Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme
October 4th, 2018
Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.
Bu yöntem nöromüsküler alanda anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, sinir stimülasyonu yanıt olarak kas veya Schwann hücrelerinde kalsiyum sinyalrolü gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, sinir stimülasyonuna yanıt olarak belirli hücre tiplerinin aktivasyonunu görüntülenebilmektir. Başlamak için, transgenik fareler edinin ve metin protokolünde ayrıntılı olarak genotipleyin.
Ötenaziden sonra, karaciğerin hemen altında tüm hayvan boyunca ve sadece kalp ve akciğer üzerinde iridektomi makas ile enine bölüm. Karaciğeri, kalbi ve akciğerleri parçalar. Bir emme elektrot içine çekilecek kadar uzun frenik sinir uzunluğunu korumak için dikkatli olmak.
Ayrıca diyafram çevresindeki ince sırt dışında, göğüs kafesi ve vertebral sütun kaldırın. Diyafram ve frenik sinir örneğini krebs-Ringer çözeltisi içeren bir mikrofuge tüpe yerleştirin ve floresan alfa bungarotoksin etiketli mililitre başına bir mikrogram alın. Numunenin karanlıkta 10 dakika boyunca çözeltide kuluçkaya yatmasını bekleyin.
Minutien pimleri kullanarak silikon dielektrik jel ile kaplı ve oksijenli Krebs-Ringer çözeltisi yaklaşık sekiz mililitre ile dolu altı santimetre çanak üzerine sabitleyerek diyafram immobilize. Yemeği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra diyaframı dakikada sekiz mililitrede 30 dakika boyunca daha fazla Krebs-Ringer çözeltisi ile perfitlendirin.
Dört kat büyütme, bir mikromanipülatör kullanarak, sol frenik sinir üzerinde emme elektrot hareket ettirin. Emme elektrot bağlı boru bağlı beş mililitrelik şırınga varil çekerek emme uygulayın. Diyaframın brightfield aydınlatmaile görsel olarak inceleyerek hertz stimülasyonuna yanıt olarak kasılmasını sağlayın.
Aksi takdirde, kas kasılmasının görsel incelemesi ile doğrulanabilecek bir supramaximal darbe elde etmek için voltaj dizini kademeli olarak çevirerek voltajı ayarlayın. Hala görünmüyorsa, şırınga ile sinir dışarı darbe ve emme uygulayarak tekrar çizmek için deneyin. Şimdi, kas spesifik miyozin inhibitörü BHC veya voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti mu-conotoxin eklemek için perfüzyon kapatın.
Krebs-Ringer çözeltisinin bir mililitresinde DMSO'da 200 milimolar stok BHC'nin dört mikrolitresini pipetleyerek BHC ön seyreltmesini hazırlayın. Bir mililitre Krebs-Ringer çözeltisini yemekten çıkarın. Sonra çanak önceden seyreltilmiş BHC ekleyin.
30 dakika sonra, taze Krebs-Ringer çözeltisinin perfüzyonunu 20 ila 30 dakika daha açın. Eldiven giyen, bir milimetre dış çapı ve bir micropipeette puller içine 0,4 milimetre iç çapı ile bir borosilikat filamented cam yerleştirerek kayıt elektrot hazırlamak. Tuşları sıkın ve onu konuma sıkıştırın ve çekmece kapağını kapatın.
Daha sonra çekmeceyi metin protokolünde açıklandığı şekilde programlayın. Embriyonik diyaframlar için amplifikatörün yazılım kontrollerini kullanarak direnci ölçün. Direnci n60 megaohms ve eski diyaframlar için, 10-20 megaohms yakın olduğundan emin olun.
Şimdi, kayıt elektrotuna üç azı potasyum klorür yükleyin. 10 kez büyütme, uyarıcı bir elektrot olarak sahnenin karşı tarafında ikinci bir mikromanipülatör kullanarak kas içine elektrot indirin. Elektrofizyolojik veri toplama yazılımını kullanarak istirahat membranı potansiyel sıfırdan eksi 65 milivolt veya altında değişene kadar bekleyin.
Bir hertz teşvik ve mütevazı bir overshoot sergileyen büyük bir potansiyel için kontrol ederek bir kas eylem potansiyelinin varlığını doğrulamak. Uyarım artifakı ile eylem potansiyelini karıştırmayın. 20 kez büyütme yeşil sarı ışık uyarma altında floresan alfa bungarotoksin nöromüsküler kavşaklar etiketlenmiş arayarak kas merkezinde son plaka bandı bulmak.
Kas, motor nöron veya Schwann hücrelerinde görüntü kalsiyum yanıtları için mavi ışık uyarma geçin. Bu örnekte GCaMP üç kas hücrelerinde ifade edilir. İstenirse, çift dalga boyu görüntüleme için bant geçiş filtreleri ve dikroik tek kenar filtresi ile görüntü ayırıcısını ayarlayın.
Potasyum klorüre yanıt vermeden dokuyu 20 kat büyütme de doygunluğu ifade eden genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin %110 seviyesine ayarlanan arama tablosu çubuğundaki parlaklık çubuğu ile deneyler yapın. Hızlı etkinlikleri kaçırmamak için saniyede 20 kare lik kayıt kaydedin. Bir emme elektrot kullanarak impulsların bir tren teslim ederek sinir stimülasyonu 20 ila 40 hertz bir ila 45 saniye ile teşvik ve statik floresan alfa bungarotoxin nöromüsküler kavşak sinyali etiketli ile birlikte bir hücre alt türünde dinamik floresan kalsiyum yanıtları toplamak.
Farmakolojik agonistler de banyo uygulaması veya perfüzyon ile eklenebilir ve dinamik floresan kalsiyum yanıtları aynı şekilde toplanabilir. İstenilen sonuçlar elde edildiği için görüntüleme veya elektrofizyolojik deneyler tamamlandığında, perfüzyon hatları na su geçirin ve tuzların birikmemesi için emme elektrotu ile suyu 2-3 kez emerek emerek. Doğum sonrası yedinci doğum gününde Wnt bir GCaMP üç fare diyafram frenik sinir stimülasyonu Schwann hücre kalsiyum yanıtları bir mekansal harita nöromüsküler kavşakta terminal parasinaptik Schwann hücreleri için bir kısıtlama göstermektedir.
Aynı diyafram floresan alfa bungarotoksin etiketli sonra görüntülendi, hangi bağlar nöromüsküler kavşak asetilkolin reseptörlerini etkinleştirmek için. Aynı diyafram da Brightfield aydınlatma altında nöromüsküler kavşak tarafından kas post-sinaptik bölgeye bir kayıt elektrot rehberlik etmek için görüntülendi. Burada gösterilen renk kodlu hücrelerin mekansal çizim veya bireysel kalsiyum geçici analizi için alınan ilgi bölgeleri.
Bir mth kas hücresi kalsiyum yanıtları mekansal harita 5 GCaMP p dört de möyürin inhibitörü BHC varlığında frenik sinir stimülasyonu için tüm diyafram kas hücrelerinin tüm bölgede bir yanıt gösterir. Buna karşılık, mu-conotoxin varlığında aynı diyafram stimülasyonu asetilkolin reseptör kümesi zenginleştirilmiş uç plaka bandına karşılık gelen tüm diyafram kas hücrelerinin medial bölgede mekansal olarak sınırlı kalsiyum yanıtı neden olur. Bu işlemin ardından immüno-histokimya veya immünoblotlama gibi ek sorulara cevap vermek için başka yöntemler de yapılabilir, elektrofizyoloji veya kalsiyum görüntüleme ile tanımlanan hücrelerin moleküler profili nedir?
Bu yöntem, schwann hücrelerinin ve kas hücrelerinin normal neonatal farelerde sinir stimülasyonuna popülasyon yanıtları hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca yaşlı farelerin çalışmasına veya nöromüsküler hastalık ilişkili proteinleri ifade farelerin çalışma için uygulanabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, sinir stimülasyonu sırasında kas ve Schwann hücrelerinde kalsiyum dinamiklerinin rolünü araştırmayı amaçlayan, murin nöromüsküler kavşakta belirli hücre popülasyonlarında kalsiyum sinyalleşmesini görüntülemek için bir protokol sunmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Kalsiyum sinyalleşmesini anlamak, nöromüsküler kavşak fonksiyonunu deşifre etmek için kritik öneme sahiptir.
- Kas ve Schwann hücrelerindeki kalsiyum tepkileri, kas kasılması ve sinir iletişiminde çok önemlidir.
- Transgenik fareler, hedeflenen hücre tiplerinde kalsiyum dinamiklerini özellikle etiketlemek için kullanılır.
- Protokol, sinir stimülasyonu sırasında hücresel tepkileri değerlendirmek için gerçek zamanlı görüntülemeyi sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Nöromüsküler kavşakta farklı hücre tipleri arasında kalsiyum sinyalleşmesini görselleştirmek.
- Sinir stimülasyonu sırasındaki hücresel iletişim dinamiklerini keşfetmek.
- Nöromüsküler sinyallere kas ve Schwann hücrelerinin spesifik tepkilerini analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma, kalsiyum indikatörlerini eksprese eden transgenik fareler kullanılarak nöromüsküler kavşakta canlı görüntüleme teknikleri kullanır.
- Anahtar müdahaleler, kalsiyum tepkilerini değerlendirmek için sinir stimülasyonu ve farmakolojik manipülasyonları içerir.
- Kritik adımlar, sinyalleri doğru bir şekilde kaydetmek için perfüzyon koşullarını ve elektrot yerleşimlerini optimize etmeyi içerir.
- Görüntüleme, dinamik hücresel tepkileri yakalamak için değişken ışık koşullarında floresan kullanılarak gerçekleştirilir.
Ana Sonuçlar
- Görüntüleme, stimülasyon sırasında kalsiyum sinyalleşmesinin terminal parasinapsik Schwann hücrelerinde ve kas hücrelerinde yoğunlaştığını ortaya koymuştur.
- Hem kas hem de Schwann hücrelerinde kalsiyum tepkisinde önemli zamansal dinamikler gözlemlenmiştir, bu da koordineli sinyalleşmeyi göstermektedir.
- Bu yaklaşım, stimülasyon koşullarında spesifik hücresel etkileşimlerin ve tepkilerinin görselleştirilmesine olanak sağlamıştır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, nöromüsküler kavşakta kas ve glial hücrelerde kalsiyum sinyalleşme dinamiklerini araştırmak için uygun bir yöntem göstermiştir.
- Bulgular, uyarıcı sinyaller sırasında nöromüsküler iletimi ve hücresel davranışı anlamamızı artırmaktadır.
- Sonuçlar, nöromüsküler fonksiyon ve potansiyel hastalık durumlarının altında yatan hücresel mekanizmaları daha iyi anlama yönünde genişlemektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables cell-specific calcium signaling imaging at the neuromuscular junction, supporting target validation in neuromuscular disease models by isolating functional responses in defined cell populations. It provides quantitative, spatially resolved readouts that enhance predictive confidence in preclinical target engagement and pathway modulation studies. The approach supports mechanistic de-risking by linking nerve stimulation to cellular responses in muscle, motor neurons, and Schwann cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by imaging calcium dynamics in specific cell types in response to nerve stimulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through cell-type-specific readouts of intracellular signaling.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking target modulation to measurable calcium flux in disease-relevant cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline calcium signaling in defined NMJ cell types.
- Operational Value: Enables assay standardization via dual-wavelength imaging of dynamic signals and static NMJ labels for internal normalization.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptation to multiple GECIs or GEVIs for multiplexed target engagement profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase calcium signaling observations to preclinical validation in disease models expressing neuromuscular-associated proteins.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from muscle, neuronal, or glial contributions to NMJ dysfunction.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing cell-specific contributions to calcium signaling deficits in pathological contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and mechanistic insight in translational research.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating calcium responses to nerve stimulation in individual cell types.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, quantifiable calcium flux measurements synchronized with NMJ landmarks.
- Analytics: Provides dynamic fluorescence readouts and spatial maps that enable comparison of compound effects across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing longitudinal assessment of calcium signaling in aging or disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform adaptable to multiple transgenic indicators and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via internal NMJ referencing and controlled perfusion.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by isolating cell-specific signaling contributions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on cell-type-specific target engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic mouse handling, electrophysiology, and fluorescence microscopy.
- Depends on optical splitter systems, perfusion setups, and suction electrode stimulation equipment.
- Necessitates cross-team standardization for consistent NMJ identification and calcium indicator expression levels.
- Involves adaptation considerations when applying to different disease models or developmental stages.
- Limited by tissue viability duration and potential signal overlap in densely innervated preparations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Preparation of the Diaphragms and Phrenic Nerves from Transgenic Mice
1:27
Stimulation and Recording of the Muscle Action Potentials
4:49
Imaging of the Fluorescence of the Sample
6:33
Results: Nerve Stimulation-induced Ca2+ Responses in Populations of Schwann Cells or Muscle Cells of the Neonatal Mouse Diaphragm
8:03
Conclusion
