C. elegans Germline timidin Analog EdU ile hücre döngüsü analizi

Bu yöntem C.elegans hücre döngüsü ve germ hattı kök hücre popülasyon dinamikleri hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları transgen gerektirmeyen, immünoresan boyama ile uyumlu olması ve birçok farklı koşulda hücreleri incelemek üzere modifiye edilebilmektedir. Bu yöntemin Scheda laboratuvarında kullanıldığını ilk gördüğümde çok heyecanlandım.

Bu yöntem C.elegans hücre döngüsüne ışık sağlasa da, yaşlanma, beslenme veya değiştirilmiş genotipler hakkında daha geniş sorulara da uygulanabilir. Genellikle bu yönteme yeni laboratuvarlar ilk deyim veya C.elegans hematoksilin boyama ile mücadele edebilir. M9 tampon 100 mililitre 100 mililitre ve taze yetiştirilen mg 1693 E.coli kültürü dört mililitre uygun takviyeleri 10 milimolar EdU 200 mikrolitre eklemek için steril tekniği kullanarak başlayın.

İdyodiscious yapma EdU ve timidin takviyesi arasında hassas bir denge gerektirir. Timidin miktarı E coli'nin iyi büyümesi için yeterli olduğu için, EdU miktarı tesviyeye karşı sağlam kalkan için yeterli olmalıdır. 37 santigrat derece ve 200 RPM en fazla 24 saat sonra, santrifüj için iki ila dört steril 50 mililitre konik tüpler arasında kültür bölmek için steril tekniği kullanın.

Pellatin dört mililitre taze M9 tamponu yeniden askıya alın ve aynı pipeti kullanarak e Coli MG1693 solüsyonunu tek tek oda sıcaklığının merkezine 60 mililitre M9 A koruma petri kaplarına doğru etiketlenmiş Yaklaşık 8 damla EdU uygulayın. EdU etiketli bakterileri nematodlara beslemek için, C.Elegans'ı nematod büyüme ortamı ndan 1,5 mililitrelik bir tüpe yıkamak için taze PBS kullanın ve hayvanların yerçekimine göre kısa bir süre yerleşmelerine izin verin. Hayvanları bir mililitre PBS ile bir ila iki kez yıkayın ve nematodları Küçük bir PBS damlasında EdU çimlerinin merkezine aktarmak için cam pasteur pipetkullanın.

Sıvının emilmesi için birkaç dakika bekleyin ve deneysel protokole göre 20 santigrat derecede en az 30 dakika kültür kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, EdU kültür plakasından solucanları cam bir kesme kabına atmak için iki mililitre PBS kullanın. Diseksiyon ve daha önce açıklandığı gibi nematod gondadların fiksasyonu sonra, pbs ile küçük bir mililitre borosilikat cam tüp ve uzun bir cam pastör pipet durulayın 0.1% ara 20 ve PBS tween küçük bir miktar tüp sabit gonadlar aktarmak için pipet kullanın.

Santrifüj ile gonaads toplamak ve gonad pelet rahatsız etmeden mümkün olduğunca supernatent kaldırmak için uzun, çizilmiş cam mera pipet kullanın. EdU algılama için, kinlere 100 mikroLitre edu kokteyl ekleyin ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakikalık bir kuluçka için laboratuvar filmi ile tüp kapağı. Kuluçka sonunda, 100 mikroLitre reaksiyon durulama tamponu ve dört kez pbs arabelleğe bir mililitre ile gondanları bir kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, numuneye DAPI ile takviye edilmiş 25 mikroLitre anti-fade montaj ortamı ekleyin. Orta gonadlar üzerinde yerleşme iken, standart bir cam mikroskop slayt üzerine büyük bir% 2.5 agarose ped yerleştirin. Sonra ikinci bir slayt ile düzleştirmek.

Daha sonra, uzun bir cam pastör pipet kullanın ve parçaya gonadlar aktarırken örnek kaybını en aza indirmek için pipet dar ucunda sıvı ve gonads tüm tutun. Bir kürdan yapıştırılmış bir kirpik kullanarak, agarose ped üzerinde gonaddağıtmak ve herhangi bir toz parçacıkları kaldırın. Sonra yavaş yavaş gonadlar üzerine dikdörtgen cam kapak kayma indirin, hava kabarcıkları önlemek için özen, ve bir laboratuvar dokusu ile herhangi bir fazla çözelti kaldırarak.

Hücreleri üç boyutta saymak güvenilir bir şekilde pratik gerektirir. Fiji'nin hücre sayacı eklentisi ve kopyaları kaldırmak için hücreleri işaretler gibi bir komut dosyası nın kullanılması, sayımların tekrarlanabilir hale alınmasına yardımcı olur. Kapak fişinin bir gecede yerleşmesine izin verdikten sonra, her çekirdeği elle saymak için hücre sayacı eklentisini ve Fiji'yi kullanın, her çekirdeği fosfohistonin varlığına veya yokluğuna göre etiketleyerek üç EdU veya pregenetor bölgesi hücre etiketlemesi.

EdU sinyali DAPI sinyali ile eş-lokalize. Bazı çekirdeklerde EdU sinyali tüm kromozomları kapsarken, diğer çekirdeklerde EdU sinyali, s-fazın geç saatlerinde çoğalan X kromozomu üzerinde bir ila iki parlak punkta yada yerelleşir. Başarılı bir 30 dakikalık etiketlemeden EdU sinyali pregenetor bölgesindeki çekirdeklerin yaklaşık yarısına lokalize olur.

Teknik yabani tip genç yetişkin hayvanlarda sürekli çalışır iken, 5 günlük hermafroditlerin önemli bir kısmı 30 dakikalık EdU darbe etiketlemek için başarısız olur. G2'nin süresi, M fazında edu pozitif olan çekirdek yüzdesi analiz edilerek, ortanca ve maksimum G2 süresinin hesaplanmasına olanak sağlar. G2 ve G1'in süresi, edu pozitif olan pregenetor bölge çekirdeklerinin yüzdesi ile tahmin edilebilir ve bu da birleştirilmiş fazların maksimum süresinin hesaplanmasına olanak sağlar. Bu yordamı denerken, deneysel değişkenliği en aza indirmek için aynı edu yemeklerini kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, ek antikorlar ile boyama gibi diğer yöntemler yapılabilir veya hücre döngüsü, hücre kaderi veya sinyal yolları hakkında ek sorulara cevap. Nükleiciit analogları ve parafermeldahit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve nitrol eldiven takmak gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.