Name: Karaciğer-on-a-Chip kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Öğrenin, karaciğer-on-a-chip kültürleri ile Hepatit B virüs enfeksiyonunu birincil hepatositler ve Kupffer hücreleri üzerinde nasıl araştırılır. Bu yöntem, hepatotropik enfeksiyonları ve karaciğer hastalıklarını fizyolojik bir modelde incelemek için uzun süreli doku bakımı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Avrupa Araştırma Konseyi (637304), bir hoş geldiniz güven araştırmacı Ödülü (104771/Z/14/Z), başlangıç hibe ve CN Bio yenilikler tarafından finanse edildi.

<ol><li>Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Models+for+the+Investigation+of+Hepatitis+B+and+D+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li>
<li>Elaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+the+dedifferentiation+process+of+isolated+hepatocytes+and+their+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.</a> Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).</li>
<li>Konig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+bile+acid+transporter+and+hepatitis+B+virus+receptor+Na%2B%2Ftaurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+preclinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682(2018).</li>
<li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+cccDNA+in+HBV+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Role of cccDNA in HBV Maintenance.</a> Viruses. 9 (6), (2017).</li>
<li>Guo, J. T., Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+hepatitis+B+virus+cccDNA%3A+Implications+for+the+development+of+cccDNA-targeting+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics.</a> Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).</li>
<li>Lucifora, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+antiviral+properties+of+TLR+ligands+against+HBV+replication+in+immune-competent+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).</li>
<li>Hosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+Activates+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription+3+Supporting+Hepatocyte+Survival+and+Virus+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+human+liver+scaffolds+for+functional+tissue+engineering+by+high+shear+stress+oscillation-decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).</li>
<li>Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+promote+survival%2C+proliferation%2C+and+maintenance+of+differentiation+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).</li>
<li>Hwa, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+survive+without+exogenous+VEGF+in+3D+perfused+co-cultures+with+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes.</a> The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).</li>
<li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li>
<li>March, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+coculture+of+primary+human+hepatocytes+and+supportive+cells+for+the+study+of+hepatotropic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li>
<li>Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176555/">Engineering liver.</a> Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).</li>
<li>Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+multiwell+plate+for+3D+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering.</a> Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Uzun vadeli PHH kültürleri korumak zorluklar birçok kültür modeli geliştirilmesi artırılmış işlevsellik ve uzun ömürlü, her farklı avantajları ve dezavantajları sergilenmesi ile tahrik. O şimdi 2D kültürleri statik PHH zaman çok sınırlı miktarda hepatosit biyoloji bazı yönlerini taklit eden yaygın kabul edilmektedir. Böylece, micropatterned12,13, küresel kültürler14,15, cocultures ve 3D karaciğer-on-a-chip kültürler16,17 hızla bu daha temel sistemleri değiştirme. Özellikle belirli microenvironments kullanmak için ev sahibi ile coevolved, bulaşıcı hastalıklar, okurken fizyolojik ortamlar sağlamak için gereksinim insan-tropic kültür kez zorlu doğa tarafından desteklenen bulaşıcı hastalıklar, Hepatit C virüsü, HBV ve sıtma gibi.
3D karaciğer-on-a-chip kültürler yerine en kritik kalite başlangıçta kaynaklı birincil hücre tiplerinin adımdır. Bu hücreler-meli var olmak sınav için onların bağlılık kapasitesi ve sadece plateable PHH çok başarılı doku oluşumu ve kültür üretimi sağlamak için kullanılmalıdır. Taze izole PHH kullanılabilir olsa bile, onların dondurma genellikle karmaşık ve özel dondurucular oranı kontrol gerektirir.
Geleneksel statik 2D kültürler, aksine ana bilgisayar genetik arka plan HBV enfeksiyonu duyarlılık açısından ihmal edilebilir düzeydedir ve tüm böylece uzak test hepatosit bağış HBV enfeksiyonu4kurmak mümkün.
Rağmen hasta elde edilen HBV enfeksiyonlar 3D kültürlerin kurar, PEG çöktürülmüş kullanmak zorunludur ve sukroz yastık-HBV indüklenebilir HBV yapımcı hücre kullanarak viral inocula üretimi için hatları her saf. Doğrudan 3D karaciğer-on-a-chip kültürler, inhibitör faktörleri veya tetkikine ile mevcut büyüme faktörlerinin bir uyumsuzluk nedeniyle yoluyla uygulanan hücre kültür supernatants kolayca enfeksiyonu neden değil. Plazma kaçınılmaz pıhtılaşıyor ve kültür platformu mikrosıvısal dolaşımını takunya beri Ayrıca, hasta kaynaklı viral inocula seçerken, yalnızca serum, kullanılmalıdır.
Kullanılan viral inoculum ne olursa olsun, hücresel canlılığı ve farklılaşma temin yanı sıra ilk HBV inoculum tümüyle kaldırılmasını sağlamak başarılı uzun vadeli enfeksiyon çalışmalar anahtarıdır. Bunu yapmak için en uygun yolu viral inoculum kaldırılması aşağıdaki gibi insan serum albümin düzeyleri kültür süresi boyunca ölçme kültürler örnekleme. Dikkat, tüm diğer açıklanan platformlar, HBV enfeksiyonu, benzer şekilde, bir kez kurulan, kolayca kandan hücrelere yayılmış değildir. HBV enfeksiyonu içinde vivo kolayca hepatosit karaciğer içinde çoğunluğu bulaşan beri bunun için altta yatan mekanizma zor kalır.
Açısından cocultures PHH ve Kupffer hücrelerinin tüm ticari olarak mevcut Kupffer hücre bağış eşit bir yanıt beri IL6 ve TNFα salgı LPS stimülasyon, yanıt olarak değerlendirmek için Kupffer hücrelerinin çok testleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
Önemlisi, bütün ilaç tedavileri veya HBV ile kültürlerin ilk enfeksiyon için kuyu (1.4 mL), de mikrosıvısal kanal (0.2 mL), tarihi itibariyle toplam hacmi alınmalıdır dikkate uyuşturucu ya da inoculum konsantrasyonları hesaplanması için. Doğru dozaj sağlamak için mikrosıvısal kanal Başbakan için bir yıkama adım HBV veya uyuşturucu içeren orta ile gerçekleştirilir.
Platformu kullanılan iskele içinde çok katmanlı tetkikine sağlayan şey, başı 600.000 PHH kullanır. Cep numarası farklı olsa bile, seçilen hücre toplama en iyi sonuçları sağlar. Plaka biçimi için 36 iskele yükseltilebilir 12 iskele toplam tutar. Ancak, mikrosıvısal gereksinimleri nedeniyle, daha iyi numaralarına kadar ölçeklendirme bugüne kadar mümkün değildir.
Bu yaklaşımları kullanarak, kültürler, şimdiye kadar yanı sıra yeni ilaç adaylarının değerlendirmek için farklı karaciğer hücre arasındaki karmaşık etkileşim çalışma benzeri görülmemiş fırsatlar sunan en iyi cep performans için en az 40 gün, ile korunabilir nüfus HBV enfeksiyonu sırasında.

HBV çalışmanın birkaç yüz binlerce enfeksiyon1başlatmak için hücre başına HBV genomu kopya gerektiren kültür sistemlerinin, zavallı duyarlılık tarafından karmaşık. Ayrıca, birincil insan tetkikine genellikle son derece kırılgan ve hızla geleneksel kültürler2sırasında dedifferentiate. Gerçeğini esas olarak düz ve sert plastik yüzeyler karaciğer ve oksijen yokluğunda mikrosıvısal dolaşım, kültürlerin genel eksikliği içinde bulunan doğal hücre dışı ortamlarda taklit değil nedeni bu. Geleneksel statik hepatosit kültür kolajen kaplı plakalar üzerinde hızla dedifferentiate ve HBV enfeksiyonu3onların duyarlılık kaybetmek. Burada, kurulum ve geleneksel 2B statik PHH kültürler onların genişletilmiş metabolik ve fonksiyonel yetkinlik nedeniyle kolajen kaplı tabaklarda çok avantajlı bitti, 3D karaciğer-on-a-chip kültürler, yetiştirilen PHH enfeksiyonu tarif kolaylaştırılması en az 40 gün4uzun vadeli kültürleri. Bu sistemde, PHH sürekli oksijen ve besin hücrelere sağlamak için büyüme orta ile periosteum kolajen kaplı iskele üzerinde seribaşı. PHH için alternatif kültür sistemleri dayalı olsa bile fare fibroblastlar veya 3D büyüme pulcuklarının karmaşık cocultures doğrulandıktan ve HBV enfeksiyonu ilişkilendirmenin çeşitliliği 500 genom (GE) karşılıkları HBV enfeksiyonu hücre başına, 3D kullanarak yatkındır karaciğer-on-a-chip kültürler kalır tek tüp bebek modeli sistemi 0,05 duyarlı GE HBV hücre4başına. Bu ayrıca HBV enfeksiyonu kurmak için dimetil sülfoksit (DMSO) ve Polietilen glikol (PEG) yüksek konsantrasyonda kullanma gerekliliği tarafından bu kültürlerde 3D karaciğer-on-a-chip kültür sistemleri enfeksiyon için gereksiz olan desteklenen 4. HBV önemli işaretlerinden arasında tüm de üretilen novo-virions5,6için transkripsiyon şablon görevi görür cccDNA havuzu enfeksiyondur. CccDNA geleneksel hepatosit kültürler7,8' tespit edilebilir olsa da, ister cccDNA düzenlenmesi ve herhangi bir tedavi yaklaşımları onun eleme amaçlı olarak kısmen recapitulated olarak belirsizdir veya tamamen dediferansiye tetkikine. Biz o cccDNA işlevsel olarak 3D karaciğer-on-a-chip kültürlerde oluşturulur, fizyolojik uyaranlara yanıt verir ve transkripsiyon makine cccDNA genom4erişilebilirliğini engel tarafından hedef göstermiştir.
Bu enfeksiyon, hem de tedavi başarı için biyolojik tanımlaması etkinleştirme, HBV infekte hastaların gözlenen 3D karaciğer-on-a-chip taklit HBV enfeksiyonu için ana bilgisayar yanıt. Karaciğer-on-a-chip kültürlerin benzersiz özellikleri arasında PHH ve karaciğer Kupffer hücreleri4, yildiz seklinde hücre9ve karaciğer sinüsoidal dahil olmak üzere, içindeki diğer nonparenchymal hücreleri arasında uzun vadeli ana bilgisayar yanıt-e doğru değerlendirmek için yeteneğidir endotel hücreleri10,11. Bu karmaşık bir 3D microenvironment etkileşimlerde hücre/hücre değerlendirmek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır.
Ayrıca, bu platform genişletilmiş kültür döneminde geleneksel hepatosit kültür sistemleri kullanarak mümkün olmayan sıralı ilaç tedavileri değerlendirilmesi ve HBV sebat, üzerindeki etkilerini kolaylaştırır.
Bu protokolü nasıl 3D karaciğer-on-a-chip açıklar monocultures, PHH veya PHH cocultures Kupffer hücreleri ile kültürler oluşturulur. Ayrıca, saf HBV enfeksiyonu, düşük çeşitlilik araştırmaları üretimi yanı sıra ev sahibi ve viral yanıt daha sonraki analiz açıklar.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium, fenol kırmızısı yok</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>Hepatosit Çözülme Ortamı</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>Primer Hepatosit Çözdürme ve Kaplama Takviyeleri</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Primer Hepatosit Bakım Takviyeleri</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, ABD menşei, Isı ile İnaktive edilmiş, steril filtreli, hücre kültürüne uygun</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Baldır derisinden elde edilen kollajen</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum karbonat susuz</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit, %99,999</td> <td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>% 4 Paraformaldehit</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Albümin (insan)</td> <td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagent&nbsp; Sığır Serumu Albümini, Fraksiyon V, Isı Şoku Uygulanmış</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, UNG Uygulamalı</td><td>Biyosistemler</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</em'den Lipopolisakkarit> K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kitler/Sarf Malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril membran</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Perfüzyon hücre kültürü plakası</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip kültür plakası kapağı</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Steril yuvarlak filtre kağıdı</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Hücre bağlantı iskelesi</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Tutma halkası</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Steril piston</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy kan ve doku kiti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Manyetik Luminex testi</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Adımlı Ultra TMB-ELISA Yüzey Çözeltisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Aksesuar Seti</td><td>RNA taşıyıcısı</td><td>içeren Qiagen</td><td></td></tr><tr><td>1048147 Millicell HY 5 katmanlı hücre kültürü şişesi, T-1000, steril</td><td>Millipore (Merck)</td><td></td><td></td>PFHYS1008</tr><tr><td>MicroAmp Optik 384 Kuyulu Barkodlu Reaksiyon Plakası</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optik Yapışkan Film</td><td>Life teknolojileri</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Düz Tabanlı İmmüno Steril Olmayan 96 Kuyulu Plakalar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Plakalar için Sızdırmazlık Bandı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Hızlı Akışlı PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Şişe Üstü Filtreler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Zemin Kenarlı Mikroskobik Slaytlar, Twin Frost</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>Tüpü, İnce Duvar, Ultra Şeffaf, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Adı</güçlü></td><td><güçlü>Şirket</güçlü></td><td><güçlü>Katalog Numarası</güçlü></td><td>güçlü<güçlü>Yorumlar</güçlü></td></tr><tr><td><güçlü>Birincil hücreler / Hücre hatları</ güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan Plakalanabilir Hepatositler, Taşıyıcı Nitelikli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>Dondurularak Korunmuş İnsan Kupffer Hücreleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19 hücre hattı</td><td>Haitao Guo (Indiana Üniversitesi, IN, ABD)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü</td> <td>> < güçlü > Şirket < güçlü > </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primers/Probes/Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA ileri primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA ters primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA probu</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA ileri astar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr><td>ters astar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>ileri astar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>ters astar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>Profesör Christoph Seeger (Fox Chase Kanser Merkezi, PA, ABD)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Antikorlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatit B virüsü çekirdek antijen IgG fraksiyonu (poliklonal)</td> <td>DAKO</td>, <td>Lot 10102505</td>İnsan Albümin Antikoru, A80-129A Bethyl <td>Laboratuvarları'nı durdurdu</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Albümini çapraz adsorbe edilmiş Antikor, A80-229P</td><td>Bethyl Laboratuvarları içinde. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>#&nbsp; A-11072</td><td>Lot 1431810</td></tr><tr><td><güçlü>Adı</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Vakum pompası</td><td>CN Bio yenilikler</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Pnömatik Bağlantı</td><td>CN Bio yenilikler</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip platformu</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip plaka yıkama iskelesi</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otoklavlanabilir metal forseps</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Bilimsel endüstriler</td><td>SKU: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 Tıbbi Emme Yüksek Vakumlu Yüksek Akışlı</td><td>MGE dünya</td> <td>çapında&nbsp; SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>NUAIRE 5800 SERİSİ kuluçka makinesi</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik hassas tork</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manuel tork</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip kompresör</td><td>CN Bio yenilikleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex LX-200 xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ile cihazMillipore El Tipi Manyetik Ayırıcı Blok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Millipore & trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>FluoStar Optima Plaka Okuyucu</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Hassas elektrikli tornavidalar</td><td>VTECH ltd</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Güç kaynağı</td><td>VTECH ltd</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>Hava Ekipmanları</td><td>Durduruldu</td><td></td></tr><tr><td>Integra Vacuboy</td><td>INTEGRA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 384 Kuyulu Bloklu Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453536</td><td></td></tr></tbody></table>

"karaciğer-on-a-chip" kültürleri birincil tetkikine ve kupffer hücreleri için hepatit b virüs enfeksiyonu

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Nerede sadece üç viral genom deneysel olarak enfekte şempanzelerin kronikleşme içinde sonuçlanabilir, olağanüstü infektivite hepatit B virüsü (HBV) içinde vivo rağmen en tüp bebek modelleri birkaç yüz binlerce hücre başına viral genom gerektirir. geçici bir enfeksiyon başlatmak için sipariş. Ayrıca, birincil insan tetkikine (PHH) statik 2D kültürleri sadece kısa vadeli çalışmalar nedeniyle onların hızlı dedifferentiation izin. Burada, biz 3D karaciğer-on-a-chip kültürleri PHH, monocultures veya cocultures ile diğer nonparenchymal karaciğer yerleşik hücre tanımlamak. Bu fizyolojik konak hücre yanıt-e doğru uzun vadeli HBV enfeksiyonlarıdır eğitimi için önemli bir gelişme sunar. İlaç etkinliğini araştırmaları, toksikolojik analiz ve Patogenez soruşturmalar kolaylaştırıcı ek olarak, bu mikrosıvısal kültür sistemleri kovalent kapalı ortadan kaldırarak hedef alan HBV enfeksiyonu için şifalı tedaviler değerlendirilmesi olanaklı kılmak, Daire (ccc) DNA'sı. Bu yöntem PHH monocultures ve PHH/Kupffer hücre ortak kültürleri, saflaştırılmış HBV ile onların enfeksiyon ve ana bilgisayar yanıt analizini up açıklar. Bu yöntem, özellikle uzun vadeli etkileri HBV enfeksiyonu, tedavi kombinasyonları ve Patogenez değerlendirilmesi için geçerlidir.

Biz birincil insan Kupffer hücreleri ve/veya tetkikine ve onların enfeksiyon HBV ile uzun vadeli kültür için basit ve çok yönlü bir platform tanımlamak. Birincil insan hücreleri kollajen kaplı polistren iskele sürekli büyüme orta (Şekil 1a) hücrelerle perfuses bir mikrosıvısal plaka derleme içindeki seribaşı.
Genellikle sadece sınırlı bir süre için geleneksel kültür sistemlerinde istikrarlı, PHH işlevsel olarak uzun bir süre için muhafaza edilebilir. Fonksiyonel hepatositler tarafından salgılanan ve hepatik metabolizma değerlendirilmesi için en iyi işareti olarak kabul edilir, insan albümin, stabil ve son derece 3D kültürler tarafından gün 40 sonrası tohum kadar (Şekil 2) ifade edilir. Cocultures için belirli sitokinler (örneğin, IL6 ve TNFα) salgılanmasını Kupffer hücre işlevselliği ve canlılığı değerlendirilebilir. Sitokin üretim ölçmek için LPS-cocultures uyarılması üzerine yakalama tabanlı algılama araçlarının kullanımı (Şekil 3) tavsiye edilir.
Hücreleri genellikle 3 gün içinde işlevsel safra kanalcık ve tam hücre polarizasyon (Şekil 2) gösteren PHH tohum, hepatik microtissues oluştururlar. Onların fizyolojik hücre metabolizması istinat ek olarak, bu kültürler HBV enfeksiyonu için son derece duyarlı hale gelir. HBV DNA ve diğer kültür sistemleri, aksine diğer viral işaretleri 2 gün sonrası enfeksiyondan (Şekil 4) kolayca algılanabilir hale gelir. Viral enfeksiyon salgılanan işaretleri yanı sıra, hepatosit içeren iskele alınabilir kültürler ve viral antijenler ayirt tespiti için kullanılan (örneğin, HBsAg, HBcAg) (Şekil 4). Nerede geleneksel hepatosit kültürler aşılama ile en az 500 HBV GE hücre ve % 2 DMSO ek ücret isteyen ve % 4 PEG, 0,05 HBV GE az olan DMSO veya PEG (Şekil 4) 3-b kültürlerde zorunluluğu olmadan enfeksiyon başlatmak mümkün.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> Şekil 1: 3-b karaciğer-on-a-chip kültürlerin Set-up. (bir) Bu bir Şematik düzeni kültür plaka Meclisi mikrosıvısal dolaşım kurulmasını sağlamak için 's. (b) Bu panel gösterir de dahil olmak üzere kültür wells, yakından görmek filtre kağıdı, iskele ve istinat yüzük. (c) Bu panel kültürler tohum önce plaka denge süreci gösterir. Sonraki iki panel (d) hepatosit monocultures ve (e) hepatosit/Kupffer hücre için cocultures tohumlama işlemi gösterir. (f) Bu panel çamaşır adımları fiş boşaltmaya karışan orta değişiklikler gösterir. (g) HBV enfeksiyonu kurulumu inoculum kaldırılması da dahil olmak üzere, bu panel gösterir. S.M. tohumlama orta, mm = bakım orta =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> Şekil 2: hepatik microtissue oluşumu ve hepatosit canlılığı. (bir) Bu panel gösterir takip microtissue oluşumu gösteren 3D hepatosit monocultures görüntülerini boyuna aydınlık alan tohumlama. (b) Bu panel gösterir ayirt görüntüleme çekirdeği (mavi) kültürler ve insan albumini (yeşil). (c) Bu panel boyuna toplam albümin gösterir, hem de hücre başına hepatosit monocultures, 40 gün boyunca albümin üretim ELISA tarafından belirlendiği şekilde ayarlanabilir. Gösterilen veriler ortalama ± SD vardır Bu rakam Ortega Prieto ve ark.4den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> Şekil 3: 3-b cocultures Kupffer hücre işlevindeki. Bu paneller göstermek salgılanmasını (bir) IL6 ve (b) TNFα hepatosit monocultures ve 11 gün insan manyetik kullanarak belirlenen tohum sonrası gün 9 mesaj tohum, exogenously eklenen LPS karşılık olarak hepatosit/Kupffer hücre cocultures Luminex tahlil. Bu rakam Ortega Prieto ve ark.4den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> Şekil 4: HBV enfeksiyonu karaciğer-on-a-chip kültürlerde. (bir) Bu panel ayirt mikroskobu algılama HBcAg (kırmızı), HBsAg (yeşil) ve çekirdek (mavi) kültürleri ile HBV enfeksiyonu izleyen 10 gün gösterir. (b) Bu panel HBV DNA bir miktar olarak kültür supernatants tarafından belirlenen enfeksiyon, farklı çeşitlilikler kullanarak HBV enfeksiyonu kültürlerin duyarlılık gösterir. (c) Bu panel HBV pgRNA temizlik gen RPS11 göre boyuna birikimi miktar gösterir. Gösterilen veriler ortalama ± SD vardır Bu rakam Ortega Prieto ve ark.4den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Bu yöntem hepatotropik enfeksiyonlar ve karaciğer hastalığı alanlarında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Karaciğer yerleşik hücre popülasyonlarının viral patogenezi, boyuna infeksiyon kinetiği, viral replikasyon mekanizmaları, immün invazyon, fizyolojik model sistem ve ilaç testi çalışmalarına katkısı gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı hepatik mikroortamı özetleyebilme yeteneğidir.Uzun süre korunabilen ve fizyolojik olarak hepatit B enfeksiyonuna doğal olarak duyarlı dır. Bu daha önce hepatit B alanında temel bir kısıtlama olmuştur. Bu tekniğin etkileri HBV enfeksiyonunun tedavisine veya tanısına kadar uzanır, çünkü ilaç testi çalışmaları uzun süre fizyolojik bir platformda yapılabilir.Bu, mevcut ve yeni tedavi stratejilerinin etkinliğini analiz etmekle birlikte sıralı ilaç tedavilerinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu yöntem hepatit B içine anlayış sağlayabilir, ve aynı zamanda diğer hepatotropik enfeksiyonlar da dahil olmak üzere hastalığın diğer çalışmalara uygulanabilir, karaciğer hastalıkları, veya ilaç metabolizması çalışmaları. Karaciğer dokusunun uzun süre başarılı bir şekilde sürdürülmesine olanak sağlamak için belirli ayrıntılara dikkat gerektirdiğinden, genellikle bu yönteme yeni gelen bireyler mücadele edecektir.Ve aynı zamanda özel araç ve ekipman aşinalık. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Tabakların montajı, hücrelerin çözülmesi ve tohumlanması da dahil.Karaciğer kaynaklı hücrelerin uzun vadeli kültür dahil adımlar yeni bir kültür sistemi kullanırken zor olduğundan. İlk olarak, hem kompresör ve vakum pompası karaciğer çip platformu ile ilişkili açın. Plakaları monte etmek ve dengelemek için cam bir tüp dolabına ilerleyin.Mikroakışkan plakaları aseptik olarak monte etmeye başlamak için plaka tabanına steril bir membran yerleştirin. Steril membranın taban plakasının iki pimi üzerinde düzgün bir şekilde dayandığından emin olun. Sonra iyi içeren üst plaka ekleyin.Steril bir plaka kapağı ekleyin. Ve otomatik bir hassas tork kullanın, 33 pound olarak ayarlayın. Plakanın tabanındaki vidaları sıkmak için spiral sıkma sırası kullanmak.Manuel tork kullanarak, tüm vidaların 35 pound'a kadar sıkılmış olduğundan emin olun. Daha sonra, önceden ısıtın hepatosit tohumlama orta için 37 santigrat santigrat astar önce. Tamamen monte edilmiş plakayı yıkama yuvasına yerleştirin.Ve plakanın tamamen içeri yediğinden emin ol. Plakaa asal olarak her kuyunun rezervuar tarafına 400 mikrolitre hepatosit tohumlama ortamı ekleyin. Bundan sonra, saniyede bir mikrolitre de 3,5 dakika yukarı yönde akış başlatın.Plakanın kenarındaki kırmızı göstergeler mikroakışkan dolaşımın düzgün çalışıp çalışmadığını gösterir. Orta plaka hücre büyüme tarafına pompalanır sonra, hepatosit tohumlama orta ek 1,2 mililitre ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirme istasyonuna dikkatlice aktarın.16 saat boyunca saniyede bir mikrolitrelik bir akış hızında yukarı yönde akışı başlatın. Bundan sonra, bir yıkama rıhtımına plaka aktarın. Yavaşça herhangi bir kabarcıklar ortadan kaldırmak için yukarı ve aşağı pipet.Steril bir forceps kullanarak, her kuyuya steril yuvarlak filtre kağıdı ekleyin. Sonra her kuyuya bir hücre ek iskelesi ve bir istinat halkası ekleyin. Her iyi aşağı itmek ve yerine istinat halkaları ve iskeleler kilitlemek için steril bir piston kullanın.Sonra, tüm orta aspire. Ve yavaşça iskele üzerinde önceden ısıtılmış hepatosit tohumlama orta 400 mikrolitre ekleyin. 3 1/2 dakika boyunca saniyede bir mikrolitre aşağı doğru akışı başlatın.Plakanın rezervuar tarafında pompalanan tüm orta aspire. Her kuyuya 1,4 mililitre hepatosit tohumlama ortamı ekleyin. Daha sonra 1,6 mililitreye kadar kuyu başına toplam hacmi getirmek için plakayı rıhtıma geri döndürün.İlk olarak, hepatosit eritme orta ve hepatosit tohumlama orta 37 santigrat ısıtın önceden ısıtın. Daha sonra, tedarikçinin talimatlarına göre birincil insan hepatositbir şişe eritme. Bir cam tüp dolap, hepatosit tohumlama orta bir mililitre hücreleri resuspend.Sonra yeniden askıya alınan hücreleri buza yerleştirin. Trypan mavisi kullanarak, hücrelerin canlılığının %90'ın üzerinde olduğundan emin olmak için hücreleri sayın Tam olarak monte edilmiş plakayı yıkama yuvasına aktarın. Ve kuyulardan tüm orta aspire.Hücreleri buzdan alın ve her kuyuya 500 mikrolitrelik hepatosit tohumlama ortamına 600.000 hepatosit ekleyin. Saniyede bir mikrolitrelik bir akış hızında aşağı doğru akışı başlatın. Her kuyuya 900 mikrolitre hepatosit tohumlama ortamı ekleyerek her bir kuyudaki toplam hacmi 1,6 mililitreye getirin.Plakayı 37 santigrat derecede ve %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirme istasyonuna aktarın. Sekiz saat boyunca saniyede bir mikrolitrelik bir akış hızında aşağı doğru akışı başlatın. Bundan sonra, sekiz saat boyunca saniyede bir mikrolitre lik bir akış hızıyla yukarı doğru akışı tersine çevirin.Daha sonra plakayı yıkama yuvasına aktarın ve kuyulardan tüm ortamı aspire edin. Her kuyuya 400 mikrolitre hepatosit bakım ortamı ekleyin. Ve 3,5 dakika boyunca saniyede bir mikrolitrelik bir akış hızıyla aşağı doğru akışı başlatın.Sonra, rezervuar tüm orta aspire ve hepatosit bakım ortamı 1.4 mililitre ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirme istasyonuna aktarın. 48 saat boyunca saniyede bir mikrolitre lik bir akış hızında yukarı yönde akışı başlatın.48 saat sonra, çamaşır yuvasına aktararak plakayı yıkayın. Kuyulardan tüm orta aspirat. Ve 400 mikrolitre bakım ortamı ekleyin.Ve saniyede bir mikrolitrede 3,5 dakika boyunca aşağı doğru akışı başlatın. Daha sonra kuyuların rezervuar tarafında görünen tüm ortamı aspire edin. Hepatosit bakım ortamı 1.4 mililitre ekleyin.Daha sonra plakayı nemli kuluçka makinesindeki yanaşma istasyonuna geri aktarın. 48 saat boyunca saniyede bir mikrolitre lik bir akış hızında yukarı yönde akışı başlatın. Bu yıkama ve değiştirme işlemini kullanarak ortamı her 48 saatte bir değiştirin.Birincil insan hepatositler genellikle konvansiyonel kültür sistemleri kullanırken zaman sınırlı bir süre için sadece istikrarlı. Ancak, burada açıklanan protokol kullanılarak, işlevsel olarak uzun süreler boyunca muhafaza edilebilir. İnsan albuminfonksiyonel hepatositler tarafından salgılanır ve hepatik işlevselliği değerlendirmek için en iyi belirteç olarak kabul edilir.Albumin en az 40 post-seeding gününe kadar 3D kültürler tarafından stably ve yüksek ifade olarak görülür. Ortak kültürler için, Kupffer hücrelerinin işlevselliği ve canlılığı belirli sitokinlerin salgısını ölçerek değerlendirilir. Burada görüldüğü gibi, IL-6 ve TNF alfa ölçülen düzeyleri hücrelerin işlevsel olarak korunur ve canlı olduğunu göstermektedir.Fizyolojik hücresel metabolizmalarını korumanın yanı sıra, bu kültürler HBV enfeksiyonuna karşı son derece duyarlı hale geldi. HBV DNA ve diğer viral belirteçler kolayca gün iki post-enfeksiyon dan tespit edilebilir. Konvansiyonel kültürler DMSO ve PEG ile desteklenen en az 500 HBV genom eşdeğeri ile aşılama gerektirirken, bu 3B kültürler 05 ekimemiş genom eşdeğeri kadar az enfekte olur.Viral enfeksiyonun salgılanan belirteçlerine ek olarak, hepatosit içeren iskeleler bu kültürlerden alınır. İmmünofloresan mikroskopisi bu iskelelerin viral antijenler içerdiğini ortaya koymaktadır. Bu prosedürü çalışırken, hücre ölümü önlemek için tohumlama önce hepatositler ele nazik olmayı unutmayın önemlidir.Ayrıca, plakaların doğru bir şekilde monte edilmesini ve tüm akış kanallarının hepatositleri tohumlamadan önce doğru ortam dolaşımına izin verdiğinden emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben ek soruları cevaplamak için immünoreskence gibi başka yöntemler de uygulanabilmektedir. Doku içindeki enfekte hücrelerin yeri ve sıklığı da dahil.Hepatositlerin fizyolojik durumu da sıkı kavşak proteini ZO-1 dahil albumin veya hepatik yapılar için boyama ile değerlendirilebilir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, viroloji alanındaki araştırmacıların fizyolojik 3D model sisteminde hepatit B enfeksiyonunu ve bağışıklık yanıtlarını keşfetmelerinin önünü açar. Hepatit B virüsü ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın ve önceki aşılama, uygun PPE kullanımı ve uygun biyogüvenlik yönergeleri altında çalışma gibi önlemler bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.

liver-on-chip-cultures-primary-hepatocytes-kupffer-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Burada HBV yaşam döngüsünün erken aşamalarında izlemek için yeni geliştirilmiş hepatit B virüsü (HBV) muhabiri sistemini açıklar. Vitro sistemde BASİTLEŞTİRİLMİŞ yüksek verimli bir strateji kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması yardımcı olacaktır.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Burada, yetişkin farelerin birincil hepatositler izole etmek için bir enzimatik yaklaşım göstermek ve biz ELISA ve gerçek zamanlı PCR kullanarak bir inflamatuvar yanıt ölçümü açıklar.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

Bu el yazması, insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα'yı ifade eden 293T-NE-3NR' ler ve geleneksel hepatik hücreler (HepG2-NE, insan NTCP'yi ifade eden) yeni mühendislik temalı 293T hücreleri (293T-NE-3NR) enfeksiyonu için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Hepatik Olmayan 293T-NE-3NR Hücrelerinde Hepatit B Virüs Enfeksiyonunun Modelilmesi

Bu protokol, özel bir intravenöz kateter, standartlaştırılmış steril tek kullanımlık tüp, gerçek zamanlı izleme ile tamamlanan sıcaklık kontrolü ve izole primer sıçan hepatositlerinin yaşayabilirliği, verimi ve işlevselliğindeki tutarlılığı artırmak için iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için bir alarm sisteminin kullanımını detaylandırmaktadır.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Fare hepatatitlerinden uzun süreli ek vitro 3D organoid kültür sistemi kuruldu. Bu organoidler shRNA/ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu ile geçiş ve genetik olarak manipüle edilebilir.

Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu

Konakçı sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit ile bağlanma afinitesini (KD) ölçmek için izotermal titrasyon kalorimetrisini kullanarak, viral giriş öncesi ve sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen anti-hepatit B virüsü (HBV) bileşiklerini taramak için bir protokol sunuyoruz. Antiviral etkinlik, viral yaşam döngüsü belirteçlerinin (cccDNA oluşumu, transkripsiyon ve viral montaj) baskılanması yoluyla belirlendi.

Terapötik Hedef Olarak Polipeptitin Sodyum Taurokolat Kotransportasyonu Yoluyla Hepatit B Virüsü Girişini İnceleyen Yetkin Bir Hepatosit Modeli

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Burada, fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin noninvaziv in vivo görüntülemesine izin veren bir platformu tarif ediyoruz. İş akışı, birincil karaciğer hücrelerinden sferoidlerin üretilmesinden fare gözüne transplantasyona ve konfokal mikroskopi ile hücresel çözünürlükte in vivo görüntülemeye kadar uzanır.

Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

Bu protokol, bir sıçan modelinde optimize edilmiş iki aşamalı kollajenaz karaciğer perfüzyon tekniği sunar ve in vitro uzun süreli 3D organoid kültürü için izole hepatositlerin kullanımını gösterir.

Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür

Öğrenin, karaciğer-on-a-chip kültürleri ile Hepatit B virüs enfeksiyonunu birincil hepatositler ve Kupffer hücreleri üzerinde nasıl araştırılır. Bu yöntem, hepatotropik enfeksiyonları ve karaciğer hastalıklarını fizyolojik bir modelde incelemek için uzun süreli doku bakımı sağlar.

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Daha fazla video keşfet