Yönbağımlı polimer yapay antijen hücreleri CD8 + T Hücre aktivasyonu için sunma imalatı

Bu yöntem, amino-mühendislik alanında anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Gibi, biyomalzeme bağışıklık hücresi etkileşimleri ve aktivasyonu parçacık fiziksel özelliklerinin rolü nedir. Bu tekniğin en büyük avantajı, biyomimetik parçacıkların boyutu ve şeklinin bağımsız bir şekilde kontrol edilmesini sağlamasıdır.

Bu tekniğin etkileri in vivo hücre aracılı bağışıklık yanıtları neden olabilir bir raf parçacık tedavisi olarak kanser tedavisi doğru uzanır. Bu yöntem kanser amino tedavisi içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer sistemlere uygulanabilir. Bulaşıcı hastalık veya Tip 1 diyabet gibi.

Mikro parçacık sentezi için, 100 miligram poli (laktik-co-glikolik asit) veya PLGA tartılarak, bir sintillasyon vial içine başlar ve girdap ile diklorotan beş mililitre PLGA eriterek. Homogenizer%1 polivinil alkol veya PVA çözeltisi 50 mililitre içeren bir kabın içine bir homogenizer yerleştirin, böylece homogenizer ona dokunmadan kabın altına mümkün olduğunca yakın olur. Homogenizer'i uygun hızda açın ve bir dakikalık homojenizasyon için PLGA çözeltisini kabına ekleyin.

Homojenizasyon sonunda, polivinil alkol PLGA mikro parçacık solüsyonu bir kabın içine dökün 100 mililitre 5% PVA çözeltisi içeren bir kimyasal başlık bir karıştırma plakası üzerinde ve en az dört saat boyunca çözelti karıştırın. Çözücü buharlaştığında, parçacık çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplere dökün ve parçacıkları santrifüj le toplayın. Her tüpteki süpernatantı 20 mililitre de-iyonize su ile değiştirin ve girdap yaparak parçacıkları yeniden askıya alın.

Daha sonra her tüpteki son hacmi 50 mililitreye kadar taze iyonize su ile getirin ve parçacıkları sadece gösterildiği gibi iki kez daha yıkayın. Nano parçacık sentezi için, 200 miligram PLGA'yı beş mililitre diklorometan içinde çözün ve kabın dibine dokunmadan buz üzerinde 50 mililitre %1 PVA çözeltisi içeren bir sonicator probu yerleştirin. 12 watt'ta sonication başlayın ve hemen yaklaşık 200 nanometre çapı ile nano parçacıklar oluşturmak için iki dakikalık sonication için kabına PLGA çözüm ekleyin.

Sonication sonra, kimyasal bir duman kaputunda solvent buharlaşma dört saat boyunca bir karıştırma plakası üzerinde 5 PVA çözeltisi 100 mililitre içeren bir beher içine% 1 polivinil alkol PLGA nano-parçacık solüsyonu dökün. Tüm çözücü buharlaştığında, herhangi bir mikro parçacıklar kaldırmak ve süpernatants kaldırmak için santrifüj için 50 mililitrekonik tüpler içine parçacık çözeltisi dökün. Daha sonra nano parçacıkları yüksek hızlı santrifüj tüplere aktarın.

Polimerik parçacık imalatı için, son yıkamadan sonra, yaklaşık bir mililitre taze iyonize sudaki parçacıkları yeniden askıya alır ve mililitre partikülbaşına 2,5 miligramlık son konsantrasyona parçacıklara film döküm çözeltisi ekleyin. Tek boyutlu germe için parçacık süspansiyonu 10 mililitrelik aliquots içine 75 50 milimetre dikdörtgen Petri kapları aktarın. Ya da 100'e 100 milimetre kare petri yemekleri içine 15 mililitre aliquots iki boyutlu germe için.

Bir kimyasal başlık içinde bir gecede kurutma sonra, filmleri kaldırmak ve makas ile kenarları kırpmacı kullanın. 1D germe için, otomatik ince film germe cihazının bir ekseninin alüminyum bloklarına monte etmek için iki parça neopren kauçuk arasında bir filmin iki kısa kenarını yerleştirin. Daha sonra filmi yerinde tutmak için kauçuk üzerindeki metal kulpları vidalamak için bir Allen anahtarı kullanın.

2B germe için, her iki eksen üzerinde film germek için dört kenarı dört alüminyum blok üzerine monte ve bir D germe veya 2D germe için her iki eksen için bir eksen üzerinde alüminyum bloklar arasında film uzunluğu kaydetmek ve istenen kat streç dayalı bir veya iki yönde film germek için gerekli mesafeyi hesaplamak. Daha sonra filmi 10 dakikadan fazla ısıya getirmek için az miktarda su daha büyük bir kabın yanına 90 santigrat derecede bir fırına film yüklü germe cihazı yerleştirin. Esneme tamamlandığında, film 20 dakika oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

1D germe için, kenarlarında germe cihazı film kesip. 2B esneme için, kesip kesin ve her iki eksen üzerinde düzgün gerilmiş filmin merkezi kare kaydedin. Filmleri tüp başına en fazla iki film içeren 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin ve girdap için her tüpe yaklaşık 25 mililitre iyonize su ekleyin.

Filmler eridiğinde, parçacıkları üç kez iyonize suda yıkayın. Son yıkamadan sonra tüp başına yaklaşık bir mililitre taze iyonize su parçacıkları yeniden askıya. Daha sonra eksi 80 derecede bir saat veya bir gecede lyophilization parçacıklar dondurun.

Ertesi sabah, yeni hazırlanmış MES tampon girdap ile mililitre başına 20 miligram lyophilized mikro veya nano parçacıklar yeniden askıya. 900 mikrolitre MES tamponu içeren polipropilen mikro santrifüj tüpüne parçacık çözeltisinin 100 mikrolitresini ekleyin ve 100 mikrolitre taze hazırlanmış EDC NHS çözeltisi ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir invertör üzerinde parçacıkları girdap ve kuluçka parçacıkları karıştırın.

Kuluçka sonunda, parçacıkları santrifüj le toplayın ve pbs'nin bir mililitresindeki mikro parçacık peletlerini girdaplayarak veya nano parçacıkları pBS'nin bir mililitresinde iki ila üç watt'ta beş saniye sonication ile yeniden askıya alarak yeniden askıya alın. Daha sonra, mikro parçacıklara sekiz mikrogram uygun bir sinyal bir protein ve 10 mikrogram anti fare CD28 antikor veya nano parçacıklara bir protein ve 20 mikrogram anti fare CD28 mikrogramı ekleyin. PBS ile 1.1 mililitre her tüpte son hacmi getirin ve dört santigrat derece bir inverter üzerinde bir gecede parçacıkları kuluçka.

Ertesi gün, gösterildiği gibi de-iyonize suda parçacıkları üç kez yıkayın. Bu PLGA nano ve mikro parçacıklar, iletim ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak gösterildiği gibi tek emülsiyon teknikleri kullanılarak sentezlendi. Homojenizasyondan sonra mikro parçacıklar ortalama üç mikrometre çapında bir çap gösterdiler.

Küresel mikro parçacıklar yaklaşık bir boy oranı vardı, 1D genişletilmiş prolate elipsoidal parçacıklar yaklaşık üç buçuk daha büyük bir boy oranına sahip iken ve 2D gerilmiş oblipsoidal parçacıklar yaklaşık 1.2 bir enboy oranı vardı, kabaca bir en boy oranı koruyarak. Konjugasyon verimliliği sonuçları küresel ve elipsoidal mikro-yapay antijen sunan hücreler yüzeyinde protein benzer miktarda ortaya, veya AAPC ve nano-AAPC, AAPC sentezi sırasında protein kaplin konsantrasyonbağımlı bir şekilde meydana geldiğini gösteren. Prolate elipsoidal AAPC'nin 01 miligram dozda elde edilen en iyi ayırma ile küresel AAPC'den daha düşük doymak dozlarında daha yüksek düzeyde T hücre proliferasyonuna neden olduğu bulunmuştur.

Yedi gün sonra, T hücrelerinin manuel sayma prolate elipsoidal AAPC daha etkili bir doz bağımlı bir şekilde mikro ve nano ölçekte küresel muadillerine göre T hücrelerini uyarmak ortaya koymuştur. Bu prosedürü takiben, AAPC onların terapötik etkinliğini ve farmakokinetiği ölçmek için in vivo administrated olabilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra immüno-mühendislik alanında araştırmacıların asiztropinin AAPC etkinliği üzerindeki etkisini keşfetmelerinin önünü netti.