Name: Yalıtım ve bütün domuz pankreas Decellularization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Öğrenin, soğuk sıcaklıklarda deterjan perfüzyonu kullanarak bütün domuz pankreasının diseksiyonu ve hücreden arındırılması yöntemini. Bu teknik, doku mühendisliği uygulamaları için bütün organın sağlam şekilde elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada İsveç hükümeti LUA ALF bir hibe için S.S.H. tarafından finanse edildi

Bir domuz pankreas ve burada sunulan decellularization yordam diseksiyon Göteborg Üniversitesi etik kuralları izleyin.
1. Decellularization Set-up hazırlanması
<ol><li>3 x 5 mm silikon tüpler kullanarak, seride peristalic pompa deterjan giriş kapsayıcı bağlanın ve via degasser org pankreasta için oda (bkz. Şekil 1). Bir erkek radarı tüp organ odasında ücretsiz sonu bağlayın.</li>
	<li>Başka bir 3 x 5 mm silikon tüp kullanarak, organ odası deterjan çıkış konteyner üzerinden için perfused deterjan toplamak için peristaltik pompa bağlayın.</li>
	<li>2 ml etiketlenmemiş pipet deterjan giriş konteyner ve deterjan çıkış cointainer tüplerde ücretsiz biter takın.</li>
	<li>Kendin 4 ° C'de tutmak</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Şekil 1: hazırlık perfüzyon tuzak. 3 x 5 mm silikon tüp kurulum içinde gösterildiği gibi kullanarak, dizide peristaltik pompa, degasser ve organ odası için deterjan giriş kapsayıcı bağlanın. Siyah oklar deterjan giriş kapsayıcı akışı yönünden organ odasına gösterir. Deterjan çıkış, başka bir 3 x 5 mm silikon tüp kullanın ve organ odası üzerinden peristaltik pompa deterjan çıkış kapsayıcı bağlanın. Kırmızı oklar organ odası akışı yönünden deterjan çıkış kapsayıcıya gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
2. Decellularization çözümleri hazırlanması
<ol><li>Çözüm 1 (fosfat tamponlu tuz [PBS]): 8 g (137 mM) sodyum klorür, 0.2 g (2.7 mM) potasyum klorür, 1.44 g (10 mM) sodyum fosfat ve (1.8 mM) potasyum fosfat, 0,24 g 1 litre ultrasaf su ekleyin ve karıştırın eriyene kadar. PH 7.4 hidroklorik asit (HCl) için ayarlayın. Toplamda, bu çözümün 3.2 L gereklidir.</li>
	<li>Çözüm 2 (PBS + heparin): 1 L / çözüm 1, 3,4 mL heparin (17 Uluslararası birimler [IU] /mL) ekleyin. Bu çözüm taze hazırlamak ve soğuk hale gelinceye kadar buz üzerinde tutun. Toplamda, bu çözümün 1,2 L gereklidir.</li>
	<li>Çözüm 3 (Ultrasaf Su + sodyum azid + disodyum ethylenediaminetetraacetic asit [EDTA]): 1 L / Ultrasaf Su, 1.86 g (5 mM) EDTA ve 200 mg (%0.02) sodyum azid eklemek. Tuz eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? Toplamda, bu çözümün 22 L gereklidir.</li>
	<li>Çözüm 4 (PBS + sodyum azid + EDTA): 1 L / çözüm 1, 200 mg sodyum azid (%0.02) ve (5 mm) EDTA 1.86 g ekleyin. Tuz eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? Toplamda, bu çözümün 1 L gereklidir.</li>
	<li>Çözüm 5 (Ultrasaf Su + sodyum azid): için 1 L ultrasaf su ekleyin (%0.02) sodyum azid 200 mg. Tuz eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? Toplamda, bu çözümün 260 M gereklidir. Not: EDTA SDC ile bir çökelti oluşturur ve hemen yıkama SDC işlemden önce ve sonra kullanılacak beri çözüm 5 dışarıda bırakıldı.</li>
	<li>Çözüm 6 (SDC + Triton X-100): 940 mL için Ultrasaf Su, 40 g (% 4) ekleyin. SDC, 60 mL (% 6) Triton X-100, (%0.02) sodyum azid 200 mg ve 69,6 mg (0.4 mM) phenylmethylsulfonyl florür (PMSF). Eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? PMSF kullanmadan önce ekleyin. Toplamda, bu çözümün 9,6 L gereklidir.</li>
	<li>Çözüm 7 (DNaz): DNaz 10.000 Kunitz eklemek birimleri-ı (40 Kunitz adet/mL) Dulbecco'nın PBS CaCl2 ve MgCl2içeren 250 mL. Taze hazırlamak ve hemen kullanın. Çözüm için kullanmadan önce 37 ° C sıcak.</li>
	<li>Çözüm 8 (PBS + sodyum azid): 1 L / çözüm 1, 200 mg (%0.02) sodyum azid ekleyin. Tuz eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? Toplamda, bu çözümün 1 L gereklidir.</li>
</ol>3. domuz pankreas diseksiyon
Not: Bu çalışmada, domuz pancreases üzerinden, heparinized (400 IU/kg) dişi domuzlar bir çiftlik 45 kg ağırlığında euthanized disseke.
<ol><li>Domuz diseksiyon tablo sırtüstü pozisyonda yerleştirin.</li>
	<li>Tüm karın organları açığa bir neşter kullanarak bir ensizyon xiphoidal işleminden kasık kemiğine (yaklaşık 40 cm) için yapmak.</li>
	<li>Dalak bulun, duodenal ve bağlantı loblar.</li>
	<li>Büyük duodenal papilla düzeyini bulun ve sözlü olarak iki ayrı dikiş kullanarak o siteden onikiparmak ligate.</li>
	<li>Aşağı özofagus iki ayrı dikiş ile ligate ve mide almak makas ile bitişik harfler arasında kesti.</li>
	<li>Bağ dokusu bağırsağın ulaşmak için iki nokta üst üste ayırın.</li>
	<li>Pankreas dalak lob için verdiği iki nokta üstüste bağ dokusu ayırın.</li>
	<li>İki nokta üst üste damar birleştirilmesi (ligasyon) sonra ince bağırsak çıkarın.</li>
	<li>İnferior mezenterik ven ve inferior mezenterik arter ağaç bulup pankreas caudally görüntülendiği bir dikiş ile ligate.</li>
	<li>Splenik arter ligate ve dalak Hilus yakın bir dikiş birlikte damar ve klemple dalak kaldırmak için makasla kesti.</li>
	<li>Duodenal ve bağlantı loblar temizlenir ve vasıl belgili tanımlık son iki ayrı dikiş ile duodenum ligate kadar duodenum izleyin.</li>
	<li>Portal ven incelemek, karaciğer üzerinden herhangi bir kan kaçağı önlemek ve proksimale bağ için bir dikiş ile ligate. Portal ven decellularization sırasında bir çıkış gibi hizmet vermektedir.</li>
	<li>İncelemek ve safra kanalını ve iki dikiş ile hepatik arter ligate. Klemple dikiş için kesti.</li>
	<li>Renal ven altında aort bulmak ve pankreas alan ulaşıncaya kadar kas ve bağ dokusu kranial yönde incelemek.</li>
	<li>Pankreas nazikçe çevirin ve SMA ve CT olduğu gibi tutmak aort, incelemek ve CT daha üstün ve makas ile SMA daha aşağı aorta kesti.</li>
	<li>Makasla dokuları çevreleyen kalan kesim ve pankreas çıkar.</li>
	<li>4-mm arteriotomy kanül için bağlı bir 50 mL şırınga kullanarak, organ çözüm 2 ile aort yoluyla tüm organ perfuses kadar veya tüm organ soğuk hale gelinceye kadar temizleme.</li>
</ol>4. Decellularization için domuz pankreas hazırlanması
<ol><li>Pankreas 4 ° C'de veya süreci boyunca buzda tut.</li>
	<li>Makas kullanarak oniki parmak bağırsağı dikiş kesmek, 50-150 mL Ultrasaf Su 25 mL pipet kullanarak temizlenerek temiz o yiyecek ve tekrar dikiş ile ligate.</li>
	<li>Aort bir ucunu ve SMA ve CT yanı sıra tüm dalları kaçağı önlemek için dikiş ile ligate.</li>
	<li>4-mm arteriotomy kanül aort diğer ucunu takın ve dikiş ile ligate.</li>
	<li>Çözüm 3 ile pankreas 20 mL/dk decellularization kurulumu kullanarak 1 h için sıvı. Not: hava kabarcığı yok pankreas girin öyle ki çözüm 3 ile pompa tüpler Prefill. Herhangi bir sızdırmazlık için organ her yönden bakmak ve tüm açık damar dalları ile dikişler, portal ven dışında ligate.</li>
	<li>Çözüm 4-20 ° C'de pankreas decellularization başlayana dondur.</li>
</ol>5. decellularization domuz pankreas
<ol><li>Pankreas 4 ° C'de erimek</li>
	<li>Hiçbir hava kabarcıkları deterjan giriş tüpte görülmektedir kadar peristaltik pompa çözüm 3 ile decellularization set-up 20 mL/dk çalıştırın.</li>
	<li>Pankreas decellularization kapsayıcısına getirin ve deterjan giriş tüp pankreas aort bağlayın. Bir gecede 20 mL/dk 4 ° C'de, çözüm 3 ile perfüzyon tarafından organ yıkama</li>
	<li>Organ odasında yaptı çözüm dökmek.</li>
	<li>Çözüm 3 çözüm 5 ile değiştirin ve pankreas 20 mL/dk 4 ° C'de 30 dk için sıvı Organ odası çözümde dökmek.</li>
	<li>Çözüm 6 eklemek ve pankreas 20 mL/dk 4 ° C'de 8 h için sıvı Organ odası çözümde dökmek.</li>
	<li>20 mL/dk 4 ° C'de 96 h için çözüm 5 ile perfüzyon tarafından organ yıkama Organ odası çözümde dökmek.</li>
	<li>Dulbecco'nın PBS CaCl2 ve 37 ° C'de 30 dk için MgCl2 içeren 500 mL sirkülasyon tarafından DNaz tedavisinde pankreas hazırlamak Organ odası çözümde dökmek.</li>
	<li>Çözüm 7 250 mL ekleyin ve pankreas 37 ° C'de 20 mL/dk 4 h için sıvı Organ odası çözümde dökmek.</li>
	<li>20 mL/dk 4 ° C'de 120 h için çözüm 5 ile perfüzyon tarafından organ yıkama</li>
	<li>Org çözüm 8'kısa bir süre için 4 ° C'de veya uzun süre-20 ° C'de depolayın.</li>
</ol>6. Decellularization doğrulanması
<ol><li>Makas kullanarak, 3 - 10 mm biyopsi pankreasın bütün loblar üzerinden kesmek ve onları formaldehit oda sıcaklığında 48 h için düzeltin.</li>
	<li>Ultrasaf Su 15dk için parçaları yıkayın, onları standart protokolleri takip bir doku işlemcide süreci ve parafin içinde katıştırabilirsiniz.</li>
	<li>5-µm bölümleri Microtome kullanarak kesin ve onları standart protokolleri takip Meyer Hematoksilen ve % 0,2 alkollü eozin tarafından (o) leke.</li>
	<li>Çekirdek kaybı için kontrol etmek için hafif bir mikroskop altında slaytları görüntülemek. Not: Aynı şekilde işlenmiş bir taze doku bir parça bir denetim olarak çekirdek varlığı için kontrol etmek için kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Federation, I. D. IDF Diabetes Atlas. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetesatlas.org">http://www.diabetesatlas.org</a> (2016).</li>
<li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+Decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+metazoan+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of metazoan extracellular matrix.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).</li>
<li>Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+cellularization+strategies+for+tissue+engineering+of+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43(2015).</li>
<li>Goh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+pancreas+as+a+natural+3D+scaffold+for+pancreatic+tissue+and+whole+organ+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering.</a> Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Culture+of+MIN-6+Cells+on+Decellularized+Pancreatic+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+and+In+Vivo+Study.+Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold.</a> In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645(2015).</li>
<li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Pancreas+as+a+Source+of+Protolerogenic+Extracellular+Matrix+Scaffold+for+a+New-generation+Bioartificial+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas.</a> Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).</li>
<li>Mirmalek-Sani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+pancreas+extracellular+matrix+as+a+platform+for+endocrine+pancreas+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering.</a> Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).</li>
<li>Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+from+juvenile+porcine+pancreas+after+24-h+hypothermic+machine+perfusion+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation.</a> Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).</li>
<li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145(2017).</li>
<li>Gilpin, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+Strategies+for+Regenerative+Medicine%3A+From+Processing+Techniques+to+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications.</a> Biomed Research International. 2017, 9831534(2017).</li>
<li>James, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+protease+inhibitor+phenylmethylsulfonyl+fluoride+in+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers.</a> Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).</li>
<li>Lichstein, H. C., Soule, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Effect+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth+and+Respiration%3A+I.+The+Action+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth.</a> Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).</li>
</ol>

S.S.H., Verigraft, kan damarı doku mühendisliği teknoloji lisanslı bir şirket hisse tutar. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.

Perfüzyon SDC ve Triton X-100 4 ° C'de kullanarak önerilen protokolünü bütün domuz pankreas başarıyla decellularize. Bu teknikte bir organ sıvı için parankimi ve onun sağlama gemiler gibi örnek diğer vasküler dallarında ligasyonu zarar vermeden üç loblar içeren sağlam pankreas diseksiyon mücadeledir sızıntı. Domuz pankreas farklı bir anatomi insan pankreas karşılaştırıldığında vardır. Bu üç lobları oluşur ve ince bağırsak ile yakın temas içinde kısmen çevresindeki tarafından kalır. Birkaç küçük kan damarlarının pankreas gelen bağırsak bağlandıkça ile birlikte pankreas, oniki parmak bağırsağı kesmiştim. En iyi duruma getirme çalışmaları sırasında bu kan damarlarının künt kesim kaçağı ve çözümleri eksik bir perfüzyon göstermiştir.
Pankreas çölyak ve superior mezenterik arter aracılığıyla aortaya bağlandığı beri perfüzyon yalnızca bir kanül ve bu nedenle, bir giriş kullanarak basit tutmak için bir giriş olarak aort seçtik. Bizim deneyim, ligasyonu CT yukarıda ve aşağıda SMA aort diseksiyonu zaman azalır ve herhangi bir iki gemi zarar riskini azaltır. Heparinized domuz ek olarak, ayrıca perfüzyon çözümleri organ boyunca ulaşmada bir perfüzyon soğuk heparin ile aort diseksiyon hemen sonra yardımcı olduğunu fark ettim. Bu kan damarlarında kan pıhtı oluşumunu engelleyerek ortaya çıkar spekülasyon. Bir pankreas Ultrasaf Su ile ilk perfüzyon diseksiyon sonra kırmızı kan hücreleri parçalayıcı ve böylece kan pıhtı oluşumunu engelleyerek organ kan kalıntıları kaldırın. Kan akışını kolayca arka plan üstüne fark gibi bu dönemde de damarları ve arterler, unligated herhangi bir küçük dalları bulmak için kullanılabilir.
Bu eylem pankreas ekzokrin hücrelerden serbest ekzokrin enzimlerin engel olacak kadar soğuk sıcaklıklarda (4 ° C), tüm decellularization yordam tutmak seçti. Hücre zarları ve proteinler12sindirmek olabilir gibi inhibe değil zaman ekzokrin enzimler hücre ve ECM üzerinde zararlı bir etkisi neden olabilir. Dondurma ve çözme etkili hücreleri patlama gibi biz bir donma/çözülme adım başlangıçta bile deterjanlar4,13perfüzyon önce dahil. Çözdürme sonra ilk yıkama hücre patlamaları kalıntıları çıkarmak. Biz kullanılan deterjan tedavi SDC ve Triton X-100 normalden daha yüksek konsantrasyonlarda ve yüksek perfüzyon hızda bir karışımıdır. ECM zarar ekzokrin hücreleri kaldırarak daha hızlı decellularization elde etmek için bu yaklaşım seçtik. Biz daha az zaman-ecek var olmak elde edilebilir Pankreas enzimleri böylece iyi ECM bileşenleri koruyarak ECM ile etkileşim için gibi sert ve hızlı bir iletişim kuralı pankreas decellularization için faydalıdır spekülasyon. Bu enzimlerin ekzokrin hücreleri14--dan serbest bırakmak belgili tanımlık harekete geçirmek yapılmasını engeller olarak ECM bileşenleri korumak için biz de serin proteaz inhibitörü (PMSF) deterjan çözümler ekledi. Böylece inhibe bakteriyel kontaminasyon15şansı bir bakteriyostatik ajan olarak eylemler olarak sodyum azid tüm decellularization çözümleri, eklenir.
Pankreas ECM yapıları ve ECM protein kollajen ve elastin korunması gösterdi bu protokol sonrası decellularized. Ancak, önemli bir glikozaminoglikan kaybına decellularized pankreasta fark edildi. Pankreas da insan cenin pankreas kök hücreleri ekler ve ekzokrin ve endokrin işaretleri ifade için için 14 gün12recellularized parçalar halinde vaat Bu şekilde decellularized. Ancak, bir sağlam ve işler durumda pankreas oluşturmak için daha fazla araştırma doğru hücre kaynakları, hücre tipleri, hücre tohumlama stratejileri ve biyoreaktör kültür değerlendirilmesinde gereklidir.

Diabetes mellitus, kan glikoz düzeyinin varlığı ile karakterizedir. Çoğu ülkeler1büyük halk sağlığı meydan okuma olarak kabul edilmektedir. Kan glikoz düzeyi yüksek kan damarları ve sinir sistemi, göz, kalp ve böbrekler ve ekstremite iskemi zarar etkiler. Tedavi geleneksel yöntemlerle enjeksiyonları eksojen insülin, uyuşturucu ve yaşam tarzı değişiklikleri içerir. Bazı durumlarda hastalık için bir çare bir kenara koyarak, mevcut tedaviler insülin hiperglisemi sonuçlanan terapötik düzeyde korumak başarısız. Adacıkları veya tüm pankreas nakli hastalık ortadan kaldırır, ancak sık uygun donör organ sıkıntısı ve riskleri ve immünosupresyon ve encapsulation2ilgili zorluklar yüzünden yapıldığını değil.
Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında güncel gelişmeler bu sorunlar için bir çözüm sağlamak için kapasitesine sahip. Decellularization teknikle, bir insan ya da hayvan donör hücresel malzemeden önemli hücre dışı matriks (ECM) proteinler, büyüme faktörleri, kaldırılabilir ve sinyal molekülleri iskele içinde korunur. Böyle iskele potansiyel immünosupresyon organ fonksiyon ile belgili tanımlık recipientâ €™ s sigara immünojenik kök hücre3,4recellularization sonra geri yüklemek için gerek kalmadan nakledilen. Büyük hücre dışı matriks proteinleri türleri arasında korunmuş ve nakli5sonra reddedilmiş değil gibi allojenik veya xenogeneic kaynaklardan doku mühendisliği organları klinik ekimi, kullanılabilir.
Decellularization fiziksel güçleri, kimyasal deterjan ve enzimler fizyolojik bir ortamda bir doku veya organ hücreleri ve nükleer malzeme kaldırmak için optimum kullanımını içeren iyi keşfedilmiş bir yöntemdir. Recellularization hücre geri acellular organ tohum bir işlemdir. Kültür organ, sıcaklık, basınç ve gazlar6gibi fizyolojik açıdan kabul edilebilir koşulları için çok sayıda hücre, optimum hücre tohum strateji ve bir biyoreaktör sistem gerektiren entelektüel zor bir işlemdir.
Pankreas ekzokrin ve endokrin kapasiteleri nedeniyle zorlu bir doku doku mühendisliği için kabul edilebilir. Endokrin bölümü salgılar hormon insülin de dahil olmak üzere, süre ekzokrin doku birkaç sindirim enzimleri salgılar. Fare7,8, insan9ve domuz10 sağlam pancreases decellularization enzimler (tripsin, deoksiribonükleaz [DNaz]) kullanarak zaten bildirilmiştir ve non-iyonik (Triton X-100) ve iyonik deterjanlar ( Sodyum deoxycholate [SDC] ve Sodyum Lauryl Sülfat [SDS]). Ancak, yayımlanmış protokolleri, biz başarılı diseksiyon ve tam perfüzyon ve ECM yapısını koruyarak decellularization ile mücadele etti. Biz decellularization sırasında uygulanan deterjanlar hücre lizis neden böylece organ sindirim enzimleri serbest ileri sürüldü. Yayımlanan enzimler ECM iskele geri dönüşü olmayan bir zarar ve decellularization ve recellularization için verimli olun. Etkili eylem sindirim enzimleri inhibe ederken pankreas decellularizes yöntemi bir tasarım sorunu çözebilir. Onlar soğuk sıcaklık kullanılan9neden olduğunu bildirmedi, ancak biz Peloso vd., decellularization soğuk sıcaklık, pankreas, strateji seçti. Aynı zamanda, biz aort perfüzyon giriş Çölyak gövde (CT) ve superior mezenterik arter (SMA)11üzerinde seçerek bir diseksiyon strateji Taylor ve ark. bazı değişiklikleri ile tasarlanmıştır.
Kısa bir süre önce madde12içinde etkili yalıtım ve bazı ECM bileşenleri koruyarak süre domuz pankreas, decellularization için bir yöntemi göstermektedir. Bu gazetede, dalak, duodenal içeren bir bütün domuz pankreas teşrih ve bağlantı loblar ayrıntılı bir açıklama göster ve başarılı decellularization için kademeli bir iletişim kuralı mevcut.

<table><tbody><tr><td>4mm DLP arteriyotomi kanülü</td><td>Medtronic</td><td>31104</td><td></td></tr><tr><td>2ml Etiketsiz pipet</td><td>vWR</td><td>612-3720</td><td></td></tr><tr><td>Gaz Giderici</td><td>Biotech AB</td><td>0001-6484</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun CaCl2 ve MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td> <td>ile PBS'si</td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu dihidrat</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161. </td><td></td>OB</tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Luer Erkek 1/8 "ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>3X5mm silikon tüp için</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Oina</td><td>SP-1X4</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10837091001</td><td>Sulu çözeltide kararsız. Perfüzyondan önce taze olarak eklenmelidir.</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidrojen fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>SDC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Silikon tüp 3X5mm</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen fosfat</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Sütür</td><td>V&ouml; mel</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Syrringe 50mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046. İn</td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım ve bütün domuz pankreas decellularization

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Doku mühendisliği tüm pankreas diyabet için mevcut tedaviler artırır. Doku mühendisi pankreas için insan hücreleri ile allojenik veya xenogeneic kaynağından amacıdır. Yöntemleri verimli diseksiyon, decellularization ve domuz pankreas recellularization için bir gösteri alanı yarar olabilir. İnsan pancreases benzer-e doğru domuz pancreases üç lob ile özel bir anatomik düzenleme var (dalak, duodenal ve bağlantı) oniki parmak bağırsağı ve ince bağırsak tarafından yuvarlanır. Pankreasın duodenal lob duodenum için birkaç küçük kan damarlarının tarafından bağlanır. Doku mühendisliği pankreasın ekzokrin ve endokrin doğası nedeniyle karmaşıktır. Bu yazıda, bütün domuz pankreas teşrih ve deterjanlar ile onun yapısı ve bazı hücre dışı matriks bileşenlerinin kaydedilirken decellularize için detaylı bir protokol gösteriyoruz. Aort damarı tam perfüzyon elde etmek için giriş ve çıkış olarak portal ven olarak seçilir. Diğer kan damarları (hepatik arter, splenik ven, splenik arter, mezenterik arter ve ven ağacı) ve safra kanalını bakmaksızın. Domuz trombüsü oluşumunu önlemek için heparinized ve hemen sonra diseksiyon, org ile soğuk heparin temizlendi. Eylem ekzokrin enzim inhibe, pankreas decellularization 4 ° C'de ayarlanır Decellularization perfüzyon Triton X-100, sodyum deoxycholate ve aralıklı ve son kapsamlı çamaşır ile deoksiribonükleaz tarafından gerçekleştirilir. Başarılı bir decellularization ile pankreas beyaz görünür ve korunmuş hücre dışı matriks yapısı ile çekirdeği bir yokluğu hematoksilen eozin ile histolojik değerlendirme gösterir. Böylece, önerilen yöntem başarılı bir şekilde incelemek ve bütün domuz pankreas decellularize için kullanılabilir.

Temsilcisi domuz pankreas diseksiyon resimler, hangi-ebilmek yardım etmek içinde bulma ve inferior mezenterik arter anatomi ve ağaç, portal ven, hepatik arter, safra kanalını ve CT ve SMA dallanma aort damar, Şekil 2Agösterilir, 2Bve 2 C (oklar, sırasıyla sarı). Şekil 3A normal pankreas, brüt morfolojisi gösterir hafif pembe görüntülendiği ve dalak, içeren bağlantı ve duodenal loblar. Decellularization sonra pembe renk kaybolur ve decellularized pankreas soluk beyaz renkte görünüyor. Dalak gösteren brüt morfoloji resim bağlantı ve duodenal decellularized pankreas lobları Şekil 3B' gösterilir. Şekil 3 c o ile boyama tarafından normal bir pankreas birçok mavi çekirdeği varlığını gösterir. Decellularized pankreasta, çekirdekleri, bir kaybı yok Mavi çekirdeği görülen gösterdi boyama o (şekil 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> Resim 2: bir domuz pankreas diseksiyon resimlerini. İnferior mezenterik arter ve ven ağaç (sarı ok)(a)konumu. (B) ligasyonu portal ven, hepatik arter ve safra kanalını (sarı ok). (C) aort Çölyak gövde ve superior mezenterik arter (sarı ok) dallanma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> Şekil 3: brüt Morfoloji ve o normal ve decellularized pancreases boyama. (A)normal pankreas brüt morfolojisi. (B) decellularized pankreas brüt morfolojisi. (C) o boyama Mavi çekirdeği varlığı normal pankreasta gösterir. (D) o boyama Mavi çekirdeği yokluğu decellularized pankreasta gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Doku mühendisliği tüm pankreasın ekzokrin ve endokrin fonksiyonları nedeniyle bir mücadeledir. Biz sağlam bir domuz pankreas ve deterjanlar Triton X-100 perfüzyon tarafından başarılı decellularization sürecinin, sodyum deoxycholate ve deoksiribonükleaz diseksiyon için bir yöntemi gösterir.

Yalıtım ve bütün domuz pankreas Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Bu yöntem, soğuk sıcaklıklarda deterjanperfüzyon yoluyla bağlantı, duodenal ve dalak lobları içeren domuz pankreas diseksiyonu ve nihai desellüleriçin kullanılabilir. Decellularization Bu yöntem domuz pankreas içine fikir sağlar rağmen, aynı zamanda diğer büyük hayvanlardan pankreata uygulanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, daha fazla doku mühendisliği uygulamaları için, pankreas gibi karmaşık bir organ, bozulmamış alma kolaylaştırır olmasıdır.Genel olarak, bireyler bu yönteme yeni, onlar tespit ederken bozulmamış pankreas diseksiyon ve çevredeki kan damarlarının tüm ligating master pratik bir sürü gerektirir çünkü mücadele edecek. İşleme başlamadan önce, deterjan kabını peristaltik pompaya bağlamak için üçe beş milimetrelik bir silikon tüp ve peristaltik pompayı gaz giderici aracılığıyla organ odasına bağlamak için ikinci bir üç ila beş milimetrelik silikon tüp kullanın. İkinci tüpün serbest ucuna bir erkek Luer bağlayın ve peristaltik pompa ile deterjan toplama kabına organ odası bağlamak için üçüncü bir üç beş milimetrelik silikon tüp kullanın.Son olarak, deterjan kabındaki tüplerin ve deterjan toplama kabının serbest uçlarına iki milimetrelik etiketsiz pipet bağlayın. Sonra, hücre dışılaştırma kurulumunu dört santigrat dereceye yerleştirin. Pankreas hasat için, bir heparinized yerleştirin, 45 kilogram, supine pozisyonda bir diseksiyon masası üzerine dişi domuz, ve karın organları ortaya çıkarmak için kasık kemiği için ksifoid sürecinden 40 santimetrelik orta insizyon yapmak için bir neşter kullanın.Dalak, duodenal ve bağlantı loblarını tanımladıktan sonra, büyük duodenal papillayı bulun ve duodenumu siteden sözlü olarak çıkarmak için iki ayrı dikiş kullanın. Ek dikişler ile inferior yemek borusu ligate, ve mide kaldırılmasını kolaylaştırmak için makas ile ligatürler arasında kesilmiş. İnce bağırsak ulaşmak için kolon bağ dokuları ayırın, ve pankreas dalak splenik lob bağlı kolonun bağ dokusu.İnce bağırsaklar dalak lob bağ dokusu ile pankreas bağlı, ama aynı zamanda pankreas çevreleyen. Dikkatle detangle ve bağırsak ve pankreas arasında bağ dokusu ayırmak için bağırsak yolunu takip etmek zorunda. Arterler ligating sonra, ince bağırsak kolon kaldırmak.Inferior mezenterik ven tanımlayın, inferior mezenterik arter ağacı, ve pankreas için bir dikiş caudal ile damarları ligate ve makas ile kesilmiş. Hilum birlikte dalak arter ve ven ligate, dalak yakın, ve dalak kaldırmak için makas ile distal kesti. Duodenal ve bağlantı lobları temizlenene kadar duodenum izleyin ve iki ayrı dikiş ile sonunda duodenum ligate.Bağlantı ve duodenal loblar ile yakın temas duodenum parçası pankreas ile kaldırılır, iki organ arasındaki tüm küçük kan damarlarının ligasyonu çok zor olduğu gibi. Portal ven diseksiyon sonra, karaciğerden herhangi bir kan sızıntısını önlemek için bir dikiş ile damar ligate, ve incelemek ve iki dikiş ile safra kanalı ve hepatik arter ligate. Sonra, portal ven, hepatik arter ve makas ile safra kanalı kesti.Böbrek ven altında aort bulun ve damar pankreas ulaşana kadar kas ve bağ dokusundan kranial yönde aort incelemek. Şimdi, pankreası yavaşça ters çevirin ve aortu inceleyin, üstün mezenterik arteri ve çölyak gövdesini sağlam tutarak. Çölyak gövdesine aort kranial kesin ve pankreas hasat sağlamak için kalan çevre doku künt incelemek.Daha sonra, tüm organ perfüzyon veya tüm organ soğuyana kadar çözelti iki ile aort yoluyla organ floş dört milimetrelik arteriyotomi kanül bağlı bir 50 mililitrelik şırınga kullanın. Çözeltiyi buz üzerinde metal bir tepsiüzerine iki perfüzyon pankreas yerleştirin, aort yukarı bakacak şekilde, ve duodenum dikişleri kesmek için makas kullanın. Duodenumu 50 ila 150 mililitre ultra saf suyla yıkamak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın ve tkuyu taze dikişlerle yeniden temizleyin.Aort bir ucunu ve tüm dalları ligate, superior mezenterik arter ve çölyak gövde hariç, sızıntıyı önlemek için, ve aort diğer ucuna dört milimetrelik arteriyotomi kanül eklemek. Sonra, organ odasına pankreas yerleştirin ve bir erkek Luer pankreas kanül bağlayın. Sonra, dakikada 20 mililitre bir saat için solüsyon üç pankreas perfuse, ve decellularization başlayana kadar çözelti dört eksi 20 derece santigrat çift perfüzyon pankreas dondurun.Hücredışılaştırma nın başladığı gün, pankreası dört santigrat derecede eritin ve çözülmüş pankreası hücredışı organ odasına yerleştirin. Pankreas aort deterjan giriş tüpü bağlayın, ve dört derece santigrat gecede dakikada 20 mililitre çözelti üç ile pankreas yıkayın. Ertesi sabah, organ odasında kalan herhangi bir çözeltide, ve pankreası dakikada 20 mililitrede 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede çözelti beşte perfüzyon.Çözelti beş perfüzyon sonunda, çözelti altı ve dört derece santigrat dakikada 20 mililitre sekiz saat pankreas perfuse, dakikada 20 mililitre ve dört derece Santigrat taze çözelti beş bir 96 saatlik yıkama izledi. Yıkamayı 37 santigrat derecede 30 dakika kalsiyum ve magnezyum la takviye 500 mililitre DPBS ile değiştirin, ardından perfüzyon 250 mililitre çözelti yedi ile dört saat boyunca dakikada 20 mililitre ve 37 santigrat derece. Daha sonra, dakikada 20 mililitre ve dört santigrat derece taze çözelti beş ile başka bir 120 saat boyunca organ yıkayın ve çözelti sekiz organ saklayın.Burada, açık pembe görünen ve dalak, bağlantı ve duodenal loblar içeren normal bir pankreasın brüt morfolojisi görülebilir. Hücredışılaştırma dan sonra, pembe renk kaybolur, ve işlenmiş pankreas renk soluk beyaz görünür. Normal bir pankreasta, birçok mavi çekirdekH ve E boyama ile belirgindir, bir decellularized pankreas çekirdekleri artık görselleştirilebilir ise, onların kaybını doğrulayan.İzole bozulmamış domuz pankreas, Bu prosedürü takip, bu yapıyı koruyarak ve aynı zamanda bazı ekstrasellüler matriks proteinlerelde edilmesine izin verirken tam bir perfüzyon ve başarılı desellülerizasyon sağlayacaktır. Desellize pankreas ilgili hücre tipleri ile biyoreaktör sistemlerinde tüm organ recellularization stratejileri geliştirmek için kullanılabilir. Alıcı kök hücreler ile recellularization sonra, doku mühendisliği pankreas klinik uygulamalar ve ilaç testi için kullanılabilir.Triton X-100 ve SDC ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven takmak ve duman kaputu altında çözümler hazırlamak gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

isolation-and-decellularization-of-a-whole-porcine-pancreas

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Bu videoda, çeşitli sindirim enzimleri içeren pankreas asiner hücrelerini (ekzokrin hücreler) izole etmek için kullanılan teknik açıklanmaktadır. Primer asiner hücreler, pankreas kanseri gelişiminde erken bir olay olan asinar-duktal metaplazinin (ADM) ex vivo çalışmasında faydalıdır.

Primer Acinar Hücre İzolasyonu: Acinar Hücreleri Fare Pankreasından İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Langerhans Adacıkları olarak da adlandırılan pankreas adacıkları, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik işlevler için hormonlar üreten bir endokrin hücre kümesidir. Bu protokol, ekzokrin pankreas dokusunu sindirmek için önce Ampulla of Vater yoluyla kollajenaz perfüze ederek pankreas adacıklarını izole etmek için bir yöntemi ve adacıkları farelerden saflaştırmak için basitleştirilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüjünü açıklar.

Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Hücre dışı matriks (dECM) tasarlanmış bir yapıda hedef dokuların doğal işlevlerini yeniden özetlemek için uygun mikroçevresel ipuçları sağlayabilir. Bu makalede pankreas dokusunun desellülsizasyonu için protokoller açıklanmıştır, pankreas dokusu kaynaklı dECM bioink decm dECM değerlendirilmesi, ve 3D pankreas dokusu üretimi bir biyobaskı tekniği kullanılarak inşa eder.

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

Bu protokol, adacık izolasyonu ve saflaştırılması için bir domuz pankreasının satın alınması için adım adım bir kılavuz sağlar.

Adacık izolasyonu için domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve izolasyonu

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Perfüzyon decellularization organ ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mikromimarisini korur tüm karaciğer iskeleleri üretmek için yeni bir tekniktir. Burada, hepatositler ile perfüzyon decellularization ve sonraki repopulation kullanarak tüm organı iskeleleri hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Fonksiyonel ve transplante karaciğer greft tekniği kullanılarak oluşturulabilir.

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

Öğrenin, soğuk sıcaklıklarda deterjan perfüzyonu kullanarak bütün domuz pankreasının diseksiyonu ve hücreden arındırılması yöntemini. Bu teknik, doku mühendisliği uygulamaları için bütün organın sağlam şekilde elde edilmesini sağlar.

Yalıtım ve bütün domuz pankreas Decellularization

Daha fazla video keşfet