Name: İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Keşfedin iki fotonlu intravital mikroskopi yöntemiyle fare trakeal mukozasında grip virüsü enfeksiyonu sırasında bağışıklık hücre etkileşimlerini canlı görüntüleme. Bu protokol nötrofil ve dendritik hücre dinamiklerini analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser İsviçre Ulusal Vakfı (SNF) hibe (176124, 145038 ve 148183), Avrupa Komisyonu Marie Curie Reintegration Grant (612742) ve SystemsX.ch D.U.P. için bir hibe için tarafından desteklenmiştir (2013/124).

<ol><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Fein, M. R., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+revealing+the+metastatic+process+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li>
<li>Pulendran, B., Maddur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immune+Sensing+and+Response+to+Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Innate Immune Sensing and Response to Influenza.</a> Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+trails+guide+influenza-+specific+CD8+%2B+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways.</a> Science. 349 (6252), (2015).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Kretschmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+multiphoton+microscopy+for+visualization+of+tissue+morphology+and+cellular+dynamics+in+murine+and+human+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
<li>Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Lung.</a> Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Dendritic+Cells+in+Respiratory+Viral+Infection+and+Asthma%3A+From+Protection+to+Immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology.</a> Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).</li>
<li>Camp, J. V., Jonsson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+neutrophils+in+viral+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role for neutrophils in viral respiratory disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
<li>van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+immune+modulation+of+dendritic+cells+through+glycosylation-dependent+interactions+between+Mac-1+and+DC-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN.</a> The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).</li>
<li>Gonzalez, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+influenza+by+medullary+dendritic+cells+via+SIGN-R1+is+essential+for+humoral+immunity+in+draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes.</a> Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).</li>
<li>Lindquist, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+V%CE%B39V%CE%B42-T+cells+efficiently+kill+influenza+virus-infected+lung+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells.</a> Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).</li>
<li>Tran Cao, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+transgenic+cyan+fluorescent+protein+%28CFP%29-expressing+nude+mouse+for+%26%2334%3Btechnicolor%26%2334%3B+cancer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for &#34;technicolor&#34; cancer imaging.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).</li>
<li>Jaber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+regimens%2C+variability%2C+and+complications+associated+with+using+repeat-bolus+dosing+to+extend+a+surgical+plane+of+anesthesia+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).</li>
<li>Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).</li>
<li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/5872394/">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).</li>
<li>Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19834485">Analysing immune cell migration.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).</li>
<li>Keller, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+cell+shape%2C+and+locomotion+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility%22%5BJournal%5D)">Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes.</a> Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15357943">Intravital Microscopy.</a> Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).</li>
<li>Lambert Emo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Influenza+Infection+of+the+Trachea+Reveals+Dynamic+Regulation+of+CD8%2B+T+Cell+Motility+by+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen.</a> PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışma adoptively transfer edilen nötrofil ve ilişkileri ile DC geçişi grip enfeksiyon sırasında fare borusunda gösterilen 4 D görüntüleri nesil için detaylı bir Protokolü sunar. Açıklanan 2P-IVM modeli bir solunum yolları enfeksiyonu sırasında bağışıklık hücre dinamiği çalışmaya ilgili olacak.
Son zamanlarda, çeşitli modeller hücre dinamiği içinde solunum yolları görselleştirme göre gelişmiş9,10,11</su...

İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) içinde onların doğal çevre1oluştuğunda gibi hücre hücre etkileşimlerin gerçek zamanlı görüntüleme için etkili bir tekniktir. Bu yöntemin ana avantajlarından biri hücresel süreçler diğer geleneksel görüntüleme teknikleri2ile karşılaştırıldığında daha büyük bir örnek Derinlik (1 mm için 500 µm) adlı çalışması sağlanmıştır. Aynı anda iki fotonlu lazer tarafından oluşturulan iki düşük enerjili fotonlar kullanımı genellikle görüntü alma işlemi2ile ilgili doku fotoğraf-zarar en aza indirir. Son on yılda 2P-IVM hücre-hücre etkileşimleri çeşitli disiplinleri3,4,5farklı türde çalışma uygulandı. Bu çalışmalar kendi yüksek dinamizm ve tanınmış kişiler diğer hücreleri ve çevre tarafından oluşturulan sinyalleri takip oluşumu ile karakterizedir bağışıklık hücreleri araştırmak özellikle ilgili olmuştur. 2P-IVM da patojen ve ana bilgisayar6arasındaki etkileşimler çalışma uygulandı. Nitekim, daha önce bazı patojenlerin engelleyici, sonuç olarak, immün yanıt7bağışıklık hücreleri arasında temas süresi ve türünü değiştirebilirsiniz gösterilmiştir.
Hava yolu mukoza bağışıklık yanıtı havadan patojenlere karşı olduğu ilk sitesi8oluşturulan olduğunu. Bu nedenle, bu doku etkileşimlerde patojen-ana bilgisayar analizini vivo içinde konak savunma mekanizmaları başlatılması sırasında enfeksiyon anlamak için önemlidir. Ancak, 2P-IVM solunum yolları, özellikle resim alma sürecinin ödün vermez hayvan solunum döngüsü tarafından üretilen eserler nedeniyle zordur. Son zamanlarda, farklı cerrahi modelleri görüntüleme fare trakea9,10,11,12 ve akciğerleri13,14,15'anlatmıştık, 16. Trakeal 2P-IVM modelleri akciğer-alveoller 2 P-IVM modelleri enfeksiyonların geç faz çalışmaya daha uygun olmakla birlikte üst solunum yolları, bağışıklık reaksiyonu başlangıç aşamasında görselleştirmek için mükemmel bir set-up temsil eder. Lazer optik penetrasyon kısıtlamak ve intrapulmonary airways mukozal tabakasının içinde vivo 17 görüntüleme için erişilmez hale hava dolu alveoller varlığı ile ilişkili bir sınırlama Gelişmiş akciğer modelleri mevcut . Bunun tersi olarak, sürekli bir epitel tarafından kurulan trakea yapısını resim alma kolaylaştırır.
Burada, grip enfeksiyon, cerrahi hayvanlar hazırlanması ve 2 P-IVM trakea, gerçekleştirmek için gereken adımları ayrıntılı bir açıklamasını içeren bir protokolü mevcut. Buna ek olarak, belirli bir deneysel kurulum nötrofil ve dendritik hücreler (DC), grip virüsü18karşı,19 arabulucu savunma mekanizması olarak önemli bir rol oynamak iki bağışıklık hücre tipleri görselleştirme için tarif . Son olarak, nötrofil-DC etkileşimleri analiz etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Bu kişiler DC harekete geçirmek modüle gösterilmiştir ve daha sonra patojenler20karşı bağışıklık yanıtı etkileyecek.

<table><tbody><tr><td>Gigasept instru AF</td><td>Sch&uuml; lke & Mayr GmbH</td><td></td><td>%4'lük çözelti</td></tr><tr><td>CD11c-YFP fareleri</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008829</td><td>fareleri şirket içinde yetiştirildi</td></tr><tr><td>CK6-ECFP fareleri</td><td>Jackson Laboratories</td><td>004218</td><td>fareleri şirket içinde yetiştirildi</td></tr><tr><td>1x Dulbecco'nun Kalsiyum Korid ve Magnezyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td> olmadan modifiye edilmiş Fosfat Tamponlu Salin</tr><tr><td>10x Dulbecco'nun Kalsiyum Korür ve Magnezyum Klorür olmadan modifiye edilmiş Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>E0414-1L</td><td>4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Ketamin Labatec Labatec</td><td>Pharma</td><td>7680632310024</td><td>RT'de saklayın, 4 & deg'de saklayın; C ket / ksil karışımı çözeltisi içindeyken</td></tr><tr><td>Rompun% 2 (Xylazin)</td> <td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>RT'de saklayın, 4 derecede saklayın; C ket / ksil karışımı çözeltisi içindeyken</td></tr><tr><td>26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 0.3 mL BD Mikro-İnce İnsülin Şırıngaları</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Şırınga</td><td>BD Plastipak</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3x 18 G iğneler</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 G (kateter)</td><td>Braun</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Hücre Kültürü Kümesi</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI orta 1640 + HEPES (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>4 derece; C</td></tr><tr><td>Liberase TL Araştırma Sınıfı</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>Mağazası -20 &°C; C / kollajenaz (I ve II) karışımı</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0649-50KU</td><td>-20 °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>CellTrace Menekşe lekesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>PE-10 Mikro Tıbbi Boru</td><td>2Biyolojik Aletler SNC</td><td>#BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Plastik Bant</td><td>M Plast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch & RT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamuru</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Toleranslı Cam Lamel 15 mm Yuvarlak</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite Portatif Hayvan Anestezi Sistemi</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvo Lite mark 5</td><td>GCE medline</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag (gazlı anestezi ve ısıtma tezgahı)</td><td>Tem Sega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CERRAHİ KURULU</td><td>Bern</td><td></td><td></td>Üniversitesi</tr><tr><td>TrimScope II İki fotonlu mikroskop</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision Ti:Sa lazerler</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05 suya daldırma objektifi</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>The Cube & Kutu inkübasyon odası ve sıcaklık kontrolörü</td><td>Yaşam görüntüleme Hizmetleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.1.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>İstatistiksel yazılım</td></tr></tbody></table>

İki fotonlu intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Hücre-hücre ya da hücre-patojen etkileşim içinde vivo analizini enfeksiyon bağışıklık yanıtının dinamiklerini anlamak önemli bir araçtır. İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) hücre etkileşimlerin gözlenmesi yaşayan hayvanlarda derin doku resim alma sırasında oluşturulan photobleaching en aza indirirken sağlar. Bugüne kadar farklı modeller için 2P-IVM lenfoid ve sigara lenfoid organlar tarif edilmistir. Ancak, bir meydan okuma hayvan solunum döngüsü ile ilişkili hareket nedeniyle solunum organlarının görüntüleme kalır.
Burada, in vivo bağışıklık hücre etkileşimlerde trakea 2 P-IVM kullanarak grip virüsü ile enfekte fareler görselleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu amaç için cerrahi pozlama ve nötrofil ve dendritik hücreler (DC) Mukozal epitel dinamik görüntülerini edinimi ardından trakea, entübasyon dahil özel bir görüntüleme platformu geliştirdi. Ayrıca, grip burunici enfeksiyon ve akış sitometrik bağışıklık hücrelerinin borusunda çözümlemesi için gereken adımları ayrıntılı. Son olarak, analiz ettik nötrofil ve DC hareketliliği gibi onların etkileşim bir film boyunca. Bu iletişim kuralı istikrarlı ve parlak 4 D görüntüleri oluşturmak için hücre-hücre etkileşimleri trakea değerlendirilmesi için gerekli sağlar.

Bu çalışmada, biz vivo içinde çalışmaya detaylı bir protokol nötrofil ve DC arasındaki etkileşimler ve hareket fare trakea (Şekil 3A) grip enfeksiyonu sırasında açıklanan. Bu amaçla, biz izole CFP+ nötrofil (% 92 saflık; Şekil 3B) CK6-ECFP fare ve biz adoptively onları grip ile enfekte bir CD11c-YFP fare içine transfer. Bundan sonra biz 2 P-IVM 3 gün özel dedektif, trakea, gerçekleştirilen Bu zaman noktada akı...

Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Bu yöntem, solunum yolu enfeksiyonları sırasında bağışıklık hücrelerinin etkileşimlerinin dinamikleri hakkında havadaki patojenlere karşı bağışıklık tepkilerinin incelenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit cerrahi boyunca trakeal epitelin parlak ve stabil 4D görüntülerini elde etme yeteneğidir. Bu yöntem, influenza enfeksiyonu sırasında nötrofil ve litik hücre etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, farklı bağışıklık hücrelerinin veya havadaki patojenlerin çalışmasına da uygulanabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, stabil ve minimal iltihaplı bir ameliyatı sürdürmekte zorlanacaktır. Ayrıca, kalp kusurlarının varlığı nedeniyle görüntü analizi zor olabilir. İntranazal influenza enfeksiyonu için, anestezi uygulanmış altı ila sekiz haftalık bir CD11c-YFP faresini sırtüstü pozisyona getirin ve ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek derin sedasyonu onaylayın.Pipeti sol burun deliğine yakın bir yere yerleştirerek, fare 15 mikrolitrelik PR8 aşısının tamamını soluyana kadar yaklaşık 20 saniye arayla burun boşluğuna küçük damlacıklar dağıtın. İki ila beş dakika sonra, 15 mikrolitre virüsü aynı şekilde sağ burun deliğine verin. Aşının tamamı verildiğinde, farenin normal nefes aldığını onaylayın ve hayvanı, tamamen iyileşene kadar izleme ile lateral dekübitte kafesine yerleştirin.Enfeksiyondan üç gün sonra, transgenik CFP eksprese eden bir fareden hem femorayı hem de tibiaları çıkarın ve kemikleri forseps ile nazikçe temizleyin. Kemik epifizini kesin ve kemik iliğini her kemikten steril soğuk PBS ile buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüpe akıtmak için 26 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Kemik iliğinin tamamı toplandığında, iliği iğne ucundan birkaç kez aspire edin ve ayrışmış hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün.Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti iki mililitre soğuk PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte üç Percoll gradyanının her birinden iki mililitreyi en çok konsantreden en az konsantreye doğru dikkatlice katmanlayın. Daha sonra, merkezkaç yoğunluk gradyan ayrımı için üst gradyan katmanına dikkatlice iki mililitre kemik iliği hücresi süspansiyonu ekleyin.Santrifüjlemenin sonunda, bandı %64 ve %72 gradyan arayüzünden dikkatlice çıkarın ve nötrofilleri soğuk PBS'de yıkayın. Daha sonra peleti saymak için buz üzerinde 100 mikrolitre taze PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri aşılanmış CD11c-YFP alıcı hayvanlara intravenöz enjeksiyon için 100 mikrolitre PBS konsantrasyonu başına beş kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin. Evlat edinme transferinden 12 saat sonra, anestezi uygulanmış alıcı hayvanı 37 santigrat derece ısıtılmış bir yüzey üzerinde özelleştirilmiş bir cerrahi tahta üzerine yerleştirin ve tıraş ve tüy dökücü bir krem ile farenin boynundaki tüyleri alın.Fareyi, trakeanın entübasyonunu kolaylaştıran bir açıyla baş pozisyonun dışında olacak şekilde plastik fare pozisyonunun üzerine yerleştirin ve ön ayakları, pençeleri ve kuyruğu cerrahi bantla sabitleyin. Gözlere merhem sürün ve maruz kalan cildi dezenfekte edin. Daha sonra, üst göğüs ile mandibulanın alt noktasından geçen çizgi arasında boynun medial ekseni boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın ve trakeayı görselleştirmek için cilt yamalarını ve tükürük bezlerini yanal olarak hareket ettirin.Trakeayı dikkatlice incelemek için forseps kullanın, fareyi bir kateterle entübe edin ve hemen yapay ventilasyonu başlatın. Kateter yüksekliğini ve yönünü sabitlemek için cerrahi tahta üzerindeki bir çubuğa bağlı bir cerrahi kanca kullanın ve trakeayı çeneye kadar açığa çıkarın. Trakeayı vazelin ile çevreleyin ve trakeayı birkaç damla ılık PBS ile nemlendirin.Daha sonra metal bir tutucuya bir lamel yapıştırın ve lamelin cerrahi preparatın üzerine yerleştirilmesine izin vermek için tutucuyu XYZ tercümanına vidalayın. Dokuyu görüntüleme için yeterince uzun süre stabil tutmak için trakeayı düzgün bir şekilde açığa çıkarmak ve uzatmak ve lamel ile hafifçe bastırmak çok önemlidir. İn vivo hızlandırılmış görüntüleme için, cerrahi paneli iki fotonlu mikroskobun 37 santigrat derece inkübasyon odasına yerleştirin ve lamel üzerine bir damla su ekleyin.Kurulumu ortaladıktan ve trakeal dokuya odaklandıktan sonra, tarama frekansını 520 x 520 piksel, 440 x 440 mikrometre görüş alanı ve çizgi ortalaması bir ile 800 hertz'e ayarlayın. Titanyum safir lazerleri, uyarma floroforlarına göre uygun dalga boyuna ve güç yüzdesine ayarlayın ve eşzamanlı uyarma ile 3D ve hızlandırılmış çekim modunu ayarlayın. Ardından, z ekseni boyunca üç mikrometrelik bir adım boyutuna sahip 50 mikrometrelik bir aralık tanımlayın ve 30 dakika boyunca her 30 saniyede bir görüntü kaydedin.Bu deney kurulumunu takiben, 30 dakikalık bir izleme süresi boyunca enfekte trakea içinde yerinde stabil 4D görüntüler yakalanabilir. 4D görüntülerin analizi, dendritik hücre ile işe alınan nötrofil hareketi arasında, ikincisi tarafından gösterilen önemli ölçüde daha hızlı bir hız ile önemli farklılıklar olduğunu ortaya koymaktadır. Dendritik hücrelerin karmaşık morfolojisi, hücre takibinde sık sık hatalara neden olur, bu da ölçülen yönlü davranışta daha kısa süreli ve artan bir varyansa sahip izler üretir.Bu nedenle, iz süresi dikkate alınarak yönlülüğü ölçmek için sağlam bir metrik oluşturuldu ve dendritik hücrelere kıyasla nötrofillerin yönlülüğünde önemli bir fark ortaya çıktı. Ek olarak, nötrofiller ve dendritik hücreler arasındaki mesafenin hesaplanması, zaman içinde temaslarının tespit edilmesine ve analizine izin verir, bu temsili deneydeki bazı nötrofiller dendritik hücrelerle çok sayıda kısa temas oluşturur ve bazıları görüntüleme süresi boyunca dendritik hücrelerle herhangi bir temas oluşturmaz. Ayrıca, nötrofiller ve dendritik hücreler arasındaki mesafenin zaman içindeki ortalama eğiliminin incelenmesi, hücrelerin genel konumunun incelenmesini kolaylaştırırken, belirli hücrelerdeki eğilimin araştırılması, her bir hücrenin davranışının karakterizasyonuna izin verir.Bu prosedürü bilerek, enfekte trakeadaki farklı bağışıklık hücrelerinin alımlarının nicelikini ve karakterizasyonunu değerlendirmek için trakeanın akış sitometrisi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Herhangi bir grip virüsü türüyle çalışmanın, fareye uyarlanmış olsa bile, tehlikeli olabileceğini ve bu nedenle her prosedürün biyogüvenlik seviye iki koşul altında gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

imaging-cell-interaction-tracheal-mucosa-during-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Influenza A virusu ile aynı anda enfeksiyon asemptomatik sırasında invazif pnömokok hastalığına indüksiyonu karıştığı faktörlerden...

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

Biz roman laboratuar araçları ve timus intravital görüntü elde etmek için protokoller geliştirdik. Bizim tekniği T hücre gelişimi oluşur timus içinde "nişler" belirlenmesinde yardımcı olacaktır.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

İnsan influenza A virüsü için sistemik ve lokalize zebra balığı enfeksiyon modelleri gösterilmiştir. Sistemik bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı antiviral ilaçları taramak için kullanılabilir. Lokalize bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı konakçı bağışıklık hücresi tepkilerini karakterize etmek için kullanılabilir.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

İntravital floresan mikroskopi, lökosit-endotel etkileşimlerini ve kılcal perfüzyonu gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir akciğer görüntüleme sistemi kullanarak pulmoner mikrosirkülasyondaki bu parametreleri görüntüleme ve ölçme yöntemlerini açıklar.

Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Bu protokol, IAV'nin intranazal uygulaması ve fare akciğer hasarının aşağı akış analizi ve akciğer hücre tiplerinde ilişkili transkripsiyonel değişiklikler için talimatlar sağlar.

İnfluenza Enfeksiyonu Sonrası Displastik ve Fonksiyonel Akciğer Alveoler Onarımının Modellenmesi

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

Keşfedin iki fotonlu intravital mikroskopi yöntemiyle fare trakeal mukozasında grip virüsü enfeksiyonu sırasında bağışıklık hücre etkileşimlerini canlı görüntüleme. Bu protokol nötrofil ve dendritik hücre dinamiklerini analiz eder.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi (Video) | JoVE Journal

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Daha fazla video keşfet