Name: TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Öğrenin, fare nöron hücrelerinde tChIP-Seq kullanarak hücre türüne özgü histon modifikasyonlarını analiz edin. Bu yöntem epigenetik düzenlemeyi keşfetmek için değerli bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Iwasaki laboratuvar şekilde alt alta yazılmalıdır eleştirel okuma için tüm üyeleri teşekkür ediyoruz. Bu eser kısmen yenilikçi alanları (#26113005); S.N. ve JP17H05679 sı için bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir Genç bilim adamları için bir Grant-in-Aid (A) sı için (JP17H04998) Milli Eğitim Bakanlığı, bilim, spor ve kültür Japonya (MEXT); ve Pioneering "Hücresel evrim" ve tüm RIKEN proje "Hastalığı ve Epigenome" RIKEN üzerinden (için S.N. ve sı) projeleri.

Burada açıklanan tüm yöntemleri RIKEN (H27-EP071) Emanet bölümü tarafından onaylanmış ve ilgili kurallar ve düzenlemeler yapılmıştır.
1. doku diseksiyon
<ol><li>Küçük parçalar halinde faiz dokuların teşrih (yaklaşık < 3 mm2) güzel bahar makas kullanarak. Not: Daha büyük doku parçaları dondurmak için daha uzun sürer ve daha küçük parçalar arabellek, ikisi de sonuçları etkileyebilecek daha büyük birimleri üzerinde taşıyacak.</li>
	<li>Sıvı azot ile dolu bir temiz kapsayıcı disseke doku parçaları ekleyin ve onların 2 mL tüpler (tüp başına 1 adet) içine sıvı azot ile dolu toplamak. Not: Tüpler hidrofilik yüzey ile bu adım için tavsiye edilir.</li>
	<li>-80 ° c > 5 dakika kalan sıvı azot buharlaşır için aç kapaklı tüpler yerleştirin. Not: kapağı kapatıldıktan sonra doku parçaları-80 ° C'de kullanmadan önce bir ay depolanabilir.</li>
</ol>2. hücre fiksasyon
Not: Biz bu adımı için kullanışlı bir kriyojenik değirmeni kullanılır. Alternatif bir aparat kullanılabilir.
<ol><li>Yer 2 mL-protein düşük bağlayıcı tüpler bir metal buz raf üzerinde doku örnekleri içeren sıvı azot soğutulmuş.</li>
	<li>Metal bir kurşun bir 1,5 mL tüp ve chill sıvı azot ile yerleştirin. Metal buz rafa yerleştirin.</li>
	<li>2 mL tüp açın ve prechilled metal mermi tüpün içine yerleştirin. Kapağı kapatın, kullanışlı bir kriyojenik değirmeni tüp yuvasına 2 mL tüpler ayarla ve hemen 1 dk. için sıvı azot içinde birleştirilmiş tüp sahibinin daldırma.</li>
	<li>Donmuş tüp sahibi kullanışlı kriyojenik değirmeni dış kaset yerleştirin ve şiddetle çalkalanır 60 kez için 30 s.</li>
	<li>Boru tutucu sökmeye metal kurşunu çıkarıp yer 2 mL-tüp bir örneği soğutucu-20 ° C'de prechilled</li>
	<li>Örnek bir sonraki adımda sabitleştirici dondurulması önlemek 15 dakika-20 ° C'de soğutucu yerleştirin.</li>
	<li>Tezgah için örnek soğutucu getirmek, tüp kapağını açın ve hemen 900 µL % 1 formaldehit içine damla. Birkaç kez pipetting sonra süspansiyon yeni 2 mL tüp 900 µL % 1 formaldehit ve 10 dk 23 ° C'de ayarla bir kuluçka nazik döndürme için düzeltme içeren transfer. Dikkat: Formaldehit zehirli ve zararlı olduğunu.</li>
	<li>Fiksasyon reaksiyonu durdurmak için 2.5 M glisin 100 µL her tüp ve santrifüj 3000 x g 4 ° C'de 5 dakika için ekleyin Süpernatant atmak.</li>
	<li>Buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS), santrifüj, 3000 x g 4 ° C'de 5 min için 1 mL ekleyin ve süpernatant atın. Bu iki kez (Toplam 3 yıkar) tekrarlayın. Not: Flash donmuş sıvı nitrojen tarafından ve saklı-80 ° C'de sabit örnekleri olabilir</li>
	<li>Lizis arabellek 1 500 µL ekleyin (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (pH 8.0), % 10 w/v gliserol, % 0,5 w/v NP-40, % 0,25 w/v Triton X-100 ve 0.1 x proteaz inhibitörü kokteyl) için Pelet, damlalıklı birkaç kez ve Döndür'ün 4 ° C'de 10 dakika Not: Lizis arabellek 1 filtre ve kullanımdan önce 4 ° C'de depolanan gerekir.</li>
	<li>3000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Lizis tampon 2 1 mL ekleyin (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA ve proteaz inhibitörü kokteyl x 0.1) için Pelet, girdap ve Döndür'ün 4 ° C'de 10 dakika Not: Lizis arabellek 2 filtre ve kullanımdan önce 4 ° C'de depolanan gerekir.</li>
	<li>3000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabelleği 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile 800 µL için Pelet ekleyin ve Pelet pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>3000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>RIPA arabelleği 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile 500 µL ekleyin.</li>
	<li>3000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>1 mL 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile RIPA tampon ekleyin. Hemen bir sonraki adıma geçin.</li>
</ol>3. Kromatin yamultma
<ol><li>Lysate bir sonicator tüp aktarmak ve tüp üzerinde bir ultrasonicator yerleştirin.</li>
	<li>Kromatin aşağıdaki ayarlarla kesme: sıcaklık: 4 ° C; tepe olay gücü: 175 W; görev faktörü: % 10; devir/seri çekim: 200; ve Saat: 2400 s.</li>
	<li>Örnek bir 1,5 mL-protein düşük bağlama tüp ve santrifüj 20.000 x g 4 ° C'de, 5 min için transfer</li>
	<li>Süpernatant yeni bir protein düşük bağlama tüp içine toplamak. Not: Örnek olabilir flaş donmuş sıvı azot ve-80 ° C'de depolanan</li>
</ol>4. kalite kontrol DNA (ters çapraz)
<ol><li>Mix 20 µL, lysate ve 180 µL çip elüsyon arabelleği (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) ve % 1 w/v Sodyum Lauryl Sülfat (SDS)) bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp. Örnek bir termal cycler açık termal cycler kapaklı 6 h 65 ° C'de kuluçkaya. Aşırı denatürasyon önlemek için termal cycler aç ağzını tut. Not: ChIP elüsyon arabellek filtre ve kullanımdan önce oda sıcaklığında saklanan gerekir. Bu kuluçka gece için genişletilebilir.</li>
	<li>10 mg/ml RNase 1 µL eklemek bir, girdap ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>15 mg/ml 6.5 µL eklemek İndinavir K, girdap ve 60 dk 55 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Bir DNA düşük bağlama tüp için tepki aktarmak, 5 mg/mL glikojen ve girdap 4 µL ekleyin. Daha sonra fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) ve 5 min için santrifüj 200 µL 18.000 x g oda sıcaklığında de ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant yeni bir DNA düşük bağlama tüp aktarın. Tris-EDTA-NaCl arabelleği 200 µL ekleyin (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) ve 200 mM NaCl) kalan fenol/kloroform/izoamil alkol çözümü ve santrifüj 18.000 x g oda sıcaklığında, 5 min için. Süpernatant toplamak ve ilk süpernatant ile karıştırın.</li>
	<li>Buz gibi soğuk etanol 900 µL ekleyin ve 1 h-20 ° C'de için kuluçkaya Not: Bu kuluçka 4 - 6 için s uzatılabilir.</li>
	<li>18.000 x g 4 ° C'de de 30 dk santrifüj</li>
	<li>Süpernatant atmak. Pelet ve 18.000 x g 4 ° C'de de 30 dk santrifüj buz gibi % 75 etanol 1 mL ekleyin (Toplam iki yıkar) bu adımı yineleyin.</li>
	<li>İyice süpernatant atın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuruması.</li>
	<li>Tris-EDTA (TE) arabelleği 50 µL ekleyin ve DNA bu 30 dakika oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçka tarafından çözülür. Vortexing veya pipetting kaçının. Bu DNA'yı "giriş" olarak tutmak ve gerekirse Kütüphane hazırlık için kullanabilirsiniz.</li>
	<li>DNA toplama bir yer üreticinin yönerge göre ölçü ( tablo malzemelerigörmek) ve boyut dağılımı ile bir mikrosıvısal Elektroforez makine kontrol edin (bkz: Şekil gösterilen temsilcisi verileri 2A). kullanım 10 ng veya daha az DNA bu tahlil için. Not: 100-500 baz çifti (bp) parçaları % 50 veya daha fazla DNA'ın yukarı yapmak gerekir.</li>
</ol>5. benzeşme arıtma Anti-bayrak antikor tarafından
Not: nöron tChIP-Seq için 8 fareler dokulardan beyin genellikle tChIP-Seq bir örneği için 2 hazırlamak için kullanılan ng tandem bağışıklık-arıtma tarafından saf DNA'ın (bkz. Adım 7.1). Bizim ellerde 0.1 ng sağlanan DNA hala yüksek kaliteli DNA kitaplıkları için ChIP-Seq (Kadota, yayınlanmamış). Böylece, teorik olarak, tek bir fare nöron tChIP-Seq. gerçekleştirmek için yeterli olabilir Gerekli miktar faiz doku ve hücre türü için optimize edilmelidir. İmumuno-arıtma deney negatif kontrol için beyin dokusu lysate herhangi bir H2B-bayrak ifade olmadan fare üzerinden hazırlanan ve kullanılan.
<ol><li>Koyun Anti-fare immünoglobulin G (IgG) bir protein düşük bağlama tüp içine Birleşik manyetik boncuklar 200 µL pipet.</li>
	<li>Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve netlik süpernatant 1 dakika bekleyin. Süpernatant atmak, buz gibi PBS ve girdap 1 mL ekleyin. (Toplam iki yıkar) bu adımı yineleyin.</li>
	<li>1 mg/mL Anti-bayrak antikor 20 µL ekleyin ve 4 ° C'de 5 h için döndürün Not: Bu kuluçka gece için genişletilebilir.</li>
	<li>Adım 5.2 takip boncuk yıkayın. Boncuk 15 mL tüp içine yerleştirin.</li>
	<li>Boncuk RIPA arabellek 1110 µL içinde resuspend ve 10 engelleme reaktif, 180 Denhardt'ın çözüm x 50 µL, proteaz inhibitörü kokteyl x 100 10 µL ve adım 3'te hazırlanan lysate 6.8 mL x 900 µL ekleyin. Bu karışımı 5 protein düşük bağlayıcı tüpler içine bölünmüş. 4 ° C'de 6 h için döndürme Not: Bu kuluçka gece için genişletilebilir.</li>
	<li>Tüp manyetik stand üzerine yerleştirin ve netlik süpernatant 1 dakika bekleyin. Süpernatant atmak, RIPA arabellek 1 mL ekleyin ve karışımı yavaşça. Bu adım 5 kez tekrarlayın (Toplam 6 yıkar). Tüm boncuklar bir tek protein düşük bağlama tüpüne havuz.</li>
	<li>ChIP elüsyon arabelleği 200 µL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında döndürün. DNA'ın kalite kontrol edin (bkz. Şekil 2B ve Cgösterilen temsilcisi veriler) 4.11. adımda açıklandığı gibi. Hemen bir sonraki adıma geçin.</li>
</ol>6. benzeşme arıtma Anti-H3K4me3 antikor ve ters çapraz
Not: Adımları (6.1-6.4)-meli var olmak kılınmak önce adım 5,7 aşağıdaki boncuk hazırlık.
<ol><li>Manyetik boncuklar 2 mL-protein düşük bağlama tüp içine koyun Anti-fare IgG için Birleşik 40 µL pipet.</li>
	<li>Tüp manyetik stand üzerine yerleştirin ve netlik süpernatant 1 dakika bekleyin. Süpernatant atmak, buz gibi PBS 1 mL ekleyin ve karışımı yavaşça. (Toplam iki yıkar) bu adımı yineleyin.</li>
	<li>1 mg/mL anti-H3K4me3 antikor 4 µL ekleyin ve 4 ° C'de 6 h için döndürün</li>
	<li>Adım 6.2 takip boncuk yıkayın. Boncuk 2 mL-protein düşük bağlama tüp içine yerleştirin.</li>
	<li>Boncuk RIPA arabellek 1558 µL içinde resuspend ve reaktif, 50 Denhardt'ın çözüm x 40 µL, 2 µL proteaz inhibitörü kokteyl x 100 ve üzerinde adım 5.7 hazırlanan eluate 200 µL engelleme x 10 200 µL ekleyin. Gecede 4 ° C'de döndürmek Not: SDS çip elüsyon arabelleğinde 10 kereden daha fazla bu kuluçka düşürülmüştü.</li>
	<li>Tüp manyetik stand üzerine yerleştirin ve netlik süpernatant 1 dakika bekleyin. Süpernatant atmak, RIPA arabellek 1 mL ekleyin ve karışımı yavaşça. 4 kez bu işlemi tekrarlayın (Toplam 5 yıkar). Son yıkama sonra boncuklar bir DNA düşük bağlama tüp içine aktarmak ve süpernatant atın.</li>
	<li>ChIP elüsyon arabelleği 200 µL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında döndürün. Eluate yeni bir DNA düşük bindingTube aktarın. Not: Eluate-80 ° C'de saklanabilir</li>
	<li>Adım 4 DNA'ın decrosslinking için izleyin. Saf DNA TE arabellek 20 µL içinde resuspend.</li>
	<li>DNA'ın kalite kontrol edin (bkz. Şekil 2Bolarak gösterilen temsilcisi veriler) 4.11. adımda açıklandığı gibi. (isteğe bağlı) Kantitatif PCR ile zenginleştirme analiz gerçekleştirmek2daha önce açıklandığı gibi. Panolarında veya büyük zenginleştirme gözlenen.</li>
</ol>7. Kütüphane İnşaat
<ol><li>Her girdi ve çip DNA örneği için DNA mikrosıvısal Elektroforez makine için yazılım smear analiz işlevini kullanarak 100-500-bp bölgedeki oranı hesaplar. 2'yi edinmek için gerekli numune hacmi tahmin ng 100-500 BP DNA. 20 ng DNA 100-500-bp aralığında "giriş" örnek olarak kullanın.</li>
	<li>DNA örnekleri 8-şerit PCR tüpler içine pipet ve DNA hacmi 10 µL, orantılı olarak ölçek-up aşarsa, toplam hacim 10 µL. için (isteğe bağlı) getirmek için H2O aşağıdaki bitiş-onarım tepki ve boyut seçimi ekleyin.</li>
	<li>Son onarım ana karışım hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek). Son onarım ana mix 4 µL DNA'yı ekleyin ve 20 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>10 mm Tris-Cl, pH 8,5 36 µL ekleyin ve tersinir immobilizasyon (SPRI) manyetik boncuklar faz ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya 0.6 x Ses (30 µL) katı.</li>
	<li>Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant temiz hale gelinceye kadar bekleyin.</li>
	<li>Yeni bir tüp süpernatant transfer 1.2 x (60 µL) hacimleri SPRI manyetik boncuklar eklemek ve oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya.</li>
	<li>Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant temiz hale gelinceye kadar bekleyin.</li>
	<li>Boncuk 200 µL % 80 ile iki kez yıkayın alkol, tüp mıknatıs hala üzerinde tutarak.</li>
	<li>Kısa bir süre kalan alkol alt toplamak ve geri üzerinde mıknatıs yerleştirmek için tüp santrifüj kapasitesi. Artık alkol iyice kaldır.</li>
	<li>Tüp kapak alkol buharlaşır izin vermek 1-2 min için açık bırakın.</li>
	<li>Kapağı kapatın ve tüp buz üzerinde tutun. Not: Şimdi boyutu seçili DNA 100-500 BP boncukları üzerinde almış. Çift boyut seçimi hakkında daha fazla bilgi (www.beckman.com) üreticinin Web sitesinde bulunabilir.</li>
	<li>A-takip ana hazırla ( Tablo malzemelerigörmek) karıştırın.</li>
	<li>Boncuk (Kimden adım 7,10) A-takip ana mix 10 µL ile resuspend ve 30 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>1.8 x birim (18 µL) Polietilen glikol (PEG) eklemek / NaCl çözüm ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>DNA arındırmak için 7.7-7,11 adımları izleyin.</li>
	<li>Tüp ligasyonu arabellek karışım hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Tüp ligasyonu arabellek Mix (Kimden adım 7,14) boncuk üzerine 8 µL pipet, 1 µM bağdaştırıcısının 1 µL eklemek ve boncuk resuspend. 5 µM bağdaştırıcısının 1 µL giriş örneği için kullanmak. Çoğullama için her örnek için farklı bağdaştırıcıları kullanmayı düşünün.</li>
	<li>DNA ligaz 1 µL ekleyin ve 20 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Boncuk resuspend ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya 1.0 x birim (10 µL) PEG/NaCl çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>DNA arındırmak için 7.7-7.10 adımları izleyin.</li>
	<li>10 mm Tris-Cl, pH 8,5 tüp içine 25 µL pipet ve boncuk resuspend.</li>
	<li>1.0 x (25 µL) hacmi PEG/NaCl çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>DNA arındırmak için 7.7-7.10 adımları izleyin.</li>
	<li>10 mm Tris-Cl, pH 8,5 tüp içine 11 µL pipet ve boncuk resuspend.</li>
	<li>Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant temiz hale gelinceye kadar bekleyin.</li>
	<li>Süpernatant yeni 8-şerit PCR tüp içine toplamak.</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR ana karışım hazırlamak (malzeme Ayrıntılar için bakınız).</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR ana Mix 384-şey kantitatif PCR (qPCR) plaka 8,5 µL pipet ve bağdaştırıcının 1,5 µL DNA'dan (adım 7.26) tane ekleyin.</li>
	<li>Boş Wells floresan her standart 10 µL pipet.</li>
	<li>Aşağıdaki programı ile gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek: (98 ° C 45 için s) 1 döngüsü, x (98 ° C 15 s, 30 60 ° C s, 30 72 ° C s) x 20 döngüleri, ve (72 ° C 60 s) x 1 döngüsü.</li>
	<li>PCR döngüleri floresan Standart 2 floresan yoğunluğu ulaşmak için gereken sayısını belirleyin.</li>
	<li>PCR ana hazırla ( Tablo malzemelerigörmek) karıştırın.</li>
	<li>11,5 µL PCR ana karışımı içine (Kimden adım 7.26) kalan bağdaştırıcısı bakmaksızın DNA pipet ve PCR adım 7.31 belirlenen PCR çevrimleri ile adım 7,30 içinde belirtildiği şekilde gerçekleştirin.</li>
	<li>1.0 x (20 µL) hacmi PEG/NaCl çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>DNA arındırmak için 7.7-7.10 adımları izleyin.</li>
	<li>10 mm Tris-Cl, pH 8,5 tüp içine 20 µL pipet ve boncuk resuspend.</li>
	<li>Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant temiz hale gelinceye kadar bekleyin.</li>
	<li>Süpernatant yeni 1,5 mL-DNA düşük bağlama tüp içine toplamak.</li>
	<li>Kütüphanede kalitesini kontrol edin (bkz: 2E ve F rakamgösterilen temsilcisi veri) 4.11 adımda açıklandığı gibi. Kütüphane DNA örneği 1 µL kullanın. (isteğe bağlı) 2daha önce açıklandığı gibi qPCR tarafından zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin. Panolarında veya büyük zenginleştirme gözlenen.</li>
</ol>8. sıralama
<ol><li>Yeni nesil sekanslama kitaplıklarda sıra (bkz: Şekil 3' te gösterilen temsilcisi veri). Not: Veri analizi için yeterli sıra derinliği organizma3genom boyutuna bağlı olarak değişir. İnsan ve fare, biz tavsiye almak en az 20-40 milyon tek taraflı kenar defa okundu. Çoğullama okuma verimini göre uygun maliyetli olabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Mito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+survey+of+epigenetic+modifications+by+tandem+chromatin+immunoprecipitation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).</li>
<li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).</li>
<li>Jung, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sequencing+depth+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).</li>
<li>Becker, P. B., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+remodeling+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleosome remodeling and epigenetics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+library+preparation+for+next-generation+sequencing+analysis+of+genome-wide+epigenetic+and+transcriptional+landscapes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Hornstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-free+ribosome+profiling+of+cell+type-specific+translation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain.</a> Genome Biology. 17 (1), 149(2016).</li>
<li>Zhao, Y., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+catalog+of+currently+documented+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive catalog of currently documented histone modifications.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bizim iletişim kuralı H2B bayrak öğesini ifade tamoxifen enjeksiyonu ile indüklenen olduğu fare beynin nöronlar için optimize edildi. H2B ifade, başlangıç doku malzeme ve doku miktarı için kullanılan Rehberleri başarılı tChIP-devamı çok önemli parametreleridir Böylece, bu faktörlerin optimizasyonu ilgi her hücre türü için düşünülmelidir.
Bu protokol için kullanılan yordamlar arasında önemli bir adım 100-500 bp5kromatin uzunluğunu elde etmek için kesme DNA'sı. Genel olar...

Hayvan dokuları farklı hücre türleri oluşur. Gen düzenlemesi her hücrede hücre türü tanımlar. Kromatin değişiklikler - DNA metilasyonu ve histon değişikliği - gen ekspresyonu hücre tipi özgüllük altında yatan. Bu nedenle, her hücre tipi epigenetik yönetmelikle ölçülmesi istenen ancak teknik bir mücadele vardı.
Tandem kromatin immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) belirli bir hücreye epigenetik araştırmak için son zamanlarda geliştirilen (resim 1)1yapıldı. TChIP içinde bir hücre türüne özgü organizatörü epitope öğesini çekirdek histon protein H2B ifade edilir. Malzeme çeşitli hücre türlerinin bir karışımını başlar, ancak bu özellik chromatins ilgi, hücrelerden yalıtım sağlar. Aşağıdaki ChIP-Seq — kromatin arınma yolu ile bir değişikliğin histon işareti ve yeni nesil derin sıralama, izole DNA — bir genom geniş şekilde hedeflenen hücre tipi epigenetik durumunu izleyebilirsiniz.
Bu tekniği kullanarak, biz son zamanlarda araştırdık histon H3 protein lizin 4 (H3K4me3), nöron özel trimethylation işaretleri. Bu çalışmada, geliştirdiğimiz bir çakma fare hangi C-ölümcül içinde bayrak öğesini H2B protein Cre-aracılı rekombinasyon (Rosa26CAG floxed-pA H2B-bayrak) ifade edildi. Cre-endoplasmic retikulum (ER) gen CamK2a Düzenleyicinin kontrolü altında sahip bir fare ile geçiş tarafından elde edilen fare çizgi üzerine tamoxifen enjeksiyon (Camk2aH2B-bayrak)1aktif nöron H2B-bayrak indüklenen. Kurulan fare çizgi beyinden başlayarak, biz tChIP-Seq anti-H3K4me3 antikor ile gerçekleştirilen. Bu yana H3K4me3 işaretleri çoğunlukla organizatörü bölgelere karşılık, özellikle nöronlar1' ifade mRNA'ların yüzlerce keşfetmek olabilir.
Burada, doku diseksiyon adımlarına Kütüphane inşaat ()Şekil 1)kapsayan bir tipik tChIP-Seq yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı son tChIP-Seq performansını ve diğer hücre tipleri ve histon değişiklikler bu yöntemin uygulama gelecek için bizim en iyi uygulamaları paylaşmak için hedeftir.

<table><tbody><tr><td>Protein LoBind tüpü, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108132</td><td>Hücre lizisi için</td></tr><tr><td>Protein LoBind tüpü, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108116</td><td>ChIP ve kütüphane hazırlığı için</td></tr><tr><td>DNA LoBind tüpü, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108051</td><td>ChIP ve kütüphane hazırlığı için</td></tr><tr><td>8 şeritli PCR tüpü</td><td>BIO-BIK</td><td>3247-00</td><td>ChIP ve kütüphane hazırlığı için</td></tr><tr><td>SK Mill</td><td>TOKKEN</td><td>SK-200</td><td>Sabitleme için hücre tozu yapmak için kullanışlı kriyojenik öğütücü</td></tr><tr><td>Metal mermi</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-DLC10</td><td>SK Mill</td></tr><tr><td>2 mL paslanmaz çelik boru</td><td>aksesuarı TOKKEN</td><td>TK-AM5-SUS</td><td>Hücre için bir seçenek lizis</td></tr><tr><td>2 mL paslanmaz çelik boru tutucu</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-TL</td><td>Hücre lizisi için bir seçenek</td></tr><tr><td>%16 formaldehit (w/h), metanol içermez</td><td>Pierce</td><td>28906</td><td>Hücreleri sabitlemek için. Kullanmadan önce% 1 çözelti hazırlayın.</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-35</td><td>2,5 M stok</td></tr><tr><td>hazırlayın D-PBS (-)(1x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>Lizat ve saflaştırılmış DNA'yı yıkamak için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02443-05</td><td>Lizis tamponu için 1. 1 M, pH 7.5 stoğu hazırlayın.</td></tr><tr><td>5 M NaCl, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06900-14</td><td>Lizis tamponu 1, Lizis tamponu 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>311-90075</td><td>Lizis tamponu 1, Lizis tamponu 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu</td></tr><tr><td>için Gliserol</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.</td><td>072-04945</td><td>Lizis tamponu için 1</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25223-75</td><td>Lizis tamponu için 1</td></tr><tr><td>Triton X-100, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-32</td><td>Lizis tamponu için 1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-91</td><td>Lizis tamponu için 2, ChIP Elüsyon Tamponu ve Tris-EDTA-NaCl Tamponu. 1 M, pH 8.0 stoğu hazırlayın.</td></tr><tr><td>0.1 M EGTA pH nötr</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08947-35</td><td>Lizis Tamponu 2 için</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-24</td><td>Protein RIPA tamponunun bozulmasını engellemek</td></tr><tr><td></td> için <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>Hücre lizisi ve yıkama için</td></tr><tr><td>milliTUBE 1 mL AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td>Sonikatör tüpü. Odaklanmış ultrasonicator</td></tr><tr><td>Aksesuarı Focused-ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>S220 veya E220</td><td>DNA'yı ChIP-Seq</td></tr><tr><td>UltraPure 10% SDS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15553-027</td> için yeterli boyuta sindirmek <td>için ChIP Elüsyon Tamponu</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>için Nacalai Tesque</td><td>30141-14</td><td>DNA'yı lizat</td></tr><tr><td>Proteinaz K, rekombinant, PCR Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115887001'den saflaştırmak için</td><td>DNA'yı lizat</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>'den saflaştırmak için.<td>054-07225</td><td>% 70 çözelti yapın</td></tr><tr>Fare <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804'te</td><td>üretilen monoklonal anti-FLAG M2 antikoru</td><td>İlgilenilen hücrelerde eksprese edilen kromatini saflaştırmak için</td></tr><tr><td>Dynabead M-280 Koyun Anti-Fare IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11201D</td><td>Bu, anti-FLAG IP ve anti-H3K4me3 IP</td></tr>, <tr><td>Anti-tri-metil histon H3 (K4), fare monoklonal antikoru</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td> için kullanılabilir.<td>301-34811</td><td>ChIP analizi için çalışan diğer herhangi bir antikor</td></tr><tr><td>çalışacaktır 10x Bloke Edici Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Afinite saflaştırması sırasında bloke etmek için</td></tr><tr><td>Denhardt' s çözeltisi</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10727-74</td><td>Afinite saflaştırması sırasında bloke etmek için</td></tr><tr><td>Glikojen (5 mg / ml)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>DNA'yı lizattan saflaştırmak için</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Florometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>İzole DNA'nın miktar tayini için</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>İzole DNA'nın miktar tayini için</td></tr><tr><td>0,5 mL tüp</td><td>Axygen</td><td>10011-830</td><td>Qubit</td></tr><tr><td>Fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1)</td> ile miktar tayini için <td>Nacalai Tesque</td><td>25970-56</td><td>Lizattan DNA'yı saflaştırmak için</td></tr><tr><td>AMPure XP boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Kütüphane hazırlığı için SPRI manyetik boncuklar</td></tr><tr><td>Metal buz rafı</td><td>Funakoshi</td><td>IR-1</td><td>Hücre lizatını donmuş</td></tr> <tr><td>tutmak içinÖrnek Soğutucu</td><td>New England Biolabs</td><td>T7771S</td><td>Hücreleri minimum hasarla düzeltmeye yardımcı olur</td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>İzole edilmiş DNA parçalarının kalitesini kontrol etmek için. Başka bir parça analizörü kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Biyoanalizör 2100 Uzman Yazılım</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946CA</td><td>Biyoanalizör Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti ile birlikte verilir</td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>İzole edilmiş DNA parçalarının kalitesini kontrol etmek için</td></tr><tr><td>KAPA LTP Kütüphane Hazırlama</td><td>Kiti Roche</td><td>07961898001</td><td>10x KAPA Uç Onarım Tamponu, KAPA Uç Onarım Enzim Karışımı, KAPA A-Kuyruk Tamponu, KAPA A-Kuyruk Enzimi, KAPA Ligasyon Tamponu, KAPA DNA Ligaz ve PEG / NaCl çözeltisi</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA Barkodları</td> ile birlikte verilir Kütüphane hazırlığı için <td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-514101</td><td>Adaptörü. DNA Barkod Adaptörleri ve Primer Mix ile birlikte verilir.</td></tr><tr><td>KAPA Gerçek Zamanlı Kütüphane Amplifikasyon Kiti</td><td>Roche</td><td>07959028001</td><td>2x KAPA HiFi HS gerçek zamanlı PCR Master Mix, PCR Primer Mix ve Floresan Standartları ile birlikte verilir</td></tr><tr>Kütüphane hazırlığı için<td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KM2602</td><td>. Ek olarak, bu enzim KAPA Gerçek Zamanlı Kütüphane Amplifikasyon Kiti</td></tr><tr><td>Tamponu için gerekli olabilir EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, DNA</td></tr><tr><td>386 kuyulu qPCR plakasının</td> elüsyonu için pH 8.5 <td>Gerçek zamanlı PCR için</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309849</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>DNA'yı ölçmek için</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485701</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik Yapışkan Film</td><td>Gerçek zamanlı PCR</td>için <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td></tr><tr><td>MicroAmp Şeffaf Yapışkan Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td>Plaka sızdırmazlığı için</td></tr><tr><td>Son onarım ana karışımı</td><td></td><td></td><td>1.4 ve mikro; L 10x KAPA Uç Onarım Tamponu, 1 & L KAPA Uç Onarım Enzim Karışımı ve 1.6 & mikro; L of H2O</td></tr><tr><td>A-taling ana karışımı</td><td></td><td></td><td>1 & birleştirin; L KAPA A-Kuyruk Tamponu, 0.6 & KAPA A-kuyruk enziminin L'si ve 8.4 & mikro; L H 2 O</td></tr><tr><td>Ligasyon tampon karışımı</td><td></td><td></td><td>Kombine 2 & mikro; L KAPA ligasyon tamponu ve 6 &mikro; L of H2O</td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı PCR ana karışımı</td><td></td><td></td><td>Combine 5 & L 2x KAPA HiFi HS gerçek zamanlı PCR Master Mix, 0.35 & L PCR Primer Karışımı (10 & mikro; İleri astar AATGATACGGCACCACCGAG ve ters astar CAAGCAGAAGACGGCATACGAG'ın her biri M) ve 3.15 &mikro; L H2O</td></tr><tr><td>PCR ana karışımı</td><td></td><td></td><td>10 ve mikroyu birleştirin; L 2x KAPA HiFi Hazır Karışım, 0.9 & L PCR Primer Karışımı ve 0.6 & mikro; L of H2O</td></tr><tr><td>Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici</td><td>Geniş Enstitüsü</td><td>IGV_2.3.88</td><td>Dizileme verilerini görselleştirmek için genom tarayıcısı</td></tr><tr><td>DNA olgionükleotid: 5&prime;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td> GAPDH DNA olgionükleotidinin <td>promotör bölgesini amplifiye etmek için bir primer</td></tr><tr><td>: 5&prime;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td> GAPDH SYBR Premix Ex Taq Takara RR420L'nin <td>promotör bölgesini amplifiye etmek için bir astar</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>GADPH promotör bölgesine karşılık gelen DNA'yı ölçmek için</td></tr><tr><td>Termal Döngüleyici Zar</td><td>Takara</td><td>TP870</td><td>GADPH promotör bölgesine karşılık gelen DNA'yı ölçmek için</td></tr></tbody></table>

tchip-seq: hücre türüne özgü epigenome profil oluşturma

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetik yönetmelik gen ifadesinde merkezi rol oynar. Histon değişiklik 1960'larda keşfetti, fizyolojik ve patolojik fonksiyonları kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Gerçekten de, yeni nesil derin sıralama ve kromatin immunoprecipitation (ChIP) belirli histon değişiklik antikorlar ile bizim görünümü epigenetik Yönetmeliğin genom arasında devrim yarattı. Diğer taraftan, dokular genellikle farklı hücre türleri oluşur ve onların karmaşık karışımı belirli bir hücreye epigenome soruşturma için analitik sorunlar teşkil etmektedir. Biz son zamanlarda kromatin seçici arıtma tagged çekirdek histon proteinleri hücre tarafından dayanmaktadır tandem kromatin immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq), hücre türüne özgü kromatin devlet bir genom geniş şekilde yönelik olarak geliştirilen faiz, ChIP-Seq. tarafından takip türleri Bu iletişim kuralının amacı tChIP-devamı en iyi uygulamalar giriştir Bu teknik için çeşitli histon modifikasyonları ve model organizmalar doku özel epigenome soruşturma çok yönlü bir araç sağlar.

Burada, tandem arıtma kromatin ve DNA Kütüphane hazırlık yeni nesil sıralayıcılar için doku diseksiyon, fiksasyon, hücre lizis tarif. İşlemler sırasında bir birden çok adımı (resim 2), başarılı sıralama anahtarıdır DNA kalitesini test edebilirsiniz. Bir tek nucleosome genellikle 147 bp DNA 4tarafından çevrili beri yamultulmuş DNA o boyutundan daha kısa olmamalıdır. Hemen ultrasonication sonra DNA izole ve bir mikrosıvısal Elektroforez ...

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Bu yöntem, genomlarla birlikte hücre tipine özgü bir şekilde ne kadar renk modifikasyonlarının düzenlendiği gibi epigenetik alanındaki anahtar soruların yanıtalmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kromatini hedeflenen hücrelerden izole edip tipik çingene akıntısını takip edebilesek. Yani bu yöntem nöron spesifik trimincil, lysinc 4, opisoncilly içine anlayışlar sağlayabilir.Ayrıca diğer histon modifikasyonu, diğer hücre tipleri ve daha sonra diğer model organizmalar uygulanabilir. Prosedürü gösteren Mari Mito, laboratuvarımdan bir teknisyen. Başlamak için, küçük parçalar halinde ilgi doku incelemek için ince bahar makas kullanın.Sıvı nitrojen dolu temiz bir kap için doku parçaları ekleyin. Daha sonra, sıvı nitrojen dolu iki mililitre tüpler doku parçaları aktarın. Tüpleri eksi 80 derecede beş dakika saklayın ve kapağı açık olarak sıvı nitrojeni buharlaştırın.Doku örneklerini içeren tüpleri soğutulmuş metal buz rafına yerleştirin. Sonra, 1.5 mililitrelik bir tüp içine metal bir mermi yerleştirin ve sıvı nitrojen ile soğutun. Soğutulmuş metal mermiyi numune tüplerinden birine yerleştirin.Kapağı kapatın ve tüpü kriyojenik öğütücünün tüp tutucusu içine yerleştirin. Hemen, bir dakika için sıvı nitrojen monte tüp tutucu daldırma. Donmuş tüp tutucuyu kriyojenik öğütücünün dış kasetine takın.Ve 30 saniye, 60 kez şiddetle sallayın. Bundan sonra, kriyojenik öğütücü sökmek, metal mermi kaldırın. Ve tüpü önceden soğutulmuş bir numune soğutucusuna yerleştirin.Soğutucuyu 20 derecede 15 dakika saklayın. Daha sonra, tüp ve pipet karıştırmak için% 1 formaldehit 900 mikrolitre ekleyin. Süspansiyonu 900 mikrolitre %1 formaldehit içeren yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın.Daha sonra, 23 santigrat derecede hafif bir dönüş ile 10 dakika süspansiyon düzeltmek. Fiksasyon reaksiyonunu durdurmak için, tüpe 2,5 molar glisin 100 mikrolitre ekleyin. Ve santrifüj 3,000 kat yerçekimi için dört santigrat derecede beş dakika.Bundan sonra, süper supernatant atın. Karıştırmak için tüp ve girdap için PBS bir mililitre ekleyin. Santrifüj 3,000 kat yerçekimi nde beş dakika boyunca dört santigrat derecede.Bu yıkama adımLarını iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, karıştırmak için pelet ve pipet için lysis tampon bir 500 mikrolitre ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 3,000 kat yerçekimini 4 santigrat derecede niçin santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.Karıştırmak için pelet ve girdap bir mililitre lysis tampon iki ekleyin. Daha sonra, süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bundan sonra, karıştırmak için pelet ve pipet proteaz inhibitörü kokteyl ile radyo immünopremasyon asssay tampon 800 mikrolitre ekleyin.Süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Daha sonra, pelet proteaz inhibitörü kokteyl ile RIPA tampon 500 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.Proteaz inhibitörü kokteyli ile bir mililitre RIPA tampon ekleyin. Proteaz inhibitörü kokteyli ile RIPA tamponu ekledikten hemen sonra, bir sonicator tüpü ne lysate aktarın. Ve tüpü ultrasonatöre yerleştirin.Metin protokolünde belirtilen ayarları kullanarak kromatini yayı. Daha sonra, 1.5 mililitre protein düşük bağlayıcı tüp örnek aktarın. Ve 20,000 kat daha fazla yer çekiminde dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Örnekten süpernatant toplayın ve yeni bir protein düşük bağlayıcı tüp aktarın. Bu protokolde tandem kromatin immünopresipitasyon dizilimi tanıtıldı ve gösterilmiştir. İşlem sırasında DNA'nın kalitesi birden fazla adımda test edildi.Sonication hemen sonra, yığılmış DNA izole edildi ve mikroakışkan elektroforez makinesi ile test edildi. Afinite saflaştırma yapmak için anti-FLAG antikor ve anti-H3K3me3 antikor kullanılarak DNA kalitesi tekrar kontrol edildi. H2B-FLAG'de DNA'nın immün arınma özgüllüğü negatif kontrol örnekleri ile doğrulandı.Önemsiz miktarda DNA tespit edildiği yer. Protokolün devamında, sıralama kitaplığı kalitesi doğrulandı. Başarılı ChIP ve T-ChIP, GAPDH geninin promotör bölgesini hedefleyen astarlar kullanılarak zenginleştirme analizi ile kanıtlanmıştır.Üç nöron geni boyunca temsili yeniden dağılımlar elde edildi. Ve tüm beyin T-ChIP arama nöron T-ChIP arama tarafından genlerin beş asal ucunda okuma zenginleştirme gözlenmiştir. Bir stabilite sonra, bu teknik farelerde nöronlarda yaygın olarak hücre tipi özel histon modifikasyonu keşfetmek için epigenetik alanda araştırmacılar için önünü açıyor.Formaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi yaparken her zaman lastik giysi ve gözlük takmak gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.

tchip-seq-cell-type-specific-epigenome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

İn vivo protein-DNA etkileşimlerini haritalama yöntemleri, genomik araştırmanın her yönü için çok önemli hale geliyor, ancak zahmetli, maliyetli ve zaman alıcı. Burada, sınırlı miktarda hücre ile in vivo protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için kromatin immünopresipitasyonunu otomatikleştiren, ticari olarak temin edilebilen bir robotik sıvı işleme sistemi sunulmaktadır.

ChIP-seq Denemeleri otomatikleştirme 10.000 HeLa Hücreleri üzerinde epigenetik Profilleri oluşturmak için

Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Biz (ChIP-seq) metodolojisi sıralı veri kümeleri micrococcal nükleaz (MNase) erişilebilirlik entegre bir nucleosome yoğunluğu ChIP-seq analitik çerçeve için uygun üretimi için sıralama değiştirilmiş yerli Kromatin immunoprecipitation mevcut Histon değişiklik ölçümleri ile.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Bu makalede, ChIP sıvı işleyici platformu kullanılarak belirli bir histone modifikasyonu (H3K27ac) ile ilişkili DNA bölgelerinin yarı otomatik, mikro ölçekli ChIP-Seq protokolü ve ardından etiketleme kullanılarak kütüphane hazırlığı açıklanmaktadır. Prosedür, kalite ve nicelik amaçları için kontrol değerlendirmesini içerir ve diğer histone modifikasyonlarına veya transkripsiyon faktörlerine benimsenebilir.

Büyük Ölçekli Epigenetik Çalışmalar için Yarı Otomatik ChIP-Seq Prosedürü

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Öğrenin, fare nöron hücrelerinde tChIP-Seq kullanarak hücre türüne özgü histon modifikasyonlarını analiz edin. Bu yöntem epigenetik düzenlemeyi keşfetmek için değerli bir protokol sunar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Daha fazla video keşfet