Name: Algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Öğrenin apoptotik cisimciklerin yüksek saflıkta akış sitometrisi ve diferansiyel santrifüjasyonla tespit ve izolasyon yöntemlerini. Bu protokol hücre biyolojisi ve apoptotik süreçlerin incelenmesi için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bunun işe yaradığına I.K.H.P. için Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (GNT1125033 ve GNT1140187) ve Avustralya Araştırma Konseyi (DP170103790) hibe tarafından desteklenmiştir

1. indüksiyon apoptozis
<ol><li>Hücre örneği 300 x g 5 min için'santrifüj kapasitesi ve önceden varolan herhangi bir hücre artıkları kaldırmak için süpernatant atın. Not: yapışık hücreleri kullanırken, hücreleri önceden tohum ve 1 fosfat tamponlu çözüm (PBS) apoptosis indüksiyon öncesinde x ile yıkayın.</li>
	<li>Cep numarasını belirlemek ve hücreleri toplamak. Not: tahlil sonrası yalıtım bağlı olarak en az 1 x 10 bir başlangıç hücre sayısı7 hücreleri önerilir.</li>
	<li>Komple medya (%10 (vol/vol) fetal buzağı serum, 50 IU/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin karışımı içeren ilgili orta) 1 x 106 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için resuspend.</li>
	<li>Aliquot ~ 2 x 6 iyi plaka kuyu başına 106 hücre.</li>
	<li>Apoptozis ikna etmek için plaka kapağı kaldırın ve hücreleri bir UV irradiator kullanarak 150 mJ/cm2 ışınlatayım. Bu yaklaşık 30-60 s almalıdır. Not: ~0.5 x 106 hücreler 'Untreated' hücre kontrolü için korunur ışınlama önce olun. Not: Apoptosis Ayrıca anti-Fas veya serum açlık6gibi diğer yöntemleri ile indüklenen.</li>
	<li>37 ° c, % 5 CO2 hücre bağlı olarak 2-8 saat için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir tezgah en iyi ışık mikroskop kullanarak, blebbing, apoptopodia oluşumu ve ApoBD oluşumu gibi apoptotik türleri morfoloji varlığını doğrulamak için hücreleri görselleştirin. Not: 40 X büyütme yeterlidir</li>
	<li>P1000 pipet, pipet ve apoptotik örnekleri toplamak kullanma.</li>
	<li>1 x PBS ile tabak yıkama ve maksimum verim sağlamak için kalan örnek ile birleştirmek.</li>
	<li>Toplamak ~1/10th 'Bütün apoptotik örnek' (WAS) için kontrol.</li>
	<li>'Tedavi edilmezse' örnek toplamak.</li>
	<li>6 dk 3000 x g de WS ve Untreated örnekleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>1 mL 1 x PBS resuspend ve buz üzerinde bir kenara koyun.</li>
	<li>ApoBD yalıtımı için her iki adım 2 veya 3 kalan apoptotik örnek ile devam ediyor.</li>
</ol>2. ApoBD yalıtım FACS üzerinden
<ol><li>3000 x g 6 dk için tüm örnek santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Pelet aksatmadan süpernatant çoğunluğu kaldırmak.</li>
	<li>1 mL 1 x A5 bağlama arabellek, A5-FITC 75 µL ve kime-PRO-3 2 µL başına 1 x 107 hücreleri içeren bir boyama çözüm resuspend.</li>
	<li>Örnek 10 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.</li>
	<li>1-2 mL 1 x A5 bağlama arabellek ekleyin ve örneği için fazla leke kaldırmak 6 dk 3000 x g'santrifüj kapasitesi. Not: Karma hücre popülasyonlarının veya doku örnekleri, adım 1 x A5 bağlayıcı arabelleğe birleşimiyle hücre türüne özgü Marker boyama bir antikor gerçekleştirmek ve Santrifüjü 3000 x g 6 için de önce buz 20 dk (veya üreticinin iletişim kuralı göre) üzerinde kuluçkaya Min.</li>
	<li>Örnek Pelet FACS arabellek 3 mL resuspend (1 x PBS, 1 x A5 bağlama arabellek, % 10 FSC, 2 mM EDTA) 1 x 107 hücre başına.</li>
	<li>70 µm hücre süzgeç aracılığıyla bir yuvarlak-alt, polipropilen (akış sitometresi) tüp filtre ve örnekleri buz üzerinde ve karanlıkta tut.</li>
	<li>FACS makinede açmak ve bir 100 µm meme kullanarak standart olarak gerçekleştirmek, damla gecikme yapmak ve istikrarlı bir akışı sağlamak.</li>
	<li>Örnek yüklemek ve satın alma hızını ~ 1000 olayları/s için.</li>
	<li>FSC, SSC, APC (kime-PRO-3) ayarlamak ve FITC (A5) gerilim ve nüfus sağlamak için FACS araziler içinde pozisyon olayları açıkça ayrılmış olabilir.</li>
	<li>20.000 olayları kaydetmek.</li>
	<li>Gating bir strateji olduğu gibi bölüm 4 ayarlayın.</li>
	<li>Sıralama düzeninde son ApoBD kapısı istenen sıralama nüfus eklemek.</li>
	<li>Örnek alınıyor başlamak ve ~ 250 µL FACS arabellek içeren yeni bir tüpe 5,000-10,000 ApoBDs toplayarak bir test sıralamayı gerçekleştirmek.</li>
	<li>Bir sistem geri floş gerçekleştirmek ve yük ApoBDs sıralanır.</li>
	<li>Elde etmek ve test-sıralama ApoBDs kaydedin.</li>
	<li>FSC (y ekseni) vs A5 karşılaştırarak ApoBD saflık % ~ 99 olduğundan emin olun (x ekseni olaylar). Not: A5 boyama biraz nedeniyle lazer beyazlatma örnekleri yeniden analiz ederken azaltmak.</li>
	<li>Yüksek saflıkta elde sonra orijinal örnek yük ve ApoBDs için istediğiniz sayıyı elde kadar sıralama devam edin. Not: gerekirse, ikili sıralama aynı anda ApoCells ve ApoBDs izole etmek için gerçekleştirilebilir. Not: uzun bir süre boyunca sıralarken, koleksiyon tüp 4 ° C'de kuluçka önerilir</li>
	<li>Sıralama işlemi tamamlandıktan sonra sonrası sıralama ApoBDs küçük bir bölümünü toplamak, tür sonrası ApoCells, Untreated ve WAS apoptosis doğrulamak ve sonrası sıralama saflık onaylamak için. Not: test-sıralama ve sonrası sıralama saflık önemli ölçüde farklı değil olsa da, bu akış ayarları ve istikrar üzerinde temel alır.</li>
</ol>3. ApoBD yalıtım fark Santrifüjü üzerinden
<ol><li>Kalan apoptotik örneği ' 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücre Pelet etkilemesini önlemek için ~ 500 µL bırakarak süpernatant, toplamak ve bir yeni 15 mL konik tüp içine ekleyin.</li>
	<li>Kalan 500 µL kaldırmak ve hücre Pelet resuspend 2 mL 1 x PBS (Bu 'ApoCell zenginleştirilmiş kesir' temsil eder.</li>
	<li>Toplanan süpernatant 3000 gde 20 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Pelet için kontrol edin ve dikkatli bir şekilde (süpernatant microvesicles ve exosomes de dahil olmak üzere küçük hücre dışı veziküller içerebilir) süpernatant çıkarın.</li>
	<li>Pelet 1 mL 1 x PBS (Bu 'ApoBD-zenginleştirilmiş' kesir temsil eder) resuspend</li>
	<li>Her Viable, WS, ApoCell zenginleştirilmiş ve ApoBD zenginleştirilmiş örnekleri içinde bir yeni turda-dip, polistiren (akış sitometresi) tüp 100 µL toplamak.</li>
	<li>2 x A5 bağlama arabellek, 1: 100 A5-FITC ve 1:1,000 kime-PRO-3 içeren leke 100 µL Ekle</li>
	<li>10 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Örnekleri gating strateji apoptosis başarılı indüksiyon ve ApoBD zenginleştirilmiş kesir saflığı doğrulamak için yukarıda açıklandığı gibi kullanarak akış sitometresi tarafından analiz.</li>
</ol>4. akış sitometresi strateji geçişi
<ol><li>Arsa kime-PRO-3 (y ekseni) karşı nekrotik hücre (kime-PRO-3yüksek) tüm diğer permeabilized olmayan olaylardan (kime-PRO-3düşük/orta) ayırmak için FSC (x ekseni).</li>
	<li>Tüm sigara permeabilized olayları seçin ve A5 karşı SSC arsa. Nüfus 1 (P1), SSCOrta/yüksek, A5düşük/orta hücreleri ve nüfus 2 (P2), diğer bütün olayları da dahil olmak üzere iki popülasyonun kapı.</li>
	<li>P2, kime-PRO-3 A5 karşı komplo ve A5Orta/yüksek olaylar tüm hücre artıkları dışarıda bırakmak için seçin.</li>
	<li>Tüm A5 olumlu olayları seçin ve A5 karşı FSC arsa. ApoBDs (FSCdüşük) ApoCells (FSCOrta/yüksek) ayırın. Not: ApoBDs ApoBD yalıtım FACS dayalı yaklaşım yoluyla için geçişi, son bir adım ApoBDs ve kime-PRO-3 A5 için karşılaştırma ve tüm olayları seçerek önerilir. Bu son sıralama kapısı FSC/SSC parametreleri yerine floresans kullanmasını sağlar.</li>
	<li>Geçerli hücre analizi, P1 seçin ve iki gating stratejileri birini gerçekleştirin. Genel geçerli hücre analizi için FSC A5 karşı arsa ve bu nedenle kalan hücre artıkları kaldırma tüm FSCOrta/yüksek hücreleri seçin. Alternatif olarak, derinlemesine analiz için hücrelerin A5 ayrılabilir- kime-PRO-3 FSC karşı komplo tarafından erken ApoCells. Seçin kime-PRO-3düşük, FSCOrta/yüksek hücrelerin ve kime-PRO-3Ara, FSCOrta/yüksek A5- erken ApoCells.</li>
</ol>

<ol><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+the+Dying%3A+Mechanisms+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions.</a> Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).</li>
<li>Tixeira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+morphologic+features+and+products+of+cell+disassembly+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%3A+An+International+Journal+on+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis.</a> Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).</li>
<li>Sebbagh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-mediated+cleavage+of+ROCK+I+induces+MLC+phosphorylation+and+apoptotic+membrane+blebbing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing.</a> Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).</li>
<li>Coleman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I.</a> Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+generating+extracellular+vesicles+during+apoptosis+via+a+beads-on-a-string+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure.</a> Nature Communications. 6, 7439(2015).</li>
<li>Poon, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+link+between+an+antibiotic%2C+pannexin+channels+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis.</a> Nature. 507, 329-334 (2014).</li>
<li>Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+microtubules+in+apoptotic+chromatin+dynamics+and+cellular+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation.</a> Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).</li>
<li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+basic+biological+phenomenon+with+wide-ranging+implications+in+tissue+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.</a> British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).</li>
<li>Witasp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+over+troubled+water%3A+milk+fat+globule+epidermal+growth+factor+8+promotes+human+monocyte-derived+macrophage+clearance+of+non-blebbing+phosphatidylserine-positive+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells.</a> Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).</li>
<li>Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinase+regulates+fragmentation+and+phagocytosis+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells.</a> Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).</li>
<li>Holmgren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+DNA+by+the+uptake+of+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies.</a> Blood. 93, 3956-3963 (1999).</li>
<li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Science Signaling. 2, ra81(2009).</li>
<li>Schiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigens+are+translocated+into+small+apoptotic+bodies+during+early+stages+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis.</a> Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).</li>
<li>Elamin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+the+Sonic+Hedgehog+signaling+pathway+and+triggers+apoptosis+in+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells.</a> Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).</li>
<li>Sagulenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIM2+and+NLRP3+inflammasomes+activate+both+apoptotic+and+pyroptotic+death+pathways+via+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li>
<li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li>
<li>Lleo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics%3A+identification+of+unique+protein+profiles+of+apoptotic+bodies+from+biliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells.</a> Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846(2017).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

1950'lerin başlarında açıklamasını beri apoptozis alanında belirgin, bir önde gelen araştırma alanı haline ilerlemiştir. Geniş ilgi ve geniş çabalarına rağmen apoptozis, özellikle ApoBDs, oluşumu bazı yönlerini de uygun yöntemleri eksikliği nedeniyle incelenmiştir değil. Bunlar özellikle belgili tanımlık sınırlama apoptosis ilerleme ve ApoBD oluşumu aynı anda geleneksel akış sitometresi A5/PI analiz ve ApoBD yalıtım kirleri kullanarak izleme içerir. Biz son zamanlarda metodolojik Bu eksiklikleri gidermek için yaklaşımlar...

Apoptozis, programlı hücre ölümü iyi çalışılmış bir form fizyolojik homeostazı korumak ve insan vücudu1içindeki zararlı olma olasılığı bulunan hücreleri kaldırmak için gereklidir. Apoptozis indüksiyon sonra apoptotik hücreler (ApoCells) morfolojik değişiklikler bir dizi tabi ve ApoBDs olarak adlandırdığı küçük membran bağlı veziküller sökmeye. Genel olarak, bu işlem apoptotik hücre sökme bilinir ve morfoloji2,3dayalı 3 farklı adımları ayrılabilir. Adım 1 (plazma zarı blebbing) blebs4,5olarak bilinen hücre yüzeyinde balon benzeri yapıların oluşumu ile karakterizedir. Adım 2 (apoptotik çıkıntı oluşumu) uzun membran çıkıntılar sivri6,7,8apoptopodia, boncuklu-apoptopodia ve Mikrotubul gibi oluşumu içerir. Son olarak, adım 3 (ApoBD oluşumu) parçalanma apoptotik çıkıntılar ve/veya ApoBDs6,9oluşturmak için ApoCells içerir. Önceki bulgular ApoBDs apoptotik hücre temizleme yardım ve hücreler arası iletişim arabuluculuk rolü tavsiye ettiler. Örneğin, bir ApoCell parçalanma ApoBDs içine kolayca fagositler2,10,11çevreleyen tarafından kaldırılmış olabilir küçük 'ısırık büyüklüğünde' parçalar oluşturabilir önerilmiştir. Ayrıca, ApoBDs biomolecules DNA, RNA ve proteinler, hücre-hücre iletişim12,13,14kolaylaştırmak için çevredeki hücreleri insan ticareti gibi bir dizi olabilir liman. Bu işlemlerin işlevsel olarak araştırmak için (i) doğrulama apoptosis indüksiyon ve ApoBD oluşumu, ApoBDs izolasyonu (II) ve (III) onay ApoBD saflık da dahil olmak üzere üç anahtar parametreleri onaylamak için hayati önem taşımaktadır.
Daha önce birkaç yöntem akış sitometresi ve Elektron Mikroskopisi gibi apoptozis ve ApoBDs15,16,17,18eğitim için kullanılmaktadır. Ancak, ApoBD algılama ve miktar zor veya gözden çoğu kez. Örneğin, rutin olarak kullanılan akış sitometresi tabanlı apoptosis V annexin istihdam tahlil (A5, externalized bağlar bir protein ' yemek-bana ' sinyal Fosfatidilserin (PtdSer)) ve nükleik asit leke propidium iyodür (PI)19. Ancak, bu evrensel leke bileşimini kullanarak, analiz hücre alt kümeleri (hücrelerin, ApoCells ve nekrotik hücre) örnek yalnızca üç tür vardır varsayar. Ayrıca, apoptozis için pek çok araştırmacı tarafından "altın standart" olarak kabul rağmen akış sitometresi deneyleri ve sonraki veri analizi kez FSC/SSCOrta-yüksek olaylar seçerek bir ilk gating adım adım ApoBDs dışarıda tutar. Bu nedenle, biz son zamanlarda A5 ve kime-PRO-3 kullanarak bir roman akış sitometresi tahlil geliştirdik, seçmeli olarak caspase 3/7-aktif pannexin 1 (PANX1) tarafından alınabilir başka bir nükleik leke7,20kanal. Caspase 3 kaynaklı PANX1 harekete geçirmek PtdSer pozlama apoptosis erken aşamada önce gelir gibi kime-PRO-3 differentially apoptotik ve nekrotik hücre lekeleri. Buna ek olarak, bu yaklaşım strateji çoğunluğuna bizim roman ile birlikte veri çözümlemesi sırasında tüm alınan olayları içerir ve dahil olmak üzere altı hücre/parçacık alt kümeleri sonuç olarak tanımlanır: (i) hücrelerin (FSC/SSCOrta/yüksek, A5düşük , Kime-PRO-3düşük), (II) A5- erken ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5düşük, kime-PRO-3Ara), (III) A5+ ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5yüksek , Kime-PRO-3Ara), (IV) nekrotik hücre veya geç ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5yüksek, kime-PRO-3yüksek), (v) ApoBDs (FSC/SSCdüşük, A5Ara, kime-PRO-3düşük / ara) ve (vi) enkaz (FSC/SSCdüşük, A5düşük, kime-PRO-3düşük)20. Bizim yaklaşım tüm hücreler/parçacık alt kümeleri ve daha da önemlisi, ApoBDs ayrılık hücreleri ve enkaz20analiz önemini vurgular. Böylece, bu yaklaşım aynı anda apoptozis ve ApoBD oluşumu indüksiyon doğrulamak için verimli bir tekniği gösteriyor.
Geleneksel olarak, ApoBDs nereye ApoBDs hücreleri veya yoğunluğu dayalı diğer ekstraselüler veziküller ayrılabilir diferansiyel Santrifüjü yaklaşımlar çeşitli aracılığıyla izole edilmiştir. Ancak, tür Santrifüjü yöntemler genellikle düşük ApoBD saflık,-sizlik çekmek-in örnek saflık ve/veya hücre türüne özgü ApoBDs17,21,22ayrı yetersizlik onaylamak için bir miktar adım tarafından sınırlıdır. Bu nedenle, biz son zamanlarda iki yaklaşım, FACS tabanlı ve hangi Apoptozis ve örnek saflık23indüksiyon doğrulamak için bizim daha önce kurulan akış sitometresi yöntemi ile birleştiğinde yeni fark Santrifüjü temelli bir yaklaşım geliştirdik. ApoBD yalıtım FACS tabanlı yaklaşımımız ile % 99 saflık için yukarı ApoBDs zenginleştirmek ve hücre türüne özgü antikor ApoBDs karma hücre popülasyonlarının, doku örnekleri ve vücut sıvıları23izole etmek için çeşitli ile birleştiğinde. Ayrıca, bizim gözden geçirilmiş fark Santrifüjü yaklaşım ApoBDs için yalıtmak için verimli bir yöntem gösteriyor > % 90 saflık23.
Bu yazıda, apoptozis indüksiyon, doğrulamak ve algılamak ve ApoBD oluşumu ölçmek için deneysel bir işlem bizim biz ayrıntılı olarak tarif. FACS tabanlı ve fark Santrifüjü tabanlı yöntemleri kullanarak ApoBD yalıtım iş akışları da özenli ve karşılaştırıldığında. Temsilcisi veri açıklanan yöntemi gelecekteki ApoBD çalışmalar için etkili bir üstün araç sağlar gösterir.

<table><tbody><tr><td>Hücreler, örneğin kültürlenmiş insan THP-1 monositleri (klon numarası: TIB-202)</td> <td>ATCC-RPMI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1640 orta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin karışımı</td><td>FSC</td><td></td> Gibco 10099-141 15140122 <td></td>1x</tr><tr><td>PBS</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Annexin V FITC BD <td></td></tr><tr><td></td><td> </td><td></td> Bioscience-TO-PRO-3 <td></td></tr><tr><td>iyodür</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>T3605</td><td>TO-PRO-3 cilt, göz ve solunum yolu irrasyonuna neden olabilir. Doğrudan temastan kaçının.</td></tr><tr><td>10x Annexin V bağlayıcı tampon</td><td>BD Bioscience</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001710526</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü (15 mL)</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü (1.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü inkübatörü (37 &deg; C,% 5 CO2)</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III FITC ve APC tespiti için iki lazerle yapılandırılmış akış sitometresi</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canto II FITC ve APC tespiti için iki lazerle yapılandırılmış akış sitometresi</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td> Diva 6.1.1 yazılımı BD Bioscience-<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 8.8.6 yazılımı</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Apoptotik organları (ApoBDs), microvesicles ve exosomes anahtar hücre dışı vezikül ailesiyle en büyük türü olan ApoBDs üyesidir. ApoBDs hücre izni hem de hücreler arası iletişim yoluyla kaçakçılığı biomolecules yardımcı olabilir teklif edildi. Kimlik ve ApoBDs yalıtım için kullanılan geleneksel yaklaşımlar genellikle doğru miktar ve düşük örnek saflık eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, apoptozis indüksiyon onaylamak, ApoBD formasyonu doğrulamak ve ApoBDs için yüksek saflıkta yalıtmak için bir iş akışı açıklanmaktadır. Ayrıca anahat ve floresan aktif hücre (FACS) sıralama ve ApoBDs izole etmek için fark Santrifüjü dayalı yaklaşımlar karşılaştırın. Ayrıca, izole ApoBDs saflığı kullanarak teyit edilecek bir daha önce akış sitometresi tabanlı boyama ve analitik yöntem kurmak. Birlikte, açıklanan yaklaşım kullanılarak yapılan THP-1 monosit apoptozis ve apoptotik hücre sökme indüklenen ve doğrulanmış ve THP-1 monosit oluşturulan ApoBD 97-%99 saflık için izole edildi.

Burada özetlenen yordamı kullanarak, THP-1 monosit apoptosis akımıdır ve ApoBDs algılanır ve bir FACS tabanlı veya bir fark Santrifüjü yaklaşım (Şekil 1) yolu ile izole. İlk olarak, apoptozis UV ışınlama tarafından indüklenen ve apoptotik türleri morfoloji, blebbing, apoptotik membran çıkıntı oluşumu ve ApoBDs6nesil de dahil olmak üzere hücreleri sergilenen zaman örnekleri, kuluçka sonra 2-3 h toplanmıştır. Kime-PRO-3 ve A5 tabanlı akı...

Akış Sitometresi veya diferansiyel Santrifüjü kullanarak bir iş akışı tespit etmek, ölçmek ve apoptotik vücutlarından apoptotik örneği yüksek saflıkta yalıtmak için geliştirilmiştir.

Algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Bu protokolün genel amacı, apoptotik cisimleri yüksek saflıkta hem tespit etmek hem de izole etmektir. Apoptotik cisimler, hematozun indüksiyonuna yardımcı olmak için üretilen bir tür hücre dışı veziküldür. Tipik olarak bir ila beş mikrometre çapında değişen en büyük hücre dışı fiziksel aile türüdür.Apoptotik cisimlerin, apoptotik hücre klerensi ve hücre içi iletişim gibi hücresel süreçlere yardımcı olabileceği artık belirgin hale gelmektedir. Bu nedenle, apoptotik cisimleri tespit etmek, ölçmek ve izole etmek için doğru bir metodolojinin geliştirilmesi, işlevlerinin ve mekanizmalarının kişiselleştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu ayrıştırma serisinde, apoptotik cisimleri apoptotik örneklerden nasıl tespit edeceğinizi, miktarını belirleyeceğinizi ve izole edeceğinizi göstereceğiz.Bölüm A, apoptozun indüksiyonu. THB1 monositleri gibi hücre dizilerinde apoptozu indüklemek için önce hücreleri toplayarak başlayın. Hücreleri sayın ve yaklaşık 10 milyon hücre toplayın veya gerektiği gibi.Apoptotik cisimlerin analizi için 10 milyon öneriyoruz. Altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına iki milyon hücre ayırın. UV Stratalinker 1800'ü kullanarak altı kuyulu plakadan ve UV hücrelerinden kap

detection-and-isolation-of-apoptotic-bodies-to-high-purity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Hücre ölümü değerlendirilmesi için doğru bir yöntem açıklanmıştır. Protokol birincil hücre hücre hatları ve geniş bir yelpazede hayvan modellerinde% 40 yalancı pozitif olaylar kadar ekran geleneksel Annexin V / propidium iyodür (PI) protokolleri, üzerine geliştirir.

Hücre Ölümü doğru değerlendirilmesi için modifiye Annexin V / Propidium İyodür Apoptoz Testi

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme...

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Bu videoda, bir numunedeki apoptotik hücrelerin varlığını tespit etmek için TUNEL testi gerçekleştirilmiştir. Çalışma, bir floresan mikroskobu altında gözlemlenebilen ve tanımlanabilen, parçalanmış DNA'nın 3' terminaline etiketli dUTP'lerin eklenmesini katalize eden özel bir DNA polimeraz - terminal deoksinükleotidil transferaz - kullanmayı içerir.

Terminal Transferaz Aracılı dUTP Nick Uç Etiketleme—TUNEL Testi: Apoptotik Hücrelerde DNA Parçalanmasını Tespit Etmek İçin Yerinde Bir Yöntem

Bu videoda, konfokal mikroskopi kullanarak apoptotik hücrelerin klirensini incelemek için efferositoz testini gösteriyoruz. Efferositoz, apoptotik hücrelerin fagositler tarafından yutulduğu ve efferozom adı verilen veziküller içinde parçalandığı çok aşamalı bir süreçtir. Bu protokol, tek tek apoptotik hücrelerin içselleştirilmiş ve içselleştirilmemiş kısımlarını görselleştirmek ve efferositozu ölçmek için bir yöntem sağlar.

Sabit Hücreli Efferositoz Deneyi: Floresan Mikroskobu Kullanarak Apoptotik Hücrelerin Makrofajlar Tarafından Efferositik Alımını İncelemek İçin Bir Yöntem

Multiplex deneyleri temel hücresel mekanizmaların için yararlı bilgi sağlamak ve reaktifler ve gereksiz tekrarlı deneyler atık ortadan kaldırabilir. Biz, palmitik asit ile oksidatif karşılaştırmadan sonra, bir in vitro modelde hipotalamik hücre yaşayabilirliğini belirlemek için, flüoresan ve ışıldayan dayalı yöntemler kullanılarak, burada çok katlı bir kaspaz-3/7 aktivite deneyi tarif eder.

Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Burada, bitişik ölü veya ölmekte olan hücrelerle fiziksel etkileşim yoluyla canlı hücrelerde indüklenen hücre içi sinyal olaylarının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, fagositik alımlarının veya çözünür aracıların salınmasının aksine, ölü hücrelerin reseptör aracılı tanınmasıyla indüklenen sinyal olaylarına odaklanır.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Burada, apoptotik meme kanseri hücreleri floresan aktif hücre sıralayarak yalıtmak ve daha fazla meme kanseri olmayan kök hücreleri meme kanser kök hücre gibi hücrelere geçişten sonra apoptosis ters akış sitometresi tarafından algılamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Burada, apoptotik tirositler ve periton makrofajlar hazırlamak ve effersitoz verimliliğini ve apoptotik tirositlerin özel inhibitörü-aracılı engellemesini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol yapay boncuk ve bakteri dahil olmak üzere diğer parçacıklar hücre aracılı boşluk geniş bir uygulama vardır.

Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi

Apoptoz, erken ve geç apoptotik biyobelirteçlerin akış sitometrik analizi ile karakterize edilebilir. Serviks kanseri hücre hattı SiHa, bir tezgah üstü akış sitometresi kullanılarak Actinomycin D ile tedaviden sonra apoptoz biyobelirteçleri için analiz edildi.

Aktinomisin D ile Tedavi Edilen SiHa Serviks Kanseri Hücrelerinde Apoptotik Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Öğrenin apoptotik cisimciklerin yüksek saflıkta akış sitometrisi ve diferansiyel santrifüjasyonla tespit ve izolasyon yöntemlerini. Bu protokol hücre biyolojisi ve apoptotik süreçlerin incelenmesi için güçlü bir araç sunar.

Algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının

Daha fazla video keşfet