Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Bu yöntem, kristalografi ve kriyo-EM ile protein yapısının belirlenmesi gibi salgılanan proteinlerin biyokimyası ve yapısal biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protein yapısının belirlenmesi için nispeten düşük maliyetle büyük miktarda rekombinant salgılanan protein üretmesidir. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi bir çoklu klonlama bölgesinde ilgilenilen sekresyon sinyali dizisi olan beş asal BglII kesme bölgesi içeren bir DNA parçasını sentezleyin.

Daha sonra, DNA'nın dört mikrogramını BglII ve X1 ile ve dört mikrogramını BamH1 ve X1 ile bir ekspresyon vektör DNA'sını sindirin. Her bir kısıtlama enziminin 10 birimini 1X konsantrasyon reaksiyon tamponunda DNA ile karıştırın. Dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Yeni bir 1.5 mililitrelik Eppendorf tüpüne 1X T4 DNA Ligaz reaksiyon tamponu ve beş birim T4 DNA Ligaz içeren 10 mikrolitre bir ligasyon reaksiyonu karışımı ekleyin.

Ardından, 100 nanogram doğrusallaştırılmış vektör DNA ve 400 nanogram sindirilmiş DNA parçası ekleyin. 16 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Ligasyon karışımının beş mikrolitresini 100 mikrolitre DH5 alfa yetkin hücrelere dönüştürün ve elde edilen kolonileri metin protokolünde belirtildiği gibi bir Ampisilin LB agar plakası üzerinde seçin.

Beş ila 10 koloni arasında seçim yapın, her birini mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren iki mililitre LB ortamına aktarın. Bu kolonileri 16 saat boyunca 37 santigrat derecede 220 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde büyütün. Bundan sonra, her bir plazmit DNA'sını çıkarmak için bir DNA Miniprep kiti kullanın.

Klonları, metin protokolünde belirtildiği gibi bir ileri dizileme astarı ile DNA dizilimi ile onaylayın. 100 nanogram yapı plazmidi kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi 40 mikrolitre DH10Bac yetkin hücresini dönüştürün. Dönüşüm plakalarını 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin.

Her dönüşüm plakasından iki beyaz koloni alın ve her koloniyi kanamisin, gentamisin ve tetrasiklin içeren iki mililitre LB ortamına aşılayın. Bacmid DNA'sını metin protokolünde belirtildiği gibi çıkarın ve doğrulayın. Her DNA'yı iki tüpe ayırın ve her tüpe 20 mikrolitre aktarılın.

Daha sonra tüpleri devam etmeye hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Sonraki tüm adımlar aseptik olarak gerçekleştirilmelidir. Altı oyuklu bir plakada,% 10 fetal sığır serumu ve% 10 santigrat derece ila% 80 birleşmede mililitre Penisilin-Streptomisin antibiyotikleri başına 100 mikrogram ile kültür ortamında tek katmanlı bir Sf9 hücresi büyütün.

Her transfeksiyon için, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne antibiyotiksiz 100 mikrolitre takviye edilmemiş Sf9 hücre kültürü ortamı ekleyin. Her tüpe 20 mikrolitre bacmid DNA'yı seyreltin ve karıştırmak için hafifçe vurun. Daha sonra, her transfeksiyon için 1.5 mililitrelik bir tüpe antibiyotiksiz 100 mikrolitre takviye edilmemiş Sf9 hücre kültürü ortamı ekleyin.

Her tüpe sekiz mikrolitre lipid transfeksiyon reaktifini seyreltin ve altı kez yukarı ve aşağı iyice pipetleyerek karıştırın. Bu iki çözeltiyi birleştirin ve üç kez yavaşça yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın. Oda sıcaklığında 20 ila 40 dakika inkübe edin.

Kültür plakasının her bir kuyusunu, her yıkama için antibiyotiksiz üç mililitre takviyesiz Sf9 kültür ortamı kullanarak iki kez yıkayın. Daha sonra, lipid DNA karışımını içeren her tüpe antibiyotiksiz 0.8 mililitre takviye edilmemiş Sf9 hücre kültürü ortamı ekleyin. Karıştırmak için üç kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.

Yıkama ortamını plakalardan aspire edin ve numuneleri transfeksiyon karışımı ile kaplayın. Kopyalanan plakayı 27 santigrat derecede beş saat inkübe edin. Bundan sonra, transfeksiyon ortamını% 10 FBS ve mililitre başına 100 mikrogram Penisilin-Streptomisin antibiyotik içeren tam Sf9 hücre kültürü ortamı ile değiştirin.

Dört gün boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, süpernatanı steril 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hücre kalıntılarını temizlemek için beş dakika boyunca 1.010 kez g'de döndürün.

Peleti atın ve süpernatanı temiz bir tüpe boşaltın. Dört santigrat derecede bir yıla kadar veya kullanıma hazır olana kadar saklayın. Her bir rekombinant virüsü çoğaltmak için, önce 150 milimetrelik bir plaka üzerinde %80 birleşmeye kadar tek katmanlı bir Sf9 hücresi büyütün.

Daha sonra ortamı aspire edin ve her oyuğa iki mililitre P0 virüsü ekleyin. 27 derecelik bir inkübatörde bir saat inkübe edin, ortamı hücrelerle karıştırmak için her 15 dakikada bir plakayı sallayın. Daha sonra,% 10 FBS içeren 25 mililitre tam Grace's Media ve mililitre başına 100 mikrogram Penisilin-Streptomisin antibiyotik ekleyin.

P1 geçiş virüsünü elde etmek için plakayı 27 santigrat derece inkübatörde üç gün boyunca inkübe edin. Bundan sonra, süpernatanı steril 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hücre kalıntılarını temizlemek için beş dakika boyunca 1.010 kez g'de döndürün.

Süpernatanı temiz bir tüpe boşaltın ve bir yıla kadar veya kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. Virüsü P1'den P2 geçişine yükseltmek için, önce 150 milimetrelik bir plaka üzerinde% 90 birleşmeye kadar tek katmanlı bir Sf9 hücresi büyütün. İstenilen birleşim noktasına ulaşıldığında, ortamı aspire edin.

İki mililitre P1 virüsü ekleyin ve 27 derecelik bir inkübatörde bir saat inkübe edin. Virüsün P2 ve P3 pasajlarını elde etmek için amplifikasyon adımlarını tekrarlayın. Bu çalışmada, hedef genin içsel sinyal dizisini değiştirerek salgılanan proteinleri gp67 veya hemolin sinyal dizisi ile eksprese etmek için iki modifiye pFastBac1 bakulovirüs ekspresyon vektörü kullanılmıştır.

PBEC gp67, a-thal-leano reseptörü TDR'nin hücre dışı alanlarını eksprese etmek için başarıyla kullanılmaktadır. PBEC1 hemolini, hücre dışı alanı PRK3'ü eksprese etmek için başarıyla kullanılırken. Daha sonra, saflaştırılmış proteinler mililitre başına beş miligrama konsantre edilir ve kristalizasyon taramasına tabi tutulur.

Her protein için ön kristalleri veren koşullar, 20 mikrometreden daha büyük protein kristalleri gözlenene kadar optimize edilir. Bu prosedürü denerken, proteinlerin kalitesini boyut dışlama kromatografisi, çok açılı ışık saçılımı ve rekombinant proteinin agregasyon olmama durumu için diğer tahlillerle incelediklerini hatırlamak önemlidir. Unutmayın, proteinin saflığını gümüş leke ile de kontrol edin.

Bu prosedürü takiben, üretilen proteinin üç boyutlu yapıları gibi ek soruları yanıtlamak için X-ışını kristalografisi ve kriyo-EM gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, yapısal biyoloji alanındaki araştırmacıların, bitkilerden ve memelilerden salgılanan proteinlerin yapısal, işlevsel ve biyokimyasal özelliklerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Agaroz jeli üzerindeki DNA bantlarını görselleştirmek için ultraviyole ışıkla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken UV korumaları, yüz siperi, göz gözlüğü, laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

Ayrıca tampon yaparken, güçlü asitleri ve bazları tutarken dikkatli olun.