Name: Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin bitki salgı proteinlerinin böcek hücrelerinde Baculovirus vektörleriyle düşük maliyetli ifadesi ve kristalizasyon için yapısal biyoloji yöntemlerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Guozhou Xu için Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi yeni öğretim başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir.

Not: Bir böcek cep/baculovirus sistemi ile değiştirilmiş ifade vektörel çizimler salgı bitki protein ifade ve kristalizasyon için kullanılır.
1. bir Baculovirus ifade vektör GP67 sinyal peptid bitki Protein salgılanması ifade ile modifikasyonu
<ol><li>Bir 5' BglII kesme makinası13, GP67 salgılanması sinyal sıra ve NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI ve XhoI (Şekil 1A) ile bir çok klonlama site içeren bir DNA parçası sentez. Not: BglII ve BamHI sindirilmiş beri DNA aynı yapışkanlı sona sonuçlandı, tavlanmış ligasyonu sırayla BglII ve BamHI siteleri tarafından yarilabilir değil bir sıra mutasyona iken Doğrusallaştırılmış vektör sindirilir DNA parçası ligate ya BglII ya da BamHI14.</li>
	<li>BglII ve XhoI ile DNA'ın Özeti 4 µg ve14BamHI ve XhoI ile bir ifade vektör DNA 4 µg. 1 x konsantrasyon tepki arabellek (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat ve 100 µg/mL BSA, pH 7,9 25 ° c) DNA'daki ile her Restriksiyon enzimi ile 10 birim mix ve 4 h için 37 ° C'de karışımı kuluçkaya.<ol>
<li>Eksize DNA parçası ve bir DNA jel ekstraksiyon kiti15tarafından Doğrusallaştırılmış vektör DNA arındırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yöneyin Doğrusallaştırılmış DNA 400 ile mix 100 ng ng sindirilir DNA parçası 1 x T4 DNA ligaz tepki arabellek (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP ve 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° c) ve 5 adet T4 DNA içeren bir 10 µL ligasyonu tepki karışımı ligaz. 16 ° C 16 h için tepki karisimin kuluçkaya.</li>
	<li>5 µL ligasyonu karışımı DH5α yetkili hücre bir standart dönüştürme protokol sonrası 100 µL dönüştürmek ve bir ampisilin-LB agar plaka16üzerinde elde edilen kolonileri seçin. 5-10 kolonileri kadar almak ve her koloni 220 devir/dakika ve 37 ° C 16 h için titreyen bir kuluçka 100 µg/mL ampisilin içeren LB Orta 2 ml büyür.</li>
	<li>Her plazmid DNA ile DNA miniprep kit17 ayıklamak ve klonlar tarafından DNA sıralama bir astar AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG ile onaylayın.</li>
	<li>PCR yükseltmek A. thaliana TDR gen parçası kodlama artıkları sentetik bir TDR gen üzerinden 30-642 oluşturmak (ileri astar: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, geriye doğru astar: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). 0,5 mM dNTP mix, 0.2 µM astar, şablonun DNA 0.1 µg, 0.4 mM MgCl2ve 1 tepki adet DNA polimeraz içeren DNA polimeraz tepki arabellekte 30 döngüleri için DNA yükseltmek.<ol>
<li>30 95 ° C'de ilk denatürasyon PCR döngüsü adımlar için küme s ve sonra 30 döngüleri denatürasyon 95 ° C'de 30 s, 30 s ve uzantısına sahip bir son 5 min için 72 ° C'de 72 ° c için 1 dakika, uzantısı için 55 ° C'de tavlama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR parçası ve yazmamalı ve BamHI kısıtlama endonükleaz enzimleri ile değiştirilmiş vektör sindirmek. Gen parça Doğrusallaştırılmış vektör ile ligate. Yöneyin Doğrusallaştırılmış DNA 400 ile mix 100 ng ng sindirilir DNA parçası T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu ve 5 adet T4 DNA ligaz içeren bir 10 µL ligasyonu tepki karışımı. 16 ° C 16 h için tepki karisimin kuluçkaya.</li>
	<li>5 µL ligasyonu karışımı DH5α yetkili hücre bir standart dönüştürme protokol sonrası 100 µL dönüştürmek ve bir ampisilin-LB agar plaka16üzerinde elde edilen kolonileri seçin. Doğru klon DNA sıralama tarafından onaylayın.</li>
</ol>2. bir Baculovirus ifade vektör böcek Hemolin sinyal peptid bitki Protein salgılanması ifade ile modifikasyonu
<ol><li>Bir 5' BglII kesme makinası13, böcek hemolin salgılanması sinyal sıra ve NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI ve XhoI (Şekil 1B) ile bir çok klonlama site içeren bir DNA parçası sentez.</li>
	<li>BglII ve XhoI ile DNA'ın Özeti 4 µg ve14BamHI ve XhoI ile bir ifade vektör DNA 4 µg. 1 x konsantrasyon tepki arabellek (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat ve 100 µg/mL BSA, pH 7,9 25 ° c) DNA'daki ile her Restriksiyon enzimi ile 10 birim mix ve 4 h için 37 ° C'de karışımı kuluçkaya.<ol>
<li>Eksize DNA parçası ve bir DNA jel ekstraksiyon kiti15tarafından Doğrusallaştırılmış vektör DNA arındırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yöneyin Doğrusallaştırılmış DNA 400 ile mix 100 ng ng sindirilir DNA parçası 1 x T4 DNA ligaz tepki arabellek (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP ve 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° c) ve 5 adet T4 DNA içeren bir 10 µL ligasyonu tepki karışımı ligaz. 16 ° C 16 h için tepki karisimin kuluçkaya.</li>
	<li>5 µL ligasyonu karışımı DH5α yetkili hücre 100 µL dönüştürmek ve koloniler ampisilin-LB agar plaka üzerinde seçin. 5-10 kolonileri kadar almak ve 2 mL LB ortamda 100 µg/mL 220 devir/dakika ve 37 ° C 16 h için titreyen bir kuluçka ampisilin içeren her koloni büyür.</li>
	<li>Plazmid DNA ile DNA miniprep kit17 ayıklamak ve klonlar tarafından DNA sıralama bir astar AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG ile onaylayın.</li>
	<li>A. thaliana polen reseptör kinaz 3 (PRK3) gen parça PCR yükseltmek artıkları 20-237 sentetik bir PRK3 gen yapısı üzerinden kodlama (ileri astar: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, geriye doğru astar: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). 0,5 mM dNTP mix, 0.2 µM astar, şablonun DNA 0.1 µg, 0.4 mM MgCl2ve 1 tepki adet DNA polimeraz içeren DNA polimeraz tepki arabellekte 30 döngüleri için DNA yükseltmek.<ol>
<li>30 95 ° C'de ilk denatürasyon PCR döngüsü adımlar için küme s ve sonra 30 döngüleri denatürasyon 95 ° C'de 30 s, 30 s ve uzantısı için 30 72 ° C'de 55 ° C'de tavlama her döngüsü ve 5 min için 72 ° C'de son uzantısı içinde s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR parçası ve yazmamalı ve BamHI kısıtlama endonükleaz enzimleri ile değiştirilmiş vektör sindirmek. Gen parça Doğrusallaştırılmış vektör ile ligate. Yöneyin Doğrusallaştırılmış DNA 400 ile mix 100 ng ng sindirilir DNA parçası T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu ve 5 adet T4 DNA ligaz içeren bir 10 µL ligasyonu tepki karışımı. 16 ° C 16 h için tepki karisimin kuluçkaya.</li>
	<li>5 µL ligasyonu karışımı DH5α yetkili hücre bir standart dönüştürme protokol sonrası 100 µL dönüştürmek ve bir ampisilin-LB agar plaka16üzerinde elde edilen kolonileri seçin. Doğru klon DNA sıralama tarafından onaylayın.</li>
</ol>3. üretim ve Baculovirus amplifikasyon oluşturur rekombinant Protein ifade kaset yataklık
<ol><li>DH10Bac yetkili hücre baculovirus ifade sistem1protokol sonrası 40 µL dönüştürmek için yapı plazmid kullanım 100 ng. 48 h 37 ° C'de dönüştürme plakaları kuluçkaya.</li>
	<li>İki beyaz kolonileri her dönüştürme plaka almak, her koloni 2 mL 50 µg/mL sefaloridin, 7 µg/mL gentamisin ve 10 µg/mL tetrasiklin içeren LB orta aşılamak. Ayıklamak ve DNA bacmid doğrulamak için baculovirus ifade sistem1 Protokolü izleyin. Aliquot her DNA 20 µL her, ile iki tüpler ve borular-20 ° C'de depolayın Not: Aşağıdaki adımları aseptik ameliyat gerektirir.</li>
	<li>Bir monolayer Kültür medya % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 100 µg/mL (veya 100 I.U./mL) ile penisilin-streptomisin antibiyotik 27 ° C'de Sf9 hücrelerinin % 80 izdiham bir 6-şey plaka için büyür. Doku kültürü plaka üzerinde kapalı alan yüzdesini temel izdiham yüzdesini tahmin ediyoruz.</li>
	<li>İki steril 1.5 mL santrifüj tüpleri aşağıdaki çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Tüp 1: her transfection için bacmid DNA unsupplemented Sf9 hücre kültür orta antibiyotikler olmadan 100 µL içine 20 µL oranında seyreltin. Seyreltme karışımı yavaşça tüp tarafında flicking tarafından.</li>
		<li>Tüp 2: her transfection için unsupplemented Sf9 hücre kültür orta antibiyotikler olmadan 100 µL içine lipid transfection reaktif 8 µL oranında seyreltin. Seyreltme yukarı ve aşağı 6 x için pipetting tarafından iyice karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki çözüm birleştirmek, onları karışımı yavaşça yavaşça yukarı ve aşağı 3 x için pipetting tarafından ve onları 20-40 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Sf9 monolayer her şey hücreleri 2 x 3 mL unsupplemented Sf9 hücre kültür orta olmadan antibiyotik ile yıkayın. Her transfection için unsupplemented Sf9 hücre kültür orta antibiyotikler olmadan 0.8 mL lipid-DNA karışımı içeren her tüpün ekleyin. Tüpler içeriğini karışımı yavaşça yavaşça yukarı ve aşağı 3 x için pipetting tarafından. Tabak yıkama medyadan Aspire edin ve transfection karışımı ile örnekleri yerleşimi.</li>
	<li>Transfection karışımı eklenmesinden sonra 27 ° C'de 5 h transfected plaka kuluçkaya Tam Sf9 hücre kültür veya % 10 FBS ve 100 µg/mL (100 I.U./mL) içeren orta ile transfection ortamı değiştirin penisilin-streptomisin antibiyotik. 4 d için 27 ° C'de transfected plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Hasat ve rekombinant baculovirus yükseltmek.<ol>
<li>Süpernatant steril 15 mL konik tüp içinde virüslü plaka, kuluçka sonra 4 d toplayın. Süpernatant vasıl 1010 x g hücre artıkları kaldırmak 5 min için spin. Pelet atmak ve süpernatant temiz bir tüp için dikkatle boşaltmak ve 4 ° C ilâ 1 yıl için saklayın. Not: Bu P0 virüs olduğunu. Bu uzun bir süre için bölünmemeli ve-80 ° C'de depolanmış olabilir.</li>
		<li>Rekombinant her virüs yükseltmek için % 80 izdiham monolayer 150 mm tabakta Sf9 hücrelerin büyümek. Plaka medyadan Aspire edin, 2 mL P0 virüs hücreleri yapışık plaka ekleyin ve 1 h 27 ° C kuluçka plaka kuluçkaya. Orta hücre ile karıştırmak için plaka her 15dk rock.<ol>
<li>25 mL % 10 FBS ve 100 µg/mL (veya 100 I.U./mL) içeren tam Grace'in medya ekleyin penisilin-streptomisin antibiyotik. P1 geçit virüs almak için 27 ° C kuluçka 3 d plaka kuluçkaya.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Steril 50 mL konik tüp ve 1010 x g hücre artıkları kaldırmak 5 min için spin virüslü plaka süpernatant toplamak. Süpernatant temiz bir tüp için dikkatle boşaltmak ve 4 ° C ilâ 1 yıl için saklayın. Not: P1 virüs bölünmemeli ve saklı-80 ° C'de daha uzun bir süre için olabilir.</li>
		<li>Virüs--dan P1 P2 geçiş için yükseltmek için bir monolayer 150 mm tabakta Sf9 hücrelerinin % 90 izdiham için büyümek, medya plaka Aspire edin, P1 virüs 2 mL plaka ekleyin ve 1 h 27 ° C kuluçka için kuluçkaya.</li>
		<li>3.8.2 ve 3.8.3 virüslerin P2 ve P3 pasajlar edinmek için adımları yineleyin. P3 virüs 2 aydan fazla tutmayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. protein ifade, NiNTA ve kristalizasyon ile arıtma
<ol><li>2 x 106 100 devirde bir 27 ° C kuluçka Shaker yoğunluğu kültür medya 100 µg/mL (veya 100 I.U./mL) ile penisilin-streptomisin antibiyotiklere Hi5 böcek hücrelerinin 1 L kültür. Spin aşağı hücreleri 570 x g 5 min için de, süpernatant dikkatle boşaltmak, 20 mL taze üretilen P3 şunun hücrelerde resuspend ve 1 h. yavaşça sarsmak için her 15 dk x 1 hücreleri resuspend için spin şişe oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Hücreleri 1 litre 100 µg/mL (veya 100 I.U./mL) ile Kültür medya penisilin-streptomisin antibiyotikler, transfer 100 devirde bir 27 ° C kuluçka Shaker 72 h. Spin 1.010 x g 5 min için de hücreleri aşağı için hücre kültür ve süpernatant toplamak.</li>
	<li>Kullanım pH göstergesi süpernatant 8,0 pH 0,1 M HCl veya 0.1 M NaOH ekleyerek ayarlayın ve 20 mM Tris tampon pH 8.0, 100 mM NaCl ve 5 mM imidazole içeren bir son konsantrasyonu, bağlama arabellek eklemek için şeritler. Üzerinde ifade O'nun öğesini Rekombinant protein verim tahmini göre belirli bir miktar NiNTA reçine (10-40 mL) ekleyin.<ol>
<li>Çözüm manyetik heyecan üzerinde 1 h. Yıkama için 4 ° C'de düşük hız ile reçine mix ve standart NiNTA arıtma Protokolü18takip ilişkili protein elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saf protein iyon değiştirme için konu ve filtrasyon Kromatografi yanı sıra homojen bir örnek vermeye diğer protein saflaştırma yöntemleri jel. Not: TDR ectodomain için 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl kullanılan jel filtrasyon arabellek. PRK3 ectodomain için 20 mM BIS-Tris, pH 6, 100 mM NaCl tercih edilen jel filtrasyon arabellek kullanılmıştır.</li>
</ol>

<ol><li>Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).</li>
<li>Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+3a+protein+and+the+assembly+of+coronavirus-like+particles+in+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system.</a> Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).</li>
<li>Possee, R. D., King, L. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17951765">Baculovirus Transfer Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).</li>
<li>Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+two+cell+lines+from+the+insect+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3B+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae).</a> In Vitro. 13, 213-217 (1977).</li>
<li>Hink, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+insect+cell+line+from+the+cabbage+looper%2C+Trichoplusia+ni%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni.</a> Nature. 226, 466-467 (1970).</li>
<li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cellular & Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).</li>
<li>Wickham, T. J., Nemerow, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+growth+methods+and+recombinant+protein+production+in+BTI-Tn-5B1-4+insect+cells+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system.</a> Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).</li>
<li>Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+of+alkaline+phosphatase+as+a+reporter+gene+for+evaluation+of+production%2C+glycosylation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion.</a> Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).</li>
<li>Murphy, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression%2C+secretion%2C+and+large-scale+purification+of+recombinant+HIV-1+gp120+in+insect+cell+using+the+baculovirus+egt+and+p67+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides.</a> Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).</li>
<li>Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolin%3A+an+insect-immune+protein+belonging+to+the+immunoglobulin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily.</a> Science. 250, 1729-1732 (1990).</li>
<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+CLE+peptide+perception+by+plant+receptors+implicated+from+structural+and+functional+analyses+of+TDIF-TDR+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions.</a> PLoS One. 12, e0175317(2017).</li>
<li>Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Domain+of+Pollen+Receptor+Kinase+3+is+structurally+similar+to+the+SERK+family+of+co-receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors.</a> Scientific Reports. 8, 2796(2018).</li>
<li>Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a gene.</a> Science. 203, 614-625 (1979).</li>
<li>Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+inserting+specific+DNA+sequences+into+cloning+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles.</a> Gene. 1, 81-92 (1976).</li>
<li>Xu, W., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Vaccine-Derived+Polioviruses%2C+Relevance+for+the+Global+Polio+Eradication+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative.</a> Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Reddy, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+alpha+subunit+of+the+epithelial+sodium+channel%2C+ENaC%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC.</a> Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).</li>
<li>Harris, T. J., Emtage, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+heterologous+genes+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression of heterologous genes in E. coli.</a> Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).</li>
<li>Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+heterologous+protein+expression+in+E.+coli%3A+Roadblocks+and+reinforcements%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+BIological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements.</a> International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).</li>
<li>Guo, Y., Yang, F., Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Protein+Secretion+in+Yeast+and+Animal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).</li>
<li>Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+pathway+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein secretion pathway in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).</li>
<li>Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+protein+secretion+in+yeast%3A+strategies+and+impact+on+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).</li>
<li>Wormald, M. R., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins%3A+glycan+presentation+and+protein-fold+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability.</a> Structure. 7, R155-R160 (1999).</li>
<li>Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+and+History+of+Glyco-Engineering+in+Insect+Expression+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems.</a> Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).</li>
<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+studies+of+the+extracellular+domain+of+the+first+plant+ATP+receptor%2C+DORN1%2C+and+the+orthologous+protein+from+Camelina+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+BIology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).</li>
<li>Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+of+hydrophobin-assisted+recombinant+protein+production+in+tobacco+BY-2+suspension+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells.</a> Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).</li>
<li>Dohi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+virus-mediated+expression+of+a+foreign+protein+in+suspension-cultured+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells.</a> Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Çeşitlilik içinde büyüklük ve istikrar proteinlerin biyolojik sistemlerde mevcut binlerce göz önüne alındığında, bu kez bir araştırma için ampirik laboratuvar hangi Contegra ifade sistem karar vardır belirli bir protein ifade için seçilecek. E. coli ifade sistem kez up19ölçeklemek için ilk kısa yaşam döngüsü nedeniyle protein ifade bakterilerin düşük maliyetli Kültür Medya ve göreceli kolaylığı için seçimdir. Ancak, E. coli kullanarak 60 kDa fazla boyutları ile büyük ökaryotik pr...

X-ışını crystallographic çalışmalar için özellikle Biyokimya ve biyofizik karakterizasyonu için homojen rekombinant proteinlerin büyük miktarlarda üretme yeteneğine sahip olması bir araştırma laboratuvarı için zorunludur. Escherichia coli, mantar, böcek hücreleri, memeli hücreleri, bitki hücreleri, vb aralarında gibi birçok tanınmış Contegra ifade sistemleri vardır, böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem en çoğunlukla teknikleri yapısal olarak katlanmış büyük ölçekli rekombinant ökaryotik proteinler protein kristalizasyon1için büyük miktarlarda üretmek için kullanılır.
İfade vektörel çizimler baculovirus ifade sisteminin güçlü polyhedrin veya yüksek bir verim rekombinant proteinler hücre içi2,3üretmek için P10 organizatörü içerecek şekilde tasarlanmıştır. Rekombinant baculovirus yapmak için faiz gen Autographa californica multi-nucleopolyhedroviral genom polyhedrin (polh) odağı içeren bir böcek vektörü klonlanmış. Elde edilen yapı sonra sıralı ve onun doğru açık okuma çerçevesi (ORF) doğrulanır. Doğru yapı sonra transfection sürecinde ana bilgisayar böcek hücresine tanıttı. Gen ilgi viral Genom tarafından Homolog rekombinasyon eklenir. Bu olay rekombinant üretmek için hangi sonra çoğaltır virüs parçacıkları1budded rekombinant viral genom üretiminde sonuçlanır.
İfade sisteminde en sık kullanılan böcek hücreleri Sf9 ve yüksek beş (Hi5) hücrelerdir. Spodoptera frugiperda, pupa yumurtalık hücrelerinden elde edilen Sf21, klonal bir izole Sf9 hücrelerdir ve ebeveyn Trichoplusia ni yumurtalık hücre satırı TN-3684,5dan türetilmiş bir klonal izole Hi5 hücrelerdir. Hi5 hücreleri genellikle rekombinant proteinler6daha yüksek miktarlarda üretmek için seçili iken eş transfections, virüs amplifikasyon ve plak deneyleri Sf9 hücreleri üzerinde yapılmaktadır. Hi5 hücreleri mutasyona uğramış virüs üretmek için onların eğilimi nedeniyle üretimi ve virüs ettiklerinizden amplifikasyon için uygun değildir fazlalaştı. Geleneksel olarak, 25-30 ° C sıcaklık aralığı böcek hücreleri ekimi için iyi olarak kabul edilir. Ancak, 27-28 ° C en uygun sıcaklık böcek hücre büyüme ve enfeksiyon7,için8olduğu bildirilmiştir.
Giriş Gen önceki bir güçlü sinyal sırasında salgılanan proteinler yüksek ifade için gereklidir. Sinyal sıra verimli bir şekilde çevrilmiş Rekombinant protein endoplazmik retikulum protein salgılanması ve translasyonel modifikasyonlar uygun katlama ve sabitleme3için gerekli için deliklere. Protein GP64/67, bal arısı melittin ve diğerleri, baculovirus örtmek gibi sinyal peptid dizileri, baculovirus-aracılı ifade sistemleri3salgı rekombinant proteinlerin ifadesi kolaylaştırmak için seçildi. GP67 sinyal peptid getirilmesi ile karşılaştırıldığında içsel sinyal peptid hedef gen9kullanarak salgılanan bir Rekombinant protein, ifade verimini artırmak için gösterilmiştir. Hemolin bir bakteri enfeksiyonu10indüklenen dev ipek güve Hyalophora cecropia, hemolymph proteindir. İndüklenen ifade nispeten yüksek seviyede nedeniyle, gen sinyal peptid dizisi rekombinant proteinlerin salgılanmasını ifade baculovirus-böcek hücre sisteminde arabuluculuk için kullanılabilir.
A. thaliana Tracheary öğesi farklılaşma inhibitör faktör reseptör (TDR) ve polen reseptör kinaz her ikisi de proteinler11,12 bitki lösin yönünden zengin tekrar reseptör benzeri kinaz (LRR-RLK) ailesine ait 3 (PRK3) . Yapısı ve fonksiyonu, bu ailenin diğer bitki salgılanan proteinler yapısal ve biyokimyasal karakterizasyonu kolaylaştırmak için bitki reseptör protein, de eğitim için baculovirus-böcek hücre ifade sistem için değiştirildi protein verim kalitesi ve üretim geliştirmek. Ekstrasellüler etki alanları TDR ve PRK3 başarıyla baculovirus-böcek hücre ifade sisteminde iki değiştirilmiş ifade vektörel çizimler kullanarak ifade edilmiştir. Her iki ekstrasellüler etki alanı TDR ve PRK3 proteinlerin kristalize. Ya bir GP67 ya da hemolin sinyal dizisi düzenleyici ve birden çok klonlama arasında dahil ederek ifade ve arıtma rekombinant salgılanan bitki proteinleri iki değiştirilmiş baculovirus ifade vektörel çizimler ile büyük miktarda Bu makale raporları siteleri.

<table><tbody><tr><td>Kuluçka makinesi çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>Model Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>VWR</td><td>Model 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>BECKMAN</td><td>Model J-6</td>, <td>salıncak kova rotorlu</td></tr><tr><td>Herculase II Füzyon DNA Polimeraz</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td><td>DNA Termal Döngüleyicinin</td></tr> <tr><td></td><td>PCR amplifikasyonu içinBIO-RAD</td><td>Model C1000 Touch</td> DNA İnkübatörü <td>çalkalayıcının PCR amplifikasyonu için</td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model I 24</td><td>Baceria kültürü yetiştirmek için</td></tr><tr><td>Müşteri DNA sentezi</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>Kısıtlama Endonükleaz</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>Kısıtlama Endonükleaz</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Kısıtlama Endonükleaz</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Kısıtlama Endonükleaz</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>DNA ligasyonu</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Agorase jelden DNA saflaştırması</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Bakteri kültüründen plazmid DNA saflaştırması</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>DNA jel elektroferozu için</td></tr><tr><td>MAX Verimlilik DH5 ve alfa; yetkin hücre</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>DNA ligasyon karışımının dönüşümü için</td></tr><tr><td>Lennox L LB Et Suyu</td><td>Araştırma Ürünü International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>Bakteri kültürü yapmak için</td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Kanamisin Sülfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Maksimum Verimlilik DH10Bac yetkin hücreler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>Bacmid DNA</td></tr><tr><td>S.O.C. yapmak için Orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>DNA dönüşümü için</td></tr><tr><td>CellFECTIN II Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>Böcek hücresi transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac İfade Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>Bakulovirüs-böcek hücreleri ekspresyon kiti</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>Rekominant Bacmid DNA</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>Rekominant Bacmid DNA'nın izolasyonu için</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>Baculorirus ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>Sf9 hücreleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 tek katmanlı hücreler</td></tr><tr><td>Hi5 hücreleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five böcek hücreleri</td></tr><tr><td>Grace' s böcek ortamı, takviyesiz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 hücre transfeksiyonu minimum ortam</td></tr><tr><td>Grace' s böcek ortamı, takviyeli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 tek katmanlı hücre kültürü tam ortamı</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td> FBS Express Five SFM Thermo Fisher Scientific 10486025 olmayan <td>Sf9 süspansiyon hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Hi5 hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10.000 IU/ml)</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>FBS Sertifikalı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Düz tabanlı</td></tr><tr><td>150 mm plakalar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/koli</td></tr><tr><td>1.5 ml Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1415-2500</td><td>500 tüp / torba</td></tr><tr><td>15 ml konik vidalı kapaklı santrifüj tüpleri</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1475-0511</td><td>25 tüp / torba</td></tr><tr><td>50 ml konik vidalı kapaklı santrifüj tüpleri</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1500-1211</td><td>25 tüp / torba</td></tr><tr><td>Ni-NTA Süper Akış</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>NiNTA reçine</td></tr><tr><td>pH gösterge şeritleri</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Rekombinant salgı ökaryotik proteinler yapısal ve biyokimyasal araştırmalar ifade etmek bilim adamları için bir mücadele vardı. Böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem rekombinant ökaryotik salgı proteinler bazı translasyonel modifikasyonlar ile ifade etmek için kullanılan sistemlerinden biridir. Salgı proteinler için protein glikozilasyon, disülfür bağları oluşumu ve diğer translasyonel modifikasyonlar salgı yollar aracılığıyla yönlendirilmesi gerekir. Varolan böcek hücre ifade salgı bitki proteinlerin artırmak için bir baculovirus ifade vektör ya bir GP67 eklenmesi ya da bir hemolin sinyal peptid sırası organizatörü ve çoklu klonlama siteleri arasında tarafından değiştirilir. Bu yeni tasarlanmış değiştirilmiş vektör sistemi başarıyla Arabidopsis thalianaçözünür rekombinant salgılanan bitki reseptör proteinler yüksek bir verim üretti. İki ifade bitki proteinleri, Arabidopsis TDR ve PRK3 plazma membran reseptörleri, ekstrasellüler etki x-ışını crystallographic çalışmalar için kristalize. Değiştirilmiş vektör sistemi salgı rekombinant proteinler de hayvan krallığının bir ifade için kullanılabilir gelişmiş bir araçtır.

Şekil 1' de gösterildiği gibi iki değiştirilmiş pFastBac1 baculovirus ifade vektörel çizimler salgılanan proteinler ile GP67 ya da hemolin sinyal sıra hedef gen içsel sinyal sırasını değiştirmek için ifade etmek için kullanılmıştır. Viral GP67 ve böcek hemolin genler hücrelerde yüksek salgı ifade düzeyleri olmasını gösterdi. Füzyon protein ile ikisinden biri bu iki sinyal sıralarının salgı ifade düzeyleri büyük ölçüde düzeldi bekleniyor. Aynı birden çok klonl...

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Bu yöntem, kristalografi ve kriyo-EM ile protein yapısının belirlenmesi gibi salgılanan proteinlerin biyokimyası ve yapısal biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protein yapısının belirlenmesi için nispeten düşük maliyetle büyük miktarda rekombinant salgılanan protein üretmesidir. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi bir çoklu klonlama bölgesinde ilgilenilen sekresyon sinyali dizisi olan beş asal BglII kesme bölgesi içeren bir DNA parçasını sentezleyin.Daha sonra, DNA'nın dört mikrogramını BglII ve X1 ile ve dört mikrogramını BamH1 ve X1 ile bir ekspresyon vektör DNA'sını sindirin. Her bir kısıtlama enziminin 10 birimini 1X konsantrasyon reaksiyon tamponunda DNA ile karıştırın. Dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Yeni bir 1.5 mililitrelik Eppendorf tüpüne 1X T4 DNA Ligaz reaksiyon tamponu ve beş birim T4 DNA Ligaz içeren 10 mikrolitre bir ligasyon reaksiyonu karışımı ekleyin.Ardından, 100 nanogram doğrusallaştırılmış vektör DNA ve 400 nanogram sindirilmiş DNA parçası ekleyin. 16 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Ligasyon karışımının beş mikrolitresini 100 mikrolitre DH5 alfa yetkin hücrelere dönüştürün ve elde edilen kolonileri metin protokolünde belirtildiği gibi bir Ampisilin LB agar plakası üzerinde seçin.Beş ila 10 koloni arasında seçim yapın, her birini mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren iki mililitre LB ortamına aktarın. Bu kolonileri 16 saat boyunca 37 santigrat derecede 220 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde büyütün. Bundan sonra, her bir plazmit DNA'sını çıkarmak için bir DNA Miniprep kiti kullanın.Klonları, metin protokolünde belirtildiği gibi bir ileri dizileme astarı ile DNA dizilimi ile onaylayın. 100 nanogram yapı plazmidi kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi 40 mikrolitre DH10Bac yetkin hücresini dönüştürün. Dönüşüm plakalarını 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin.Her dönüşüm plakasından iki beyaz koloni alın ve her koloniyi kanamisin, gentamisin ve tetrasiklin içeren iki mililitre LB ortamına aşılayın. Bacmid DNA'sını metin protokolünde belirtildiği gibi çıkarın ve doğrulayın. Her DNA'yı iki tüpe ayırın ve her tüpe 20 mikrolitre aktarılın.Daha sonra tüpleri devam etmeye hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Sonraki tüm adımlar aseptik olarak gerçekleştirilmelidir. Altı oyuklu bir plakada,% 10 fetal sığır serumu ve% 10 santigrat derece ila% 80 birleşmede mililitre Penisilin-Streptomisin antibiyotikleri başına 100 mikrogram ile kültür ortamında tek katmanlı bir Sf9 hücresi büyütün.Her transfeksiyon için, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne antibiyotiksiz 100 mikrolitre takviye edilmemiş Sf9 hücre kültürü ortamı ekleyin. Her tüpe 20 mikrolitre bacmid DNA'yı seyreltin ve karıştırmak için hafifçe vurun. Daha sonra, her transfeksiyon için 1.5 mililitrelik bir tüpe antibiyotiksiz 100 mikrolitre takviye edilmemiş Sf9 hücre kültürü ortamı ekleyin.Her tüpe sekiz mikrolitre lipid transfeksiyon reaktifini seyreltin ve altı kez yukarı ve aşağı iyice pipetleyerek karıştırın. Bu iki çözeltiyi birleştirin ve üç kez yavaşça yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın. Oda sıcaklığında 20 ila 40 dakika inkübe edin.Kültür plakasının her bir kuyusunu, her yıkama için antibiyotiksiz üç mililitre takviyesiz Sf9 kültür ortamı kullanarak iki kez yıkayın. Daha sonra, lipid DNA karışımını içeren her tüpe antibiyotiksiz 0.8 mililitre takviye edilmemiş Sf9 hücre kültürü ortamı ekleyin. Karıştırmak için üç kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.Yıkama ortamını plakalardan aspire edin ve numuneleri transfeksiyon karışımı ile kaplayın. Kopyalanan plakayı 27 santigrat derecede beş saat inkübe edin. Bundan sonra, transfeksiyon ortamını% 10 FBS ve mililitre başına 100 mikrogram Penisilin-Streptomisin antibiyotik içeren tam Sf9 hücre kültürü ortamı ile değiştirin.Dört gün boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, süpernatanı steril 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hücre kalıntılarını temizlemek için beş dakika boyunca 1.010 kez g'de döndürün.Peleti atın ve süpernatanı temiz bir tüpe boşaltın. Dört santigrat derecede bir yıla kadar veya kullanıma hazır olana kadar saklayın. Her bir rekombinant virüsü çoğaltmak için, önce 150 milimetrelik bir plaka üzerinde %80 birleşmeye kadar tek katmanlı bir Sf9 hücresi büyütün.Daha sonra ortamı aspire edin ve her oyuğa iki mililitre P0 virüsü ekleyin. 27 derecelik bir inkübatörde bir saat inkübe edin, ortamı hücrelerle karıştırmak için her 15 dakikada bir plakayı sallayın. Daha sonra,% 10 FBS içeren 25 mililitre tam Grace's Media ve mililitre başına 100 mikrogram Penisilin-Streptomisin antibiyotik ekleyin.P1 geçiş virüsünü elde etmek için plakayı 27 santigrat derece inkübatörde üç gün boyunca inkübe edin. Bundan sonra, süpernatanı steril 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hücre kalıntılarını temizlemek için beş dakika boyunca 1.010 kez g'de döndürün.Süpernatanı temiz bir tüpe boşaltın ve bir yıla kadar veya kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. Virüsü P1'den P2 geçişine yükseltmek için, önce 150 milimetrelik bir plaka üzerinde% 90 birleşmeye kadar tek katmanlı bir Sf9 hücresi büyütün. İstenilen birleşim noktasına ulaşıldığında, ortamı aspire edin.İki mililitre P1 virüsü ekleyin ve 27 derecelik bir inkübatörde bir saat inkübe edin. Virüsün P2 ve P3 pasajlarını elde etmek için amplifikasyon adımlarını tekrarlayın. Bu çalışmada, hedef genin içsel sinyal dizisini değiştirerek salgılanan proteinleri gp67 veya hemolin sinyal dizisi ile eksprese etmek için iki modifiye pFastBac1 bakulovirüs ekspresyon vektörü kullanılmıştır.PBEC gp67, a-thal-leano reseptörü TDR'nin hücre dışı alanlarını eksprese etmek için başarıyla kullanılmaktadır. PBEC1 hemolini, hücre dışı alanı PRK3'ü eksprese etmek için başarıyla kullanılırken. Daha sonra, saflaştırılmış proteinler mililitre başına beş miligrama konsantre edilir ve kristalizasyon taramasına tabi tutulur.Her protein için ön kristalleri veren koşullar, 20 mikrometreden daha büyük protein kristalleri gözlenene kadar optimize edilir. Bu prosedürü denerken, proteinlerin kalitesini boyut dışlama kromatografisi, çok açılı ışık saçılımı ve rekombinant proteinin agregasyon olmama durumu için diğer tahlillerle incelediklerini hatırlamak önemlidir. Unutmayın, proteinin saflığını gümüş leke ile de kontrol edin.Bu prosedürü takiben, üretilen proteinin üç boyutlu yapıları gibi ek soruları yanıtlamak için X-ışını kristalografisi ve kriyo-EM gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, yapısal biyoloji alanındaki araştırmacıların, bitkilerden ve memelilerden salgılanan proteinlerin yapısal, işlevsel ve biyokimyasal özelliklerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Agaroz jeli üzerindeki DNA bantlarını görselleştirmek için ultraviyole ışıkla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken UV korumaları, yüz siperi, göz gözlüğü, laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.Ayrıca tampon yaparken, güçlü asitleri ve bazları tutarken dikkatli olun.

modifying-baculovirus-expression-vectors-to-produce-secreted-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım...

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Kindlins İntegrinlerin yoluyla hücre yapışması temel vardır ama bunların çalışmalar bakteriyel konaklarda rekombinant olarak bunları ifade karşılaşılan zorluk engel olmuştur. Burada bakulovirüs ile enfekte olmuş böcek hücrelerinde bunların verimli üretimi için yöntemleri tarif eder.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Yabancı proteinler ifade veya anti-apoptotik etkinliğini potansiyel yabancı proteinler ve onların kesilmiş amino değerlendirmek için kullanılabilir bir ısı şok kaynaklı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre), bu iletişim kuralını açıklar asitler böcek hücrelerinde.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

Bu protokol için baculovirus baculovirus plazmid geçici transfection Sf9 hücreleri tarafından üretilen ve bir serum serbest süspansiyon kültürde güçlendirilmiş. Süpernatant heparin benzeşme Kromatografi tarafından saf ve ultrasantrifüj tarafından daha da yoğunlaştı. Bu iletişim kuralı üretim ve baculovirus gen terapisi uygulama için arıtma için yararlıdır.

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Öğrenin bitki salgı proteinlerinin böcek hücrelerinde Baculovirus vektörleriyle düşük maliyetli ifadesi ve kristalizasyon için yapısal biyoloji yöntemlerini.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Daha fazla video keşfet