Name: Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Keşfedin fare diyaframında sinir uyarımına yanıt olarak kas ve Schwann hücrelerinde kalsiyum sinyalini görüntüleme yöntemini. Bu teknik, nöromusküler kavşakta hücresel iletişimi incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser fonları sağlık (NIH) GM103554 ve GM110767 (T.W.G.) için ulusal Enstitüleri ve araştırma kaynakları 5P20RR018751 Ulusal Merkezi ve Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler 8 P 20 GM103513 (için G.W.H.) ile desteklenmiştir.

Hayvancılık ve deneyler için bakım ve kullanım laboratuvar hayvan ve IACUC University of Nevada, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak yapıldı.
1. zarlar ve frenik sinir transgenik fareler üzerinden hazırlanması
<ol><li>Transgenik fareler ve oligonükleotid astar genotip için bu fare satın alabilirsiniz. Not: Astar her bu fareler için "Bilgi" sayfasında listelenir.<ol>
<li>3 - için 6-ay-yaşlı fare uygun transgenik/knock-in Cre-sürücü alleli bir kopyasını ve sıfır koşullu GCaMP3/6 gen kopyalarını koşullu GCaMP3 bir veya iki kopyasını ifade aynı yaş ikinci bir fare ile ifade etmek üreme / 6 alleli ve Cre-sürücü alleli sıfır kopyalarını.</li>
		<li>Genotip Cre ve koşullu GCaMP3/6 gen var pups ve mark olanlar — bunlar bundan böyle çift transgenik fareler olarak adlandırılır (Örneğin, Myf5-Cre, koşullu GCaMP3)6. Not: Bu şekilde bir kopyasını Cre ve koşullu GCaMP3/6 gen ifade fareler tüm verileri türetmek. Diğer mutant farelerde (Örneğin, altını gizleme) bu haçlar eklerken bu özellikle önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çift-transgenik fareler uygun yaş olduğunda (Örneğin, Doğum sonrası gün 0 veya 5 [P0 veya P5] veya yetişkin), fareler onları makas (için fareler P10 genç) ile decapitating veya bir isoflurane inhalasyon odasında yerleştirerek ötenazi — ne zaman onlar are kuyruk çifti forseps ile pinching artık duyarlı, kurban için hazırlar.</li>
	<li>Hayvan tarafından işten çıkarma makas çifti ile kurban.</li>
	<li>Bölüm arasında hemen altında karaciğer ve kalp ve akciğerler iridectomy makasla hemen üstünde tüm hayvan kemiği.</li>
	<li>Uzak karaciğer, kalp ve akciğerler frenik sinir bir emme elektrot (yani, 1-2 cm) çizilmesi için yeterince uzun bir süre korumak için dikkatli olmak, incelemek. Not: Sol frenik sinir sol diyafram medial kısmı girer doku beyaz bir parça tanımlanabilir. Bu akciğerler kaldırırken kesilmiş olmalı değil. Şu frenik sinir bir parçası da superior vena cava içeren ve daha ince ve daha beyaz daha vena kava şerit içinde çalışır. Birlikte, her ikisi de sağ medial diyafram nüfuz.</li>
	<li>Daha fazla göğüs kafesi ve diyafram çevresinde ince ridge dışında vertebral sütunun kaldırın.</li>
	<li>Diyafram ve frenik sinir örnek bir microfuge tüp Krebs Ringer solüsyonu 1 µg/mL 594-αBTX 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık ile yerleştirin. Not: 594-αBTX bu toplama işlevlerine (kişisel gözlem) engellenmeden ACh reseptör (AChRs) Etiketler.</li>
</ol>2. uyarımı ve kas aksiyon potansiyelleri kayıt
<ol><li>Minutien iğne kullanarak, diyafram hareketsiz yoluyla 6 cm çanak üzerine silikon dielektrik jel ile kaplı ve ~ 8 mL oksijenli Krebs Ringer çözeltisi ile dolu ve mikroskop sahneye yerleştirin. Diyafram için 30 dk daha fazla Krebs-zil çözüm (8 mL/dk) ile sıvı. Not: Bu ilişkisiz 594-αBTX durulama yanı sıra doku diseksiyon sonra sakinleştiği.</li>
	<li>Kurulan yöntemleri7göre emme bir elektrot olun.<ol>
<li>Bir micromanipulator kullanarak 4 X büyütme, emme elektrot Sol frenik sinir üzerinde taşımak ve emme emme elektrot bağlı olduğu Tüp bağlı 5 mL şırınga varil dışarı çekerek uygulayın. Not: başarılı bir şekilde emme elektrot çizildiğinde, frenik sinir gergin olduğu. Uyarıcı üzerinde açmak ve frenik teşvik sinir el ile saygısız tarafından geçiş 1 x.</li>
		<li>Diyafram 1-Hz stimülasyon cevaben görsel olarak aydınlık alan aydınlatma ile incelenerek sözleşmeleri olduğunu emin olun. Eğer değilse, artımlı olarak bir görsel inceleme kas kasılması, tarafından doğrulanabilir bir supramaximal darbe ulaşmak için gerilim kolu çevirerek gerilim ayarlayın. Eğer hala görünür değil, şırınga ile sinir darbe ve tekrar emme uygulayarak çiz deneyebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perfüzyon açmak ve kas özgü myosin inhibitörü BHC6 veya voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti µ-conotoxin8 100 µM son bir konsantrasyon için ekleyin.<ol>
<li>100 µM BHC yapmak, DMSO 200 mM stokunun 4 µL pipet ve 1 mL Krebs Ringer çözeltisi predilute.</li>
		<li>1 mL Krebs Ringer çözeltisi yemek kaldırın.</li>
		<li>Prediluted BHC yemek için ekleyin. Not: Bu predilution GCaMP3 ifade hücreleri geçici olmayan floresan yanıtta su katılmamış DMSO tarafından indüksiyon önlemeye yardımcı olur.</li>
		<li>30 dakika bekleyin ve sonra başka bir 20-30 dk için taze Krebs-zil çözüm perfüzyon açın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kayıt elektrot hazırlayın.<ol>
<li>Eldiven giyiyor, bir borosilikat filamented bir dış çap (OD) ile 1 mm ve cam bir 0.4 mm iç çapı (ID) bir micropipette çektirmenin yerleştirin ve yerine kelepçe için aramalar sıkın. Çektirme kapıyı kapat.</li>
		<li>P-97 çektirme kullanarak programı aşağıdaki ayarı: 900 ısıda, çekme 120, 75 hızda, 250, 500 ve döngü olmadığını ek basınç anda. Not: Yazılım denetimleri amplifikatör kullanarak Resistance (R) ölçülür: veri toplama yazılımı direnç formülü V çözerek onaylar IR. = Yazılım denetleyicisi bir bilinen akım (ı) (genellikle 1 nA) elektrot üzerinden geçer ve böylece bize R. için çözmek etkinleştirme voltaj (V), değişikliği ölçer</li>
		<li>Embriyonik diyaframlar için direniş 60 MΩ yakın ve büyük diyaframlar, 10-20 MΩ için olduğundan emin olun. 3 M KCl ile kayıt elektrot yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 X büyütme oranında elektrot ikinci bir micromanipulator sahne karşı tarafta bir uyarıcı elektrot kullanarak kas içine daha düşük.</li>
	<li>Elektrofizyolojik veri toplama yazılımı kullanarak, istirahat membran potansiyeli 0'dan-65 için dönüşünceye kadar bekleyin mV veya aşağıda.</li>
	<li>1 Hz de teşvik ve mütevazı bir kaçmak sergiler için büyük bir potansiyel kontrol ederek bir kas aksiyon potansiyeli varlığını denetlemek (0'ın üzerinde yükselir potansiyel-65 başlatıldığında mV mV veya aşağıda). Stimülasyon artifakı bir aksiyon potansiyeli ile karıştırmayın. Not: Süresi (~ 5 ms) stimülasyon eserler önemli ölçüde daha uzun kudretliler.</li>
</ol>3. örnek floresans görüntüleme
<ol><li>594-αBTX-etiketli NMJs yeşil/sarı ışık uyarma altında yaşar kas endplate grup merkezi 20 X büyütme oranında bulun (550 nm). Geçiş için mavi ışık uyarma (470 nm) görüntü Ca2 + yanıt kas, motor nöron veya Schwann hücreleri için.</li>
	<li>İsterseniz, resim splitter kadar bant filtreleri ve çift dalga boyu görüntüleme için bir dikroik tek-edge filtresi ayarlayın.</li>
	<li>GCaMP3/6-ifade doku tarafından sergilenen maksimal Floresan (Fmax) hesaplamak için diyafram hazırlıklar6' ya 3 M potasyum klorür (KCl) 12 µL eklemek.<ol>
<li>Arama tablo Bar GCaMP3/6-ifade doku KCl cevaben binning olmadan 20 X büyütmede doygunluğu sergileyen düzeyinin % 110 set parlaklık çubuğu ile deneyler yapmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaçırmayın için saniyede 20 kare herhangi bir hızlı olayları kaydetmek.</li>
	<li>1-45 s 20-40 Hz ile sinir stimülasyonu ile bir tren emme elektrot kullanarak impulslarinin sunarak teşvik veya farmakolojik agonistler banyo uygulama veya perfüzyon ekleyin ve dinamik floresan Ca2 + yanıtları bir hücre alt toplamak statik 594-αBTX NMJ sinyal ile birlikte. Not: doku özgü kırmızı veya far-red GECI veya GEVI fareler, NMJ kullanılmak yayımlanırsa, onlar NMJ iki ayrı hücresel elemanlar yansıtan iki dinamik sinyal toplamak için kullanılabilir.</li>
	<li>İstenen sonuçları elde çünkü görüntüleme veya elektrofizyolojik deneyler sona erdikten sonra perfüzyon hatları üzerinden su sıvı ve su 2 x - 3 x tuzları inşa değil emin olmak için emme elektrot ile emmek.</li>
</ol>4. ihracat ve bir standart sapma harita floresan yoğunluğu (SDiu16) tarafından veri analizi
<ol><li>16-bit TIFF yığınlar kaydedilen görüntü sıralarını kayıt ve analiz için istediğiniz görüntüleme veri analiz sistem içine yükleyin.</li>
	<li>Yazılım'ın 8d dosya menüsü, ilgi görüntü yığını seçin ve yüklemek için tıklatın.<ol>
<li>Bir kez video yükler, hücresel floresan aktivite vardır bir bölümü tanımlamak için zaman inceden inceye gözden geçirmek. Not: Bu bölge bir arka plan örnek oluşturmak için kullanılır.</li>
		<li>Shift basılı tutun ve bir bölgesi faiz (ROI) kutusunun arka plan örnek alanı olarak tanımlanan alan çizmek için tıklatın.</li>
		<li>Kutusu oluşturduktan sonra arka plan etkinliği değiştirmek bir çizim oluşturmak için boşluk çubuğuna basın.</li>
		<li>Izleme sağ tıklatın ve xy koordinat metin dosyası olarak izleme yapmak için Metin olarak yatırım getirisi dökümü seçeneği sunmak için çeşitli seçeneğini belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geri faiz video hareketli, tekrar faiz etkinliğin oluştuğu saat bölgesi tanımlamak için tarayın.<ol>
<li>Orta fare düğmesini kullanarak, bu zaman bölgesi sarı zaman kutusunda seçin.</li>
		<li>Videoda sağ tıklatın ve seçin Yığın OPS ve sonra Stat göster seçeneği 5. Not: Bu sol penceresinde bir standart sapma harita (SD) oluşturur.</li>
		<li>SD harita üzerinde tıklatın ve sonra uygun renk ısı haritası uygulamak için 19 x tuşuna basın [ ] .</li>
		<li>SD Haritayı sağ tıklatın ve hangi SD harita kaydetme seçeneği stm TIFF olarak kaydetmek sunacak STM yük ve kurtarmak, seçin.</li>
		<li>O zaman, basın [ bir gri tonlama renk haritaya dönmek için 19 x anahtar.</li>
		<li>C sonra D yoğunluğu haritalama araçları kadar getirmek için tuşuna basın. Sol fare düğmesi ve merkezi fare düğmesini kullanarak, SD Haritada gösterilen tüm floresan etkinlik eklemek için eşik ayarlayın.</li>
		<li>Eşik ayarlarını koruyarak yoğunluğu araçları kapatmak için C tuşuna basın.</li>
		<li>SD Haritayı sağ tıklatın ve seçin STM parçacıklar ve sonra Bulmak PTCLS. Not: Bu tek tek hücreleri floresan etkinliği ifade tanımlar.</li>
		<li>Bir kez daha SD Haritayı sağ tıklatın ve Parçacık ROIs oluşturmakseçin. Not: Bu orijinal video ilgi temel üst üste.</li>
		<li>Shiftbasılı tutarak, özgün video Şimdi tespit parçacık ROIs herhangi birini sağ tıklatın.</li>
		<li>Yatırım getirisi Marker ve yatırım getirisi ölçü Intseçin. Not: Bu video ilgi tanımlanan her yatırım getirisini floresan faaliyet araziler oluşturur. Bunlar bunlardan herhangi biri sağ tıklatarak kaydedilebilir ve Assorted, seçme Metin olarak yatırım getirisi dökümütarafından takip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bu işlemler altında yatan ayrıntılı mantık için kaynak kodu dosyası9bakınız.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada biz Ca2 + yanıt sağlam nöromüsküler doku GECI ifade fare kullanarak belirli hücrelerde ölçme bazı örnekler sağlar. Bu deneyler başarıyla gerçekleştirebilmek sırasında diseksiyon frenik sinir incitmek değil zorunludur. CA2 + Schwann hücreleri (Örneğin, 20 X veya 60 X) düşük veya yüksek güçte yanıtlarında görüntüye, ya BHC ya da µ-conotoxin blok hareket için kullanmak gereklidir. Düşük güç görüntüleme için tepkilerin Ca2 + kas hücreleri, onları böylece uzunluğu değişiklikler...

Gibi tüm sinapslarda, NMJ üç unsurdan oluşur: presynaptic bir terminal türetilmiş bir nöron, bir postsinaptik nöron/efektör hücre ve bir perisynaptic gliyal hücre1,2. Sinaptik iletimi temel yönlerini ilk bu synapse3' te gösterilen, birçok açıdan, bu işlemin kısmen nedeniyle bu synapse farklı hücresel elementlerin tarafından aynı moleküllerden ifadesi bilinmeyen kalır. Örneğin, omurgalı NMJ, motor nöronlar tarafından ortak yayımlanan, reseptörleri pürin adenin nükleotit ATP ve asetilkolin (ACh), kas, Schwann hücreleri ve motor nöronlar, böylece herhangi bir yorumu karmaşık hale getiren tarafından ifade edilir Bu maddeler (Örneğin, verici yayın veya Yanıt, kas kuvvet oluşturma)4tarafından sarf fonksiyonel etkisi. Basit, NMJ Üçlü bileşenleridir motor nöronlar, kas hücreleri veya Schwann hücreleri bizi canlı tutan göre değişir olup olmadığını Ayrıca, hangi sık sık birden çok sinaptik girdi, sergi, nöronlarda için merkezi sinir sistemi karşılaştırıldığında kendi içsel olarak heterojen (Örneğin, embriyonik türetme, fiber alt tür, morfoloji) belirsiz. Her biri bu sorunları gidermek için aynı anda bir sinaptik öğesi yanı sıra parça, aynı zamanda, böyle bir tepki'a ayrı diğer öğeler içinde birçok hücre yanıtı izlemek için avantajlı olur. Boya banyo uygulanan birden çok hücre tipleri tarafından doku uygulamaya sonra kaplıyor ve intracellularly yüklü boya sadece görselleştirmek için kullanılabilir çünkü geleneksel stratejileri kalsiyum sinyal ölçmek için kimyasal boyalar kullanarak bu iki gol elde edemez hücre bireysel ya da küçük tabur kadar. Burada, transgenik fareler turk ifade kullanan hücre özgü kalsiyum, belirli görüntüleme ve yazılım araçları5, ile birlikte biz bu iki genel hedefleri ilk göstermek ve tartışmak sinyal ölçmek için tasarlanmış nasıl yanı sıra yeni transgenik araçları ikinci elde yardımcı. Bu teknik kalsiyum dynamics veya diğer hücresel olaylar gözlemlenebilir aynı anda birden çok hücre popülasyonlarının gen kodlanmış optik sensörler aracılığıyla sinyal izlemek isteyen herkes için faydalı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Myf5-Cre fareleri</td><td>Jax</td><td>#007893</td><td>E136</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre fareleri</td><td>Jax</td><td>#003829</td><td>kadar erken bir zamanda kas hücresi ekspresyonunu yönlendirir all&nbsp; E13'te Schwann hücreleri var ancak P209</td></tr><tr><td>Sox10-Cre fareleri</td><td>Jax</td><td>#025807</td><td>İleri yaşlarda Schwann hücre ekspresyonunu yönlendirir</td></tr><tr><td>Koşullu GCaMP3 fareleri</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>GCaMP3'ü hücreye özgü bir şekilde ifade eder</td></tr><tr><td>Koşullu GCaMP6f fareleri</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>GCaMP6f'yi hücreye özgü bir şekilde</td></tr> <tr><td>ifade ederBHC (3- (N-bütilenimidoyl) -4-hidroksi-2H-krom-2-on)</td> <td>Hit2Lead</td> <td># 5102862</td><td>İskelet kası miyozinini bloke eder ancak nörotransmisyonu engellemez6</td></tr><tr><td>CF594-&alfa;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td> NMJ ve mikro; -konotoksin GIIIb Peptitleri Int'l#CONO20-01000'de <td>asetilkolin reseptör kümelerini etiketler</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Bloklar Nav1.4 voltaja bağlı sodyum kanalı8</td></tr><tr><td>Silikon Dielektrik Jel; aka Sylgard</td><td>Ellswoth Yapıştırıcılar</td> <td># Sil Dielec Jel .9KG&nbsp;</td><td>Diyaframın minutyen pimler ile hareketsiz hale getirilmesine izin verir</td></tr><tr><td>Minutien pimleri (0,1 mm çap)</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>26002-10</td><td>Diyaframı silikon dielektrik jel üzerine hareketsiz hale getirir</td></tr><tr><td>Eclipse FN1 dik mikroskop ve nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td>Numunenin evrelenmesine ve gözlemlenmesine izin verir</td></tr><tr><td>Manuel XY Mikroskop Çeviricili Temel Sabit Mikroskop Platformu&nbsp;</td><td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>Numunenin hareketine izin verir</td></tr><tr><td>Manuel mikromanipülatör&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Kayıt ve uyarıcı elektrotları tutar&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroelektrot amplifikatörü&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Axoclamp 900A</td><td>Keskin elektrot hücre içi elektrofizyolojik kayda izin verir</td></tr><tr><td>Mikroelektrot düşük gürültülü veri toplama sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Digidata 1550&nbsp;</td><td>Elektrofizyolojik veri toplamaya izin verir</td></tr><tr><td>Mikroelektrot veri analiz sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>PCLAMP 10 Standardı</td><td>Elektrofizyolojik veri analizi yapar</td></tr><tr><td>Kare dalga stimülatörü</td><td>Grass</td><td>S48</td><td>Kası uyarmak için siniri uyarır</td></tr><tr><td>Uyaran İzolasyon Ünitesi</td><td>Çim</td><td>PSIU6</td><td>Stimülasyon artefaktlarını azaltır ve nbsp</td></tr><tr><td>Borosilikat filamentler, 1.0 mm dış çap, 0.5mm iç çap&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td><td>Sinirle uyarılmış kas potansiyellerini kazığa oturtur ve kaydeder</td></tr><tr><td>Borosilikat filamentleri, 1,5 mm dış çap, 1,17 mm iç çap&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>Uzatılmış ve emme elektrodu için kullanılan</td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter</td><td>P-97&nbsp;</td><td>Kayıt elektrotlarını çeker ve hazırlar</td></tr><tr><td>1200x1200 piksel, arkadan aydınlatmalı cMOS kamera&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>Yüksek çözünürlüklü, yüksek hızlı görüntülemeye izin veren hassas kamera</td></tr><tr><td>Işık Kaynağı</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>Floresan obsevasyonu için LED'lerden aydınlatma sağlar</td></tr><tr><td>&nbsp; Sonsuzluk düzeltmeli floresan suya daldırma objektifleri, W.D. 2mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td><td>Numunenin görselleştirilmesi için uzun çalışma mesafeleri sağlar</td></tr><tr><td>Halojen lambalı Fiber Optik Aydınlatıcı</td><td>Sumita</td><td>LS-DWL-N</td><td>Parlak alan gözlemi için aydınlatma sağlar</td></tr><tr><td>W-View Gemini Görüntü Ayırıcı&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Projeler Tek Bantlı</td></tr><tr><td>Bant Geçiren Filtreler&nbsp; (512/25-25 ve 630/92-25)&nbsp;</td><td>SemRock</td><td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td><td>Çift bantlı görüntülemeye izin verir</td></tr><tr><td>560 nm Tek Kenarlı Dikroik Işın Ayırıcı</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Çift dalga boylu görüntülemeye izin vermek için ışık huzmelerini ayıran dikroik ayna</td></tr><tr><td>Görüntüleme veri toplama sistemi</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements - MQS31000</td><td>Görüntüleme verilerinin toplanmasına izin verir</td></tr><tr><td>Dalga boyu kontrol modülü</td><td>Görüntüleme</td> verileri için Nikon <td>MQS41220</td><td>Modülü satın alma</td></tr><tr><td>Emisyon ayırıcı donanım modülü&nbsp;</td><td>Görüntüleme verilerinin toplanması için</td> <td>Nikon</td><td>MQS41410</td> Modülü</tr><tr><td>Görüntüleme veri analiz sistemi</td><td>NA</td><td>Volumetry 8D5, Fiji</td><td>Floresan yoğunluğunun ve diğer görüntüleme verilerinin analizine izin verir</td></tr></tbody></table>

ex vivo hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Doku hücreleri elektriksel aktivitesinin elektrofizyolojik teknikleri tarafından izlenebilir ama bunlar genellikle tek tek hücreler analiz için sınırlıdır. Hücre içi kalsiyum (Ca2 +) sitozol artış kez elektriksel aktivite nedeniyle oluşur veya sayısız diğer uyaranlara yanıt olarak, bu işlem tarafından izlenebilir sonra hücreleri görüntüleme florasan kalsiyum duyarlı ile yüklü boyalar.  Ancak, bu boyalar doku içinde tüm hücre tipleri tarafından alınır çünkü bu yanıtı tüm doku içinde bireysel bir hücreye görüntü zordur. Buna ek olarak, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (turk) bir tek hücre türüne göre ifade edilebilir ve böylece tüm nüfus içinde sinyal Ca2 + görüntüleme erişimine izin verme intrasellüler Ca2 +, artış yanıt olarak belli tek hücre türleri. Burada, biz turk GCaMP3/6 Kullanım fare nöromüsküler kavşak uygulamak, motor nöronlar, iskelet kası ve terminal/perisynaptic arasında üçlü bir synapse Schwann hücreleri. Biz bu teknik klasik ex vivo doku müstahzarları yarar göstermek. Bir optik bölücü kullanarak, biz çift dalga boyu görüntüleme dinamik Ca2 + sinyal ve nöromüsküler kavşak (NMJ) statik bir etiket iki hücre özgü GECI veya genetik olarak kodlanmış gerilim izlemek için kolayca adapte olabilir bir yaklaşım yerine Göstergeler (GEVI) aynı anda. Son olarak, biz floresan yoğunluğu uzamsal haritalar yakalamak için kullanılan yordamları tartışıyorlar. Birlikte, bu optik, transgenik ve analitik teknikler farklı hücre altgrupları çeşitli bağlamlarda NMJ, biyolojik aktivitesini incelemek için istihdam edilebilir.

Çeşitli değişikliklere örnek olarak artar olan intrasellüler Ca2 + NMJ türleri tanımlanmış hücre içinde tarafından aracılı floresan yoğunluğu, belgili tanımlık yarar bu yaklaşımın göster. Bu sonuçlar yanıt veren hücrelerin konumunu, hem de böylece kaç hücre yanıt ve ne kadar her hücre için belirli bir yanıt değerlendirilmesi için izin verdikleri yanıtlara yoğunluğunu sağlamak kayma floresan yoğunluğu haritalar olarak sunulur uyarıcı. Örneğin, Şekil 1</stron...

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Bu yöntem nöromüsküler alanda anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, sinir stimülasyonu yanıt olarak kas veya Schwann hücrelerinde kalsiyum sinyalrolü gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, sinir stimülasyonuna yanıt olarak belirli hücre tiplerinin aktivasyonunu görüntülenebilmektir. Başlamak için, transgenik fareler edinin ve metin protokolünde ayrıntılı olarak genotipleyin.Ötenaziden sonra, karaciğerin hemen altında tüm hayvan boyunca ve sadece kalp ve akciğer üzerinde iridektomi makas ile enine bölüm. Karaciğeri, kalbi ve akciğerleri parçalar. Bir emme elektrot içine çekilecek kadar uzun frenik sinir uzunluğunu korumak için dikkatli olmak.Ayrıca diyafram çevresindeki ince sırt dışında, göğüs kafesi ve vertebral sütun kaldırın. Diyafram ve frenik sinir örneğini krebs-Ringer çözeltisi içeren bir mikrofuge tüpe yerleştirin ve floresan alfa bungarotoksin etiketli mililitre başına bir mikrogram alın. Numunenin karanlıkta 10 dakika boyunca çözeltide kuluçkaya yatmasını bekleyin.Minutien pimleri kullanarak silikon dielektrik jel ile kaplı ve oksijenli Krebs-Ringer çözeltisi yaklaşık sekiz mililitre ile dolu altı santimetre çanak üzerine sabitleyerek diyafram immobilize. Yemeği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra diyaframı dakikada sekiz mililitrede 30 dakika boyunca daha fazla Krebs-Ringer çözeltisi ile perfitlendirin.Dört kat büyütme, bir mikromanipülatör kullanarak, sol frenik sinir üzerinde emme elektrot hareket ettirin. Emme elektrot bağlı boru bağlı beş mililitrelik şırınga varil çekerek emme uygulayın. Diyaframın brightfield aydınlatmaile görsel olarak inceleyerek hertz stimülasyonuna yanıt olarak kasılmasını sağlayın.Aksi takdirde, kas kasılmasının görsel incelemesi ile doğrulanabilecek bir supramaximal darbe elde etmek için voltaj dizini kademeli olarak çevirerek voltajı ayarlayın. Hala görünmüyorsa, şırınga ile sinir dışarı darbe ve emme uygulayarak tekrar çizmek için deneyin. Şimdi, kas spesifik miyozin inhibitörü BHC veya voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti mu-conotoxin eklemek için perfüzyon kapatın.Krebs-Ringer çözeltisinin bir mililitresinde DMSO'da 200 milimolar stok BHC'nin dört mikrolitresini pipetleyerek BHC ön seyreltmesini hazırlayın. Bir mililitre Krebs-Ringer çözeltisini yemekten çıkarın. Sonra çanak önceden seyreltilmiş BHC ekleyin.30 dakika sonra, taze Krebs-Ringer çözeltisinin perfüzyonunu 20 ila 30 dakika daha açın. Eldiven giyen, bir milimetre dış çapı ve bir micropipeette puller içine 0,4 milimetre iç çapı ile bir borosilikat filamented cam yerleştirerek kayıt elektrot hazırlamak. Tuşları sıkın ve onu konuma sıkıştırın ve çekmece kapağını kapatın.Daha sonra çekmeceyi metin protokolünde açıklandığı şekilde programlayın. Embriyonik diyaframlar için amplifikatörün yazılım kontrollerini kullanarak direnci ölçün. Direnci n60 megaohms ve eski diyaframlar için, 10-20 megaohms yakın olduğundan emin olun.Şimdi, kayıt elektrotuna üç azı potasyum klorür yükleyin. 10 kez büyütme, uyarıcı bir elektrot olarak sahnenin karşı tarafında ikinci bir mikromanipülatör kullanarak kas içine elektrot indirin. Elektrofizyolojik veri toplama yazılımını kullanarak istirahat membranı potansiyel sıfırdan eksi 65 milivolt veya altında değişene kadar bekleyin.Bir hertz teşvik ve mütevazı bir overshoot sergileyen büyük bir potansiyel için kontrol ederek bir kas eylem potansiyelinin varlığını doğrulamak. Uyarım artifakı ile eylem potansiyelini karıştırmayın. 20 kez büyütme yeşil sarı ışık uyarma altında floresan alfa bungarotoksin nöromüsküler kavşaklar etiketlenmiş arayarak kas merkezinde son plaka bandı bulmak.Kas, motor nöron veya Schwann hücrelerinde görüntü kalsiyum yanıtları için mavi ışık uyarma geçin. Bu örnekte GCaMP üç kas hücrelerinde ifade edilir. İstenirse, çift dalga boyu görüntüleme için bant geçiş filtreleri ve dikroik tek kenar filtresi ile görüntü ayırıcısını ayarlayın.Potasyum klorüre yanıt vermeden dokuyu 20 kat büyütme de doygunluğu ifade eden genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin %110 seviyesine ayarlanan arama tablosu çubuğundaki parlaklık çubuğu ile deneyler yapın. Hızlı etkinlikleri kaçırmamak için saniyede 20 kare lik kayıt kaydedin. Bir emme elektrot kullanarak impulsların bir tren teslim ederek sinir stimülasyonu 20 ila 40 hertz bir ila 45 saniye ile teşvik ve statik floresan alfa bungarotoxin nöromüsküler kavşak sinyali etiketli ile birlikte bir hücre alt türünde dinamik floresan kalsiyum yanıtları toplamak.Farmakolojik agonistler de banyo uygulaması veya perfüzyon ile eklenebilir ve dinamik floresan kalsiyum yanıtları aynı şekilde toplanabilir. İstenilen sonuçlar elde edildiği için görüntüleme veya elektrofizyolojik deneyler tamamlandığında, perfüzyon hatları na su geçirin ve tuzların birikmemesi için emme elektrotu ile suyu 2-3 kez emerek emerek. Doğum sonrası yedinci doğum gününde Wnt bir GCaMP üç fare diyafram frenik sinir stimülasyonu Schwann hücre kalsiyum yanıtları bir mekansal harita nöromüsküler kavşakta terminal parasinaptik Schwann hücreleri için bir kısıtlama göstermektedir.Aynı diyafram floresan alfa bungarotoksin etiketli sonra görüntülendi, hangi bağlar nöromüsküler kavşak asetilkolin reseptörlerini etkinleştirmek için. Aynı diyafram da Brightfield aydınlatma altında nöromüsküler kavşak tarafından kas post-sinaptik bölgeye bir kayıt elektrot rehberlik etmek için görüntülendi. Burada gösterilen renk kodlu hücrelerin mekansal çizim veya bireysel kalsiyum geçici analizi için alınan ilgi bölgeleri.Bir mth kas hücresi kalsiyum yanıtları mekansal harita 5 GCaMP p dört de möyürin inhibitörü BHC varlığında frenik sinir stimülasyonu için tüm diyafram kas hücrelerinin tüm bölgede bir yanıt gösterir. Buna karşılık, mu-conotoxin varlığında aynı diyafram stimülasyonu asetilkolin reseptör kümesi zenginleştirilmiş uç plaka bandına karşılık gelen tüm diyafram kas hücrelerinin medial bölgede mekansal olarak sınırlı kalsiyum yanıtı neden olur. Bu işlemin ardından immüno-histokimya veya immünoblotlama gibi ek sorulara cevap vermek için başka yöntemler de yapılabilir, elektrofizyoloji veya kalsiyum görüntüleme ile tanımlanan hücrelerin moleküler profili nedir?Bu yöntem, schwann hücrelerinin ve kas hücrelerinin normal neonatal farelerde sinir stimülasyonuna popülasyon yanıtları hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca yaşlı farelerin çalışmasına veya nöromüsküler hastalık ilişkili proteinleri ifade farelerin çalışma için uygulanabilir.

ex-vivo-imaging-cell-specific-calcium-signaling-at-tripartite-synapse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Heredia, D. J., et. al. Fare diyaframının üçlü sinapsında hücreye özgü kalsiyum sinyalinin ex vivo görüntülemesi. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video floresan görüntülemeyi göstermektedir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade eden transgenik bir farede nöromüsküler kavşaklarda (NMJ'ler) kalsiyum dinamikleri. Bir NJM, frenik sinir ile diyaframdaki floresan etiketli asetilkolin reseptörleri ile tanımlanır. Aynı anda birden fazla sinyali görselleştirmek için bir görüntü ayırıcı...

Transgenik Bir Farenin Diyaframındaki Nöromüsküler Kavşaklarda Kalsiyum Dinamiğinin Floresan Görüntülemesi

Kaynak: Shannonhouse, J.,  et al. İn Vivo Sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki primer duyusal nöron ağlarındaki nöronal toplulukların kalsiyum görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2023). Video, transgenik bir farenin dorsal kök gangliyonlarındaki (DRG) nöronal aktiviteyi izlemek için in vivo bir kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. DRG nöronları, kalsiyuma bağlandıktan sonra floresan yoğunluğunu artıran bir kalsiyum indikatörünü ifade eder. Bir arka pençeye uygulanan mekanik veya termal...

Bir farenin sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki nöronal toplulukların in vivo kalsiyum görüntülemesi

Kaynak: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In Situ Ca2+ Enterik sinir sisteminin görüntülenmesi. J. Vis. Uzm.  (2015)Bu video kalsiyumu göstermektedir fare Kolonik Myenterik pleksus preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini görselleştirmek ve analiz etmek için görüntüleme.

Bir Fare Kolonik Myenterik Pleksusunda Enterik Nöron ve Glia Aktivitelerinin Kalsiyum Görüntülemesi

Kaynak: Ishimoto, H. et. al., Drosophila'da endokrin sinyalizasyona beyin tepkilerini görselleştirmek için ex vivo kalsiyum görüntüleme. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video, çalışmak için kalsiyum görüntülemeyi göstermektedirDrosophila nöropeptitlere beyin tepkileri. Floresan kalsiyum indikatörünü eksprese eden nöronlar, hücre içi kalsiyum dinamiklerini ve sinyal moleküllerine fonksiyonel tepkileri ortaya çıkarır.

Drosophila Beyninin Nöropeptitlere Tepkilerini İncelemek için Ex Vivo Kalsiyum Görüntüleme

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Burada, epileptiform aktiviteleri izlemek için GCaMP6 eksprese eden yetişkin Drosophila'da ex vivo kalsiyum görüntüleme için bir protokol sunuyoruz. Protokol, ex vivo kalsiyum görüntüleme yoluyla yetişkin Drosophila'daki iktal olayları araştırmak için değerli bir araç sağlar ve hücresel seviyelerde epilepsinin potansiyel mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

Ex Vivo (Canlı Canlı) Drosophila Epilepsi Modeli için Kalsiyum Görüntüleme

İmmobilizasyon için topikal bir doku yapıştırıcısı kullanarak bir Drosophila larva koku alma nöronu için kalsiyum görüntüleme protokolleri sunuyoruz. Bu yöntem stabiliteyi artırarak güvenilir in-vivo ve ex-vivo deneyleri kolaylaştırır. Özel R komut dosyaları kalsiyum sinyallerini analiz ederek ayrıntılı nörofizyolojik araştırmalar için etkili bir platform sağlar.

Üçüncü Dönem Drosophila melanogaster Larvasında Bir Koku Alma Devresi Nöronunun İn-vivo ve Ex-vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Keşfedin fare diyaframında sinir uyarımına yanıt olarak kas ve Schwann hücrelerinde kalsiyum sinyalini görüntüleme yöntemini. Bu teknik, nöromusküler kavşakta hücresel iletişimi incelemek için kullanılır.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Daha fazla video keşfet