Name: Kültür ve manipülasyon O9-1 nöral Crest hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin fare O9-1 nöral krest hücrelerinin kültürünü, farklılaşmasını ve siRNA ile CRISPR-Cas9 genetik manipülasyon tekniklerini. Bu protokoller nörobilim araştırmaları için güçlü bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, Teksas Kalp Enstitüsü, Bilimsel yayınların editoryal destek sağlamıştır. Biz de aşağıdaki finansman kaynakları teşekkür: Amerikan Kalp Derneği'nin Ulusal Merkezi bilim adamı kalkınma hibe (J. Wang 14SDG19840000), (J. Wang için Rolanette ve Berdon Lawrence kemik hastalığı Texas Program 2014 Lawrence Araştırma Ödülü ) ve Ulusal Sağlık (DE026561 ve DE025873 J. Wang, DE016320 ve DE019650 R. Maxson için) Enstitüleri.

<ol><li>Achilleos, A., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cells%3A+discovery%2C+properties+and+potential+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy.</a> Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Dupin, E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X03001138">Multipotentiality of the neural crest.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).</li>
<li>Santagati, F., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+neural+crest+and+the+building+of+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cranial neural crest and the building of the vertebrate head.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).</li>
<li>Cordero, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+neural+crest+cells+on+the+move%3A+their+roles+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).</li>
<li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+birth+defects%3A+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).</li>
<li>Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+migrating+into+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The neural crest migrating into the twenty-first century.</a> Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).</li>
<li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quo+vadis%3A+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li>
<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+neural+crest%3A+a+multigene+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li>
<li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+network+during+neural+crest+induction%3A+from+cell+specification+to+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li>
<li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+neural+crest%3A+achieving+specificity+in+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li>
<li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+progenitors+and+stem+cells%3A+from+early+development+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li>
<li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li>
<li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li>
<li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li>
<li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+early+human+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li>
<li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-activated+kinase+1+%28Tak1%29+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
<li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway%3A+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li>
<li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo%2FYap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).</li>
<li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li>
<li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+organ+development%2C+homeostasis%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li>
<li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li>
<li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208(2016).</li>
<li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li>
<li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%2C+but+not+collagen+I%2C+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).</li>
<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li>
<li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

NCC sırasında embriyonik morfogenez farklı doku ve organların için çok yönlü ve önemli bir katkıda bulunuyor. O9-1 hücre kültürünü birçok farklı hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel tutar ve NCCs, yapım o gen fonksiyon ve moleküler NCCs Yönetmelikte çalışmak için yararlı vitro aracı vivo içinde özelliklerini taklit eder. O9-1 hücrelerinin farklı durum farklı nöral crest Döl içinde vivo, O9-1 hücre kültürü şartlarına bağlı olarak aynı olmayabilir. O9-1 hücreleri multipotent devlet sigara ay...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Nöral crest hücrelerdir (NCCs) multipotent gibi kök hücreleri bir göçmen görmeyeteneği ve embriyonik gelişim sırasında geçici varlığı. NCCs yüzey ektoderm ve nöral tüp arasında köken ve embriyo diğer bölümlerine embriyonik geliştirme1sırasında geçiş. İşlevsel etki alanları üzerinde bağlı olarak, NCCs birkaç kafatası dahil olmak üzere farklı türleri, gövde, vagus, sakral ve kardiyak NCCs sınıflandırılabilir. Buna ek olarak, NCCs düz kas hücreleri, kemik hücreleri ve nöronlar, gibi birden çok hücre soy içine ayırt etmek ve çeşitli dokularda2,3' e neden olmaktadır. NCCs gelişimi çeşitli moleküler sinyalleri tarafından ince ayar morfogenetik olaylar karmaşık bir dizi ile karakterizedir. NCCs karmaşık düzenlenmesi ve çok sayıda yapıları onların önemli katkıları göz önüne alındığında, NCC geliştirme bozukluk yaygın konjenital Doğum kusurları, tüm insan konjenital Doğum kusurları yaklaşık % 30 için hangi hesabı açabilir. Anormallikler nöral kret geliştirme sırasında yarık dudak/kusurlu damak için neden olabilir burun oluşumu, sendromlar, kusurları bir arızalı kardiyak çıkış yolu veya bile bebek ölüm1,4,5, gibi 6 , 7. moleküler mekanizmaları NCC gelişiminin en önemli kusurları NCC geliştirme neden olduğu hastalıklar için tedavi geliştirmek için önemli noktadır. 8,9,10,11,12,13,14 çeşitli vitro ve in vivo kullanılarak yaklaşımlar ,15, önemli ilerleme NCC araştırma yapılmıştır. Vivo, tavuk, amfibiler, zebra balığı ve fareler, hayvan modeller NCCs1araştırmak için kullanılmıştır. Ayrıca, ilk insan embriyo gelişimi16NCC geçiş sürecinin çalışmaya insan embriyosu kullanılmıştır. Vitro, hücre modelleri hasta subkutan yağ, kökenli insan NCCs gibi NCCs için Parkinson hastalığı17araştırmak için kullanılmıştır. Aslında endojen NCCs E8.5 fare embriyo18izole kitle kültürü elde, O9-1 kkk satır okuyan NCCs. önemlisi, Sigara ayırt kültür koşullar altında bir güçlü hücre model, O9-1 hücreler Multipotent kök gibi NCCs. Ancak, değişen kültür şartlar altında O9-1 hücreleri içine ayırt edici hücre tipleri, düz kas hücreleri, dokusunu, kondrosit ve Gliyal hücreler18gibi farklı. Bu özellikler göz önüne alındığında, O9-1 hücreleri moleküler mekanizması kafatası yüz kusurları19,20soruşturma gibi NCC ilgili çalışmaları için genel olarak kullanılmıştır.
Detaylı iletişim kuralları O9-1 hücreleri bakımı, farklı hücre tipleri O9-1 hücreleri ayırt ve gen fonksiyon kaybı çalışmalar CRISPR-Cas9 genom düzenleme ve küçük müdahale RNA (siRNA) ile gerçekleştirerek O9-1 hücreleri manipüle sağlamak burada,- devirme teknolojileri aracılık. Temsil edici bir örnek olarak, Yap ve Taz kaybı--fonksiyonu çalışmaya O9-1 hücreleri kullanımı açıklanmıştır. Yap ve Taz hücre çoğalması, farklılaşma ve Apoptozis kritik bir rol oynamaktadır yolu sinyal Hippo aşağı akım effectors vardır. Hippo yol geliştirme ve homeostasis birkaç farklı doku ve organları, hem de farklı hastalık20,21,22,23 patogenezinde önemli olduğu da gösterilmiştir ,24,25,26,27,28. Hippo sinyal bir çekirdek bileşenleri tümör baskılayıcı steril 20 benzeri kinaz Mst1/2, WW etki alanını içeren Salvador iskele protein ve büyük tümör baskılayıcı homolog (Lats1/2) kinaz içerir. Su aygırı sinyal Yap ve Taz etkinliği engeller ve onların yıkımı sitoplazmada teşvik etmektedir. Hippo üzerinden baskı Yap ve Taz çekirdekleri translocate ve transkripsiyon Co aktivatörler işlev. Biz son zamanlarda gösterdi ki özellikle Wnt1cre kullanarak effectors Yap ve Taz Mouse NCCs sinyal Hippo ihracı ve Wnt1Cre2SOR sürücüleri ile şiddetli E10.5, embriyonik ölümcül sonuçlandı Fasiyal kusurları20. Biz de rolü Yap ve NCCs Taz araştırmaya O9-1 hücreleri kullanarak çalışmaları gerçekleştirdiniz. NCC yayılması ve farklılaşma, Yap ve Taz nakavt yap ve Taz işlevinde çalışmaya hücreleri O9-1 hücrelerde siRNA kullanarak oluşturulan ve Yap nakavt hücreleri CRISPR-Cas9 genom düzenlemeyi kullanarak oluşturulan. Aynı gen fonksiyon kaybı stratejileri farklı hedef genlerin diğer yolları içinde uygulanabilir. Buna ek olarak, işlev kazanç çalışmaları ve transfection deneyleri de gen fonksiyon ve yönetmelik çalışmaya O9-1 hücrelere uygulanabilir. Burada açıklanan protokoller müfettişler tarafından multipotent stemness korumak için O9-1 hücre kültürü çalışmalarının, diğer hücre tipleri farklı kültür koşullar altında içine O9-1 hücreleri differentiating için ve için gen işlev eğitim kılavuzları olarak kullanılmak amacıyla ve NCCs moleküler mekanizmaları.

<table><tbody><tr><td>Aktif STO besleyici hücreler</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1503</td><td>Mitomisin C-inaktive edilmiş formda da mevcuttur, katalog # ATCC 56-X</td></tr><tr><td>O9-1 fare kraniyal nöral krest hücre hattı</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz</td><td>Hiklon</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS (fetal sığır serumu)</td><td>Millipore Sigma</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin - streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA HBSS'de %0.25</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu) olmadan kalsiyum veya magnezyum</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler (MEM NEAA) 100Xx</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO lösemi inhibitör faktörü (LIF) 106 birim / mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan fibroblast büyüme faktörü-bazik (rhFGF-basic)</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrisi</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsülfoksit)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x)</td> <td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Minimum esansiyel ortam, Earle tuzları, ribonükleositler, deoksiribonükleositler ve L-glutamin</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-041057</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Hedeflemeyen Havuz</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-046247</td><td></td></tr><tr><td>FCS (fetal buzağı serumu)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ITS (insülin-transferrin-selenyum)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF-b3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMP2 (kemik morfogenetik proteini 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Deksametazon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 takviyesi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kültür ve manipülasyon o9-1 nöral crest hücre

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Nöral crest hücreleri (NCCs) da farklı hücre türleri ayırt birden fazla doku ve organların ortaya çıkmasına multipotent kök hücreleri geçiş vardır. O9-1 hücre kültürünü endojen türetilmiştir embriyonik NCCs fare ve onun multipotency korur. Ancak, belirli koşullarda O9-1 hücreler farklı hücre türleri ayırt edebilir ve araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılmak. Son zamanlarda, fare çalışmaları ve O9-1 hücre çalışmaları kombinasyonu ile biz yolu effectors Yap ve Taz nöral crest kaynaklı kraniyofasiyal gelişiminde önemli rol oynarlar sinyal Hippo göstermiştir. O9-1 hücreler için kodlamayla işlem diğer hücre hatlarında kullanılan daha karmaşık olmakla birlikte, O9-1 hücre kültürünü NCCs içinde vitroaraştırılması için güçlü bir modeldir. Burada, farklı hücre tipleri, düz kas hücreleri ve dokusunu gibi içine O9-1 hücreleri differentiating için protokol yanı sıra kendi stemness korumak için O9-1 hücre kültürünü kültür için bir iletişim kuralı mevcut. Buna ek olarak, iletişim kuralları CRISPR-Cas9 silme ve küçük müdahale RNA-aracılı nakavt kullanarak O9-1 hücrelerde gen fonksiyon kaybı çalışmaları gerçekleştirmek için açıklanmıştır.

Devirme ve nakavt deneylerimiz amacı Yap ve Taz kaybı--fonksiyonu O9-1 hücrelerdeki etkilerini incelemek oldu. Devirme ve nakavt deneyler önce emin olmak bazal medya ve (örneğin, Şekil 1ve kurtarılan O9-1 hücreleri gösterildiği gibi bütün tabağı kapsayacak şekilde membran matris ihtiyaçlarını yukarıda açıklandığı gibi kültür O9-1 hücreler için hazırlamak zorundayız sıvı azot Şekil 2gösterildiği gibi). Biz devirm...

O9-1 multipotent fare nöral crest hücre çizgidir. Burada O9-1 hücre kültürü çalışmalarının, O9-1 hücreleri belirli hücre türleri ayırt ve genetik olarak siRNA aracılı nakavt veya CRISPR-Cas9 genom düzenleme kullanarak O9-1 hücreleri manipüle ayrıntılı adım adım iletişim kuralları açıklar.

Kültür ve manipülasyon O9-1 nöral Crest hücre

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

O9-1 hücre hattı in vitro nöral krest hücreleri incelemek için çok yararlı bir araçtır. Bu araştırma çeşitli kullanımda uygulama geniş bir yelpazede kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir. O9-1 hücrelerinin kolay erişim ve deneyler için yeterli hücre sayılarını hızlı bir şekilde elde etme gibi bariz avantajları vardır, bu da onu nöral krest hücrelerinin in vitro çalışmalarında ücretsiz olarak güçlü bir yöntem haline getirir.Başlamak için, metin protokolüne göre, O9-1 hücre kültürü için bazal ortam hazırlayın. Daha sonra bazal ortamı filtreleyin ve ışıktan korumak için folyoya sarın. Bundan sonra, metin protokolüne göre etkinleştirilen STO hücrelerinden koşullandırılmış bazal ortam toplayın.İlk olarak, iki saat boyunca buz üzerinde bodrum membran matris bir aliquot eritin. Daha sonra, 0.5mg/ml nihai konsantrasyona% 10 FBS ile filtresteril DMEM ile bodrum membran matris seyreltmek. Bir saat oda sıcaklığında bodrum membran matris ile plaka katlayın.Daha sonra, plaka yatırırken bodrum membran matris aspire. Plakaları 30 derecede 30 dakika kurutun. Taban membran matrisini tabağa eklerken, çözeltinin hücre özelliklerini korumak ve deneyler arasında gereksiz farklılıklardan kaçınmak

culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

In vitro nöral krest kök hücreler (NCSC) yetiştirmek için özel bir orta (NCSCM) gereklidir. NCSCM önemli bir parçası civciv embriyo ekstraktı (CEE). Biz burada, izolasyon, maserasyon, santrifüj ve filtrasyon işlemleri gibi ayrıntıları da dahil olmak üzere saf ve kaliteli CEE maksimize miktarda üretmek için doğru teknikleri anlatıyoruz.

Civciv Embriyo Özü murin Sinir Crest Kök Hücre Yetiştiriciliği Üretimi

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını...

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu video, nöral kök hücrelerde ilgilenilen belirli genleri susturmak ve bunları uygun farklılaşma ortamı kullanarak istenen hücre tiplerine farklılaştırmak için küçük enterferans yapan RNA'nın (siRNA) kullanımını göstermektedir. Bu prosedür, nöral kök hücrelerin farklılaşma sürecinde belirli genlerin kritik rolünün incelenmesini sağlar.

Nöral Kök Hücrelerde siRNA Aracılı Gen Susturma

Bu video, civciv embriyolarının orta beyin bölgesinden kraniyal nöral kıvrımları izole etmek için bir tekniği göstermektedir. Nöral kıvrımların ayrıntılı bir diseksiyon sürecini, bunların yerleştirilmesini ve fibronektin kaplı lameller üzerine bağlanmasını ve ardından nöral kıvrımlardan nöral krest hücre göçünün gözlemlenmesini sunar.

Nöral krest hücre kültürü için bir civciv embriyosundan kraniyal nöral kıvrımların izole edilmesi

Bu protokol, öncelikle hücre göçü çalışmaları için fare modellerinden kranial nöral krest hücrelerinin diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kullanılan canlı görüntüleme tekniklerini ve hız ve hücre şekli değişikliklerinin analizini anlatıyoruz.

Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi

Bu protokolde, postgangliyonik sempatik nöronların insan pluripotent kök hücrelerinden üretimi için istikrarlı ve yüksek verimli bir ayırım stratejisi tanımlıyoruz. Bu model nöronlar birden fazla otonom bozuklukların çalışmalarının kullanımı için kullanılabilir hale getirecek.

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

Nöral yaralanmadan sonra koku alma glia (OEG) nörojeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir in vitro model sunuyoruz. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçleri analiz ederek, OEG monolayerleri üzerinde axotomized adult retinal ganglion nöronlarının (RGN) bir kokülatürüne ve daha sonra aksonal rejenerasyon çalışmasına dayanmaktadır.

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Bu çok yönlü protokol, civciv embriyolarından kraniyal nöral kıvrımların eksizyonu yoluyla göç öncesi nöral krest hücrelerinin (NCC'ler) izolasyonunu tanımlar. Kaplama ve inkübasyon üzerine, göçmen NCC'ler nöral kıvrım eksplantlarından ortaya çıkar ve basitleştirilmiş bir 2D ortamda hücre morfolojisinin ve göçünün değerlendirilmesine izin verir.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Bu protokol, nöral krest hücrelerinin hyaluronan bakımından zengin hücre dışı matrise in vivo göçünde rol oynayan moleküllerin fonksiyonel analizi için uygun bir in vitro migrasyon deneyini özetlemektedir.

In Vitro Hyaluronan Bakımından Zengin Hücre Dışı Matriksin Nöral Kret Hücre Migrasyonu Üzerine Etkilerinin İncelenmesi

Fare embriyonik kök hücrelerinden kraniyal nöral krest hücreleri üretmek için tekrarlanabilir boyutta nöroküreler üreten üç boyutlu (3D) bir in vitro farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu metodolojinin önceki protokollere kıyasla değişkenliği azalttığını ve kraniyal nöral krest hücre gelişimini incelemek için çoğullanmış test için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kraniyal Nöral Krest Hücreleri Çoğullanmış Test için Üç Boyutlu İn Vitro Farklılaşma Protokolü

Öğrenin fare O9-1 nöral krest hücrelerinin kültürünü, farklılaşmasını ve siRNA ile CRISPR-Cas9 genetik manipülasyon tekniklerini. Bu protokoller nörobilim araştırmaları için güçlü bir model sunar.

Kültür ve manipülasyon O9-1 nöral Crest hücre

Daha fazla video keşfet