Name: Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin anaerobik protein saflaştırma ve oksijen elektrodu ile kinetik analiz yöntemini. DesB dioxygenase enzimi kullanılarak oksijen hassasiyetli proteinlerin stabilitesi ve aktivitesi incelenmektedir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Camille Dr.Keller Wesleyan Üniversitesi Teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Anaerobik protein saflaştırma yöntemleri ve bir O2 kullanımı ile ilgili onların tavsiye için özel Profesör Lindsay D. Eltis ve Jenna K. Capyk British Columbia Üniversitesi gibi Christian Whitman Austin, Texas Üniversitesi teşekkür -hassas elektrot.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çıkar çatışması var.

Aktif, saf DesB protein almak üzere kritik adımlar oluşturan ve enzim azaltılmış Fe(II) aktif sitesinin bakımı içerir. Bu nedenle, indüksiyon, arıtma, konsantrasyon performansını düzeltmek ve desalting adımları başarıyla etkin enzim elde etmek için gereklidir. Protein ifade 1 mM demir amonyum sülfat huzurunda inducing Fe(II) doğru DesB aktif dahil sağlar. Bu yöntem genellikle metal uygun katlama izin vermek için büyüme ortamına ilavesi ve tam doluluk sitesi6,41<s...

Demir veya oksijen etkinleştirmek için diğer metaller enzimlerin kez onların kaldırılması nedeniyle azalan bakiyeli bir hücre ortamından inactivation arıtma işlemi sırasında yatkındır. Bu nedenle, bu proteinler hücre lysates kullanılması gerekir, dış azalan bakiyeli acentelere tabi veya anaerobik en uygun enzimatik aktivite1,2,3,4olması için saf. Çoğu bu enzimler için oksijen anaerobik koruyarak tüm arıtma ve karakterizasyonu adımları gerçekleştirme duyarlı (enzimler) özellikle demir içeren, tam olarak onları tanımlamak gereklidir. Bu araştırmacılar tüm Laboratuvar set-up anaerobik salonları protein ifade ile kristalografisi5,6,7,8 arasında değişen çalışmaları için sınırları içinde geliştirmek için neden olmuştur .
Burada, biz yöntemleri anaerobik arıtma ve enzim bir oksijen elektrot sistemi kullanarak DesB kinetik karakterizasyonu için rapor. DesB gallat dioxygenase bakteri Sphingobium sp. zorlanma LigAB, protocatecuate dioxygenase aynı organizmadan ilgili SYK-6 dan var. Her iki enzim olan kapsamlı tarihi9, kısmen ne zaman standart aerobik kullanarak saf inactivation için duyarlı olmak bu süper enzimler nedeniyle büyük olasılıkla araştırılmamıştır tip II protocatechuate dioxygenase (PCAD) süper ait protein saflaştırma yöntemleri. Süre diğer substrat özel2,10, are biraz PCAD enzim substrat karışıklık göstermek bu yana daha fazla bu süper karakterizasyonu özgüllük belirleyicileri tanımlamak gereklidir. Birkaç enzim superfamilies11,12,13,14,15' te gözlemlediği gibi küçük moleküller ile doğrudan rekabet inhibisyon aktivitesi veya bağlama alter molekülleri artışa neden olmaktadır allosteric cepler ayırmak veya enzimatik aktivite16azaltmak için. Kinetik yalnız bir modülatör ciltleme konumu ayırt edemez, bir etkinlik değişikliğin büyüklüğünü belirleme etkileri anlamak için önemlidir. Yerli DesB etkinliği ve faaliyete 4-nitrocatechol (4NC), karakterize ve dioxygenase enzimler2,17, inhibe için yaygın olarak kullanılan bir bileşik huzurunda kinetik karakterizasyonu böyle, yöntemleri 18, gösterilir.
DesB gallat, bir lignin elde edilen aromatik bileşik yolu ile extradiol dioxygenase (EDO) reaksiyon hangi ringde oksijen yüzeylerde10,19biri olarak kullanarak açılış katalizlenir yıkmak yapabiliyor. Bu enzimatik reaksiyon bir aromatik heteropolymer bitkiler hücre duvarında bulunan lignin, dağılımı bağlamında oluşur. Lignin depolymerized, aromatik bileşikler çeşitli verimli daha fazla merkezi metabolitleri3,20,21,22,23,24 bölünebilir ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) bir halka dihydroxylated aromatik bileşikler, bölünme bitişik metal koordine diol oluştuğu bir tepki açılış katalizler; Buna ek olarak, intradiol dioxygenases iki hidroksil grubu (Şekil 1) benzer aromatik bileşikler ayırmak. EDOs, birçok diğer metaloenzimlerde gibi bir iki-histidin, bir-karboksilat Triad'ın9,34,35oluşan koordinasyon Fe(II) için bir divalent metal merkezi var. Enzim etkin olmayan2,36,37,38işlenir, ancak bu metaloenzimlerde, autoxidation veya inactivation mekanizması tabanlı, okside olur.
Bu el yazması açıklanan deneysel yordamlar, biz DesB, PCAD süper gallat (Şekil 2A) C4-C5 bağ arasında oksijen eklenmesiyle katalizler için bakteri Sphingobium sp. SYK-6, üzerinden bir üyesi kullanmaktadır. Bu dekolte regiochemistry bir protocatechuate-4, 5-dioxygenase (Şekil 2B) olduğu LigAB için benzerdir. Şimdiye kadar bu gallat dioxygenase araştırmalar hiçbir rapor DesB10,19,39inhibe bileşikleri içerir. Anaerobik yöntemlerin kullanımı ile biz sürekli tekrarlanabilir aktivite ile protein almak mümkün iken Aerobik arıtma yöntemleri kullanımı ile değişken etkinlik, DesB sergiledi. Burada açıklanan kinetik çalışmalar DesB, DesB gallat ile reaksiyon ve DesB inhibisyonu 4-nitrocatechol (4NC) tarafından kinetik karakterizasyonu anaerobik arıtma için yöntemleri gösterir.

<table><tbody><tr><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranodaz</td><td>Altın Biyo Teknolojileri</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>%30 Akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N'tetrametil-etilendiamin</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Amiloz Reçine Yüksek Akışlı</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) yetkili Escherichia coli hücreleri</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>gallik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-nitrokatekol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>Demir amonyum sülfat</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum ditiyonit</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>buğday serum şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Acrodisc PF Şırınga Filtresi, Supor Membranlı</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Amicon Karıştırılmış Hücre Konsantratörü</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa kesme rekonsiyonu selüloz membran filtre</td><td>EMD Millipore PLGC07610</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 kaba tuz giderme gal kolonu</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Sıkmalı</td><td>Üst Şişeler Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus Elektrot Kontrol Ünitesi</td><td>Hansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen Eletrode Odası</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot Diski</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0,0125 mmX25mm) 30m makara</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot temizleme Kiti</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>Ara kağıt</td><td>Zig Zag</td><td>herhangi bir benzin istasyonunda</td><td></td>mevcuttur</tr><tr><td>He-serisi Dri-Lab torpido gözü</td><td>Vakum/Atmosfer Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>Vakum/Atmosfer Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift Uçlu Mikro Konik Paslanmaz Çelik Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Yaşam Bilimleri Kimble Kontes Flex Sütun Ekonomi Sütunu</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 & mu; L, Model 701 N SYR, Çimentolu NDL 26s GA, 2 inç, nokta STLYE 2 şırınga</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Yaşam Bilimleri Kimble Kontes Flex Sütun Ekonomi Sütunu</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 yüksek basınçlı homojenizatör</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-PER Komple Bakteriyel Protein Ekstraksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası beyazından lizozim</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>ampisilin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris hidroklorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Maltoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobik protein saflaştırma ve desb dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik analizi

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oksijen duyarlı proteinler, oksijen bir substrat olarak kullanan bu enzimler de dahil olmak üzere geleneksel Aerobik arıtma yöntemleri kullanarak saf zaman istikrar azaltılabilir. Bu makale tamponlar ve reaktifler, sütun Kromatografi için yöntemleri hazırlanması bir torpido ve kinetik önce protein desalting Anaerobik arıtma işlemi, ilgili teknik ayrıntılar gösterir. Ayrıca açıklanan hazırlama ve oksijen kullanan enzim kinetik karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir oksijen elektrot kullanarak yöntemlerdir. Bu yöntemler dioxygenase enzim DesB, bakteri Sphingobium sp. zorlanma SYK-6 dan gallat dioxygenase kullanarak gösterilmiştir.

Gösterilen SDS-sayfa jel saflaştırılması maltoz DesB bağlayıcı protein (MBP) füzyon yapı (Şekil 3) üzerinden bireysel kesirler analizidir. Jel protein saf olduğunu ortaya koymaktadır (MW 91.22 kDa =), DesB varlığı dışında (MW 49.22 kDa =) ve MBP protein etki alanı (42 kDa) birbirinden i ciddi. Kesirler E2 ve E3 konsantrasyonu (adım 4.2) için seçildi.
DesB kinetik deneyleri tekrarlanabilir sonuçlar d...

Burada anaerobik protein saflaştırma, anaerobik protein konsantrasyonu ve bir oksijen elektrot sistemi kullanarak sonraki kinetik karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntem enzim DesB, daha istikrarlı ve etkin saflaştırılmış ve anaerobik bir ortamda bir dioxygenase enzim kullanarak gösterilmiştir.

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Bu yöntem, oksijene duyarlı metaller içeren proteinlerde enzim aktivitesinin nasıl sürdürülür hakkında, alan inorganik biyokimya önemli soruları cevaplamak için tasarlanmıştır. Bu tekniğin en büyük avantajı, bir proteinin metalini azaltılmış durumda tutmanın yollarını görselleştirmenize yardımcı olmasıdır. Genel olarak, bu teknik yeni bireyler tamamen anaerobik olmak malzeme ve reaktifler korumak zordur çünkü mücadele edecek.Protein ekspresyonunu indükledikten 24 saat sonra, hücreleri santrifüj le toplayın ve 1,5 litre büyüme başına 20 mililitre amilose sütun tamponunda bakteri hücresi peletini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna bir miligram lysozyme ekleyin ve hücreleri 20 dakika buzüzerinde karıştırın. Kuluçka sonunda, yaklaşık 15,000 psi üç ila beş geçer ile yüksek basınçlı homojenizasyon yoluyla resuspended hücre çözeltisi lyse ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüpü protein transferi.Bir dakika boyunca azot ile headspace floş ve çözünmez enkaz kaldırmak için hücre lisat santrifüj. Supernatant'ı en az bir adet 50 mililitrelik tüpe aktarın ve lysat'ı kauçuk bir septumla kaplayın. 20-gauge iğne kullanarak, yavaş yavaş oksijen yerinden etmek için iki dakika boyunca çözelti ile azot gazı kabarcık.Daha sonra, parafin film ile septum sarın, bakır tel ile Parafilm güvenli ve sütun malzemeleri ile eldiven kutusuna supernatant yerleştirin. Çözücü reçine yatağının hemen üzerinde olduğunda, önceden hazırlanmış bir amylose sütununda, 50 mililitre protein süpernatantını kolona yükleyin ve dakikada yaklaşık beş mililitre lik orta basınçlı azot altında beş mililitrelik fraksiyonlarda akışı toplayın. Tüm akış eluted olduğunda, amylose sütun arabellek başka üç sütun birimleri ile sütun yıkayın.Beş elüsyon tamponu CV ekleyin ve sonra orta basınçlı azot altında cam test tüpleri üç mililitre fraksiyonları manuel olarak toplamak. Demir amonyum sülfat ve dithiothreitol ile oksijen varlığı için çözümler test edin. Oksijen varsa çözelti koyu mavi veya siyaha dönüşür, sağdaki tüp gibi.Oksijen varlığı düşük katalitik aktivite ile saflaştırılmış protein neden olacaktır. Minimal oksijen mevcut çözümler lavanta veya açık mavi yarı saydam renk olacak, soldaki tüp gibi. Daha sonra, karıştırılan hücre odası basınç için harici bir azot hattı kullanın ve iki kez orta karıştırma hızında 50 mililitre protein konsantre.Daha sonra proteini 10 mililitreye konsantre edin ve konsantre proteini 0,45 mikrometrelik gözenek şırınga filtresinden filtreleyin. Aliquot 150 mikrolitre proteini tek tek 200 mikrolitre polimeraz zincir reaksiyon tüpleri içine. Daha sonra, sıvı nitrojen ve depolama eksi 80 santigrat derece anında flaş dondurma için eldiven kutusundan kapaklı aliquots çıkarın.DesB tuzsuzlaştırma için, ilk sephadex G-25 Kaba tuzsuz jel üç mililitre dokuz mililitre borosilikat sütun ekleyin ve gazsız tuz tampon iki sütun hacimleri ile sütun yıkayın. DesB çözüldüğünde, saflaştırılmış proteini yerçekimi kontrollü bir işlemle kolona yükleyin ve yaklaşık beş mililitre tuzsuzluk tamponu yla 12 şişenin her birine üç damla protein atmadan önce akışı atın. Oksijen elektrodu hazırlamak için, bir spacer kağıt yaklaşık 1,5 inç kare kesmek için makas kullanın ve kare her yüzüne küçük üçgenler kesmek, elektrot sarma yardımcı olmak için köşelerinde yarıklar ile.Elektrodun gümüş anod oluğuna %50 potasyum klorür çözeltisi beş damla ekleyin ve damlaları sürekli bir çözelti halkası oluşturacak şekilde bağlayın. Platin elektrotüstüne iki damla potasyum klorür çözeltisi ekleyin ve uzay kağıdını platin elektrotun üzerine dikkatlice yerleştirin ve uzay kağıdını hava kabarcığı olmaması için düzeltin. Yaklaşık iki inç uzunluğunda bir S4 30m PTFE membran parçasını kesin ve elektrotun dış halkası ile hizalanır şekilde membranın kenarlarını çıkararak boşluk kağıdının üzerine yerleştirin.Bir O-ring aplikatör kullanarak, elektrot üzerine spacer kağıt ve membran güvenli elektrot üzerinde küçük bir O-halka itin ve elektrot dairesel oluk üzerine daha büyük bir O-halkası yerleştirin, altında hiçbir membran olduğunu dikkat. Elektrotun üst haznesini taban üzerine kaydırın ve iki parçayı birbirine vidalayın. Monte edilen elektrotun tabanına yerleştirin ve elektrotı izleme sistemine bağlayın.Enzimatik reaksiyon oranını belirlemek için, elektrot kontrol ünitesi aracılığıyla oksijen tüketimini ölçmek için bilgisayar entegrasyonu ile oksijene duyarlı Clark tipi elektrot kullanın. Elektrot odasına uygun substrat hacmine bir mililitre Tris tampon ekleyin ve çözeltiyi 10 saniye karıştırın. 10 saniye sonra, yavaşça piston ile oda mühür ve üst aşağı vida.Hazneden yerinden edilen fazla sıvıyı emmek için temiz bir doku kullanın ve elektrotun çözeltideki oksijen konsantrasyonunun en az bir dakika boyunca sabit bir ölçüm üretebileceği bir yerde dengede durmasını bekleyin. Daha sonra, piston aracılığıyla elektrot odasına yaklaşık bir mikrolitre enzim eklemek ve hız verilerini toplamak için gaz geçirmez, 10 mikrolitrelik bir şırınga kullanın. Belirli bir substrat konsantrasyonu için tüm oran toplandığında, elektrot odası boşaltmak için yan kol vakum şişesine bağlı plastik bir tüp kullanın ve tekrar tekrar su ile dört ila altı döngü boyunca oda durulayın.Daha sonra, yeni bir substrat konsantrasyonu kullanarak, sadece gösterildiği gibi elektrot çözeltisi kurmak. DesB-maltoz bağlayıcı protein füzyon yapısı saflaştırma bireysel fraksiyonları SDS-PAGE jel analizi saf protein ürün izolasyon ortaya koymaktadır, bir kenara DesB ve maltoz bağlayıcı protein etki alanı ürünleri varlığı için birbirinden ayrıldı. Tüm kinetik ölçümler yapıldıktan sonra, örneğin DesB'nin gallate ile aktivitesi, değişen gallate konsantrasyonlarında oksijen tüketimi nin oranının ölçülmesi ile elde edilebilir.Tersine, dört-nitrocatechol ile DesB inhibisyonu oranı dört-nitrocatechol değişen konsantrasyonlarda varlığında bir milimolar gallate ile DesB oksijen tüketiminde azalma gözlemleyerek belirlenebilir, gösteren, örneğin, dört nitrocatechol oksijen tüketimini inhibe ve böyle dedeB reaksiyonu. Bu yöntem demirbağımlı dioksijenaz enzimlerinin incelenmesiiçin içgörü sağlasa da, diğer metalloenzimler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bir torpido kutusu içinde çalışmanın zor olabileceğini unutmayın, bu yüzden bu tekniği yaparken acele etmemeye dikkat edin.

anaerobic-protein-purification-kinetic-analysis-via-oxygen-electrode

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonların her ikisi de araştırmak için bir durduruldu akış aletinin kullanımı...

Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

Kaynak: Tokunou, Y., ve diğerleri, Shewanella oneidensis MR-1'de Hücre Dışı Elektron Taşınması Üzerindeki Döteryum Kinetik İzotop Etkisinin Elektrokimyasal Tespiti. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, proton transferinin elektroaktif bakterilerde hücre dışı elektron taşınmasını (EET) nasıl etkilediğini değerlendirmek için tam hücre elektrokimyasal yöntemini göstermektedir. Yöntem, döteryum oksit kullanarak protonları döteronlarla değiştirerek, kinetik bir izotop etkisini ortaya çıkarmak için akımdaki...

Döteryum Oksit Kullanılarak Mikrobiyal Elektron Taşınması Üzerindeki Kinetik İzotop Etkisinin Ölçülmesi

Mitokondri bitki hücre sadece küçük bir yüzdesi olarak, onlar çalışmalar bir dizi için saf gerekir. Mitokondri bitki organları çeşitli Homojenizasyon, son derece saf mitokondriyal kesir elde etmek için Diferansiyel ve yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından takip tarafından ayrılmış olabilir.

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) üretebilir birkaç flavin bağımlı enzim içerir. ROS izleme mitokondri içinde tek tek siteleri istenmeyen yan tepkiler nedeniyle zorlu sürümüdür. Biz saf flavoenzymes ve Mikroplaka fluorometry kullanarak ROS yayımı için yerel oranları doğrudan değerlendirilmesi için bir kolay, ucuz yöntemi mevcut.

Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

Burada bir protokol proton taşıma dış membran cytochromes Shewanella Corynebacterium Bay-1'karmaşık yoluyla ekstraselüler elektron taşıma oranı katkısını çalışmaya bütün hücreli elektrokimyasal deneyler mevcut.

Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1

Burada bir iletişim kuralı için immobilize benchtop metal benzeşme Kromatografi arıtma ve etiketli bir polyhistidine sonraki sulandırma, heme olmayan demir bağlama dioxygenase lisans öğretim laboratuvar için uygun mevcut.

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) enzimatik substrat protokatechuic asit kullanarak sulu bir sistemden serbest diatomik oksijen kaldırabilirsiniz (PCA). Bu protokol, bu oksijen atma enziminin ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivite analizini açıklar.

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Taze tümör homojenatlarında mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ve elektron transfer kapasitesini değerlendirmek için pratik bir protokol ve analitik yaklaşım geliştirdik. Bu protokol, kanser başlangıç, ilerleme ve tedavi yanıtına katkıda bulunan çeşitli mitokondriyal işlevleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Eksiz katı tümör homojenatlarının Mitokondriyal fonksiyonunun analitik tayini

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Bu çalışma, respirometrik ve enzimatik testler yoluyla mitokondriyal fonksiyon üzerindeki ksenobiyotik etkileri incelemek için bir metodoloji sunmaktadır. Çeşitli türlerde elektron taşıma zinciri modülasyonunu inceleyerek, böcek vektörü kaynaklı hastalıklara karşı hedeflenen biyopestisit gelişimi için içgörüler sunar.

İzole Mitokondride Ksenobiyotik Taşınma ve Etkilerinin Ortaya Çıkarılması: Respirometrik ve Enzimatik Testlerden Görüşler

Bu protokol, oksijen teslimatı için tasarlanmış hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinin sentezini, hemoglobin kapsüllenmesini ve yüzey PEGilasyonunu detaylandırır. Bu yöntem, kusur mühendisliğini zorlanma destekli biortogonal konjugasyon ile birleştirerek biyomedikal uygulamalara uygun yüksek geçirgenlikli ve fizyolojik olarak stabil taşıyıcılar üretir.

Hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinde oksijen dağıtımı uygulamaları için sentez, hemoglobin kapsülasyonu ve biortogonal PEGilasyon

Öğrenin anaerobik protein saflaştırma ve oksijen elektrodu ile kinetik analiz yöntemini. DesB dioxygenase enzimi kullanılarak oksijen hassasiyetli proteinlerin stabilitesi ve aktivitesi incelenmektedir.

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Daha fazla video keşfet