin ucuna, ilmeğin çapı yaklaşık dört milimetre olacak şekilde gevşek bir çift el üstü düğüm atın. Ardından, ilmeği telden kesin.

İkinci bir döngü oluşturmak için tekrarlayın. Ardından, iki halkayı kuvvet sensörüne bağlı kancaya yerleştirin. Deney odasını Tris tamponu ile doldurun ve hidrojel örneğini tıbbi cımbız kullanarak dolu odaya aktarın.

Ses bobinini ve kuvvet sensörü kancalarını çözelti yüzeyine yakın yerleştirin ve kancaları XYZ konumlandırma manipülatörleri ile her yöne hizalayın. Tıbbi cımbız kullanarak, protein hidrojel örneğinin her iki tarafını ses bobinine ve kuvvet sensörüne bağlı kancalara asın. Tipik bir hata, takma işlemi sırasında hidrojel numunelerinin etrafındaki sütür halkalarının aşırı sıkılmasıdır.

Bu, bir çentik oluşumuna ve hidrojel numunesinin kesilmesine yol açabilir. Sütür halkasının her iki ucunu tıbbi cımbızla tutarak ve aynı anda çekerek ses bobini kancasındaki hidrojel numunesinin etrafına bir dikiş halkasını dikkatlice sıkın. Kuvvet sensörüne bağlı döngü için bu adımı tekrarlayın.

Herhangi bir kaymayı önlemek için her bir kancanın kıvrımlarındaki dikiş halkalarını sıkın. Kancalar arasındaki sıfır ayrımı bulmak için bu bükümleri referans noktaları olarak kullanın. Medikal makas kullanarak dikişlerin fazla uzunluklarını kesin.

Hidrojeli deney çözeltisine daldırmak için Z ekseni boyunca Z manipülatörleri kullanarak bağlı hidrojeli deney odasına doğru hareket ettirin. Hidrojel numunesini, jel herhangi bir stres altında olmayacak şekilde manipülatörleri kullanarak YZ'de hizalayın. Kuvvet sensörünü sıfırlayın ve jel kuvvet yaşamaya başlayana kadar X mikrometre aşamalarını kullanarak iki kancayı ayırın.

Bu olduğunda, mikrometre vidasını X yönünde hafifçe geri çevirin. Ses bobini motoru ve sensör için her iki manipülatörün konumunu kaydedin. Ardından, deneyin başlangıcında bağlama kancaları arasındaki tam ayrımı hesaplamak için bu değerler ile daha önce ölçülen değerler arasındaki farkı kullanın.

İstenilen yükleme hızında kuvveti artırarak bir kuvvet-rampa döngüsü gerçekleştirmek için, başlangıç ve son kuvvet değerlerinin yanı sıra, ters çevrilmiş bir V olarak görünen protokolün süresini ve ardından protein alanlarının bir sonraki döngüden önce yeniden yemesine izin vermek için yaklaşık 200 saniye boyunca sabit bir düşük kuvvet girin. 30 saniye boyunca düşük bir kuvvet uygulayarak sabit kuvvet protokolü uygulayın. Ardından, kuvveti belirli bir süre için sabit bir kuvvete yükseltin, ardından protein alanlarının yeniden canlanmasına ve jel elastikiyetinin geri kazanılmasına izin vermek için kuvveti 300 saniyeden daha uzun bir süre boyunca aynı düşük değere geri verin.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirin. Her ölçüm bir gevşeklik eğrisi ile başlar. İki çizgi takılarak sensör üzerindeki sıfır kuvvet ve gerçek jel uzunluğu belirlenir.

Gerçek jel uzunluğu, uyumların kesişiminden ve mikrometre vidalarının konumundan hesaplanır. Kuvvet kelepçesi reometri sistemi iki farklı türde protokol uygulayabilir. Kuvvet rampası modunda, hidrojel numunesi, ters çevrilmiş V.In sabit kuvvet moduna benzeyen zamanla bir kuvvet değiştirme protokolü yaşar, uygulanan stres adım benzeri bir modelde değişir.

Ölçümler sırasında PID sistemi, kuvvet protokolünden önceden tanımlanmış ayar noktasını takip etmek için bobin konumunu değiştirerek hidrojel uzantısını ayarlar. Gerinim daha sonra ölçülen uzantının gerçek jel uzunluğuna bölünmesiyle hesaplanır. Gerilim, uygulanan kuvvetin hidrojel numunesinin kesit alanına bölünmesiyle belirlenir.

Kuvvet Rampası izleri en iyi şekilde gerilime karşı gerinim olarak temsil edilir. Young modülü, yükleme aşaması sırasında eğim ölçüsünden hesaplanabilir. Histerezis, proteinin açılması ve yeniden katlanmasından kaynaklanan enerji dağılımını verir.

Sabit kuvvet izleri en iyi zamanın bir fonksiyonu olarak temsil edilir. Gerinimdeki değişiklik, bir çift üstel takarak açılma ve yeniden katlanma oranlarını ölçmek için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, proteini eklemeden önce tüpteki herhangi bir silanı kurutmayı, kabarcıkları çıkarmak için protein karışımını santrifüjlemeyi, protein karışımını tüpün içine enjekte ettikten sonra kabarcıkları kontrol etmeyi ve tüpten ekstrüzyondan sonra mekanik olarak hasar görmüş hidrojelleri atmayı unutmamak önemlidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, hidrojel örneğine zarar vermeden cerrahi dikişleri kullanarak jelleri kancalara tutturmakta ilk başta zorlanacaklardır. Jelenin tüpten çıkarılması hidrojele de zarar verebilir. Bu yöntem, düşük hacimli hidrojel numuneleri üzerinde sabit kuvvet protokollerinin uygulanmasını sağlar.

Bu deneyler, elastik ve viskoelastik davranışların ayrılmasına ve protein açılma ve katlanma mekaniğinin toplu bir yaklaşımla incelenmesine izin verir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, malzeme bilimleri alanındaki araştırmacıların, doku mühendisliği iskeleleri, ilaç dağıtım sistemleri ve 3 boyutlu baskı için biyolojik mürekkep olarak hizmet etmek için mükemmel bir potansiyele sahip mühendislik poliprotein bazlı hidrojeller gibi yeni yumuşak biyomalzemeleri keşfetmelerine olanak tanır. Bu yöntem sadece protein bazlı hidrojellerin mekaniği hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kas liflerinin izometrik tepkisini veya cilt gibi dokuların elastikiyetini ölçmek gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.