İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Bu yöntem, solunum yolu enfeksiyonları sırasında bağışıklık hücrelerinin etkileşimlerinin dinamikleri hakkında havadaki patojenlere karşı bağışıklık tepkilerinin incelenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit cerrahi boyunca trakeal epitelin parlak ve stabil 4D görüntülerini elde etme yeteneğidir. Bu yöntem, influenza enfeksiyonu sırasında nötrofil ve litik hücre etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, farklı bağışıklık hücrelerinin veya havadaki patojenlerin çalışmasına da uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, stabil ve minimal iltihaplı bir ameliyatı sürdürmekte zorlanacaktır. Ayrıca, kalp kusurlarının varlığı nedeniyle görüntü analizi zor olabilir. İntranazal influenza enfeksiyonu için, anestezi uygulanmış altı ila sekiz haftalık bir CD11c-YFP faresini sırtüstü pozisyona getirin ve ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek derin sedasyonu onaylayın.

Pipeti sol burun deliğine yakın bir yere yerleştirerek, fare 15 mikrolitrelik PR8 aşısının tamamını soluyana kadar yaklaşık 20 saniye arayla burun boşluğuna küçük damlacıklar dağıtın. İki ila beş dakika sonra, 15 mikrolitre virüsü aynı şekilde sağ burun deliğine verin. Aşının tamamı verildiğinde, farenin normal nefes aldığını onaylayın ve hayvanı, tamamen iyileşene kadar izleme ile lateral dekübitte kafesine yerleştirin.

Enfeksiyondan üç gün sonra, transgenik CFP eksprese eden bir fareden hem femorayı hem de tibiaları çıkarın ve kemikleri forseps ile nazikçe temizleyin. Kemik epifizini kesin ve kemik iliğini her kemikten steril soğuk PBS ile buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüpe akıtmak için 26 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Kemik iliğinin tamamı toplandığında, iliği iğne ucundan birkaç kez aspire edin ve ayrışmış hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti iki mililitre soğuk PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte üç Percoll gradyanının her birinden iki mililitreyi en çok konsantreden en az konsantreye doğru dikkatlice katmanlayın. Daha sonra, merkezkaç yoğunluk gradyan ayrımı için üst gradyan katmanına dikkatlice iki mililitre kemik iliği hücresi süspansiyonu ekleyin.

Santrifüjlemenin sonunda, bandı %64 ve %72 gradyan arayüzünden dikkatlice çıkarın ve nötrofilleri soğuk PBS'de yıkayın. Daha sonra peleti saymak için buz üzerinde 100 mikrolitre taze PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri aşılanmış CD11c-YFP alıcı hayvanlara intravenöz enjeksiyon için 100 mikrolitre PBS konsantrasyonu başına beş kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin. Evlat edinme transferinden 12 saat sonra, anestezi uygulanmış alıcı hayvanı 37 santigrat derece ısıtılmış bir yüzey üzerinde özelleştirilmiş bir cerrahi tahta üzerine yerleştirin ve tıraş ve tüy dökücü bir krem ile farenin boynundaki tüyleri alın.

Fareyi, trakeanın entübasyonunu kolaylaştıran bir açıyla baş pozisyonun dışında olacak şekilde plastik fare pozisyonunun üzerine yerleştirin ve ön ayakları, pençeleri ve kuyruğu cerrahi bantla sabitleyin. Gözlere merhem sürün ve maruz kalan cildi dezenfekte edin. Daha sonra, üst göğüs ile mandibulanın alt noktasından geçen çizgi arasında boynun medial ekseni boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın ve trakeayı görselleştirmek için cilt yamalarını ve tükürük bezlerini yanal olarak hareket ettirin.

Trakeayı dikkatlice incelemek için forseps kullanın, fareyi bir kateterle entübe edin ve hemen yapay ventilasyonu başlatın. Kateter yüksekliğini ve yönünü sabitlemek için cerrahi tahta üzerindeki bir çubuğa bağlı bir cerrahi kanca kullanın ve trakeayı çeneye kadar açığa çıkarın. Trakeayı vazelin ile çevreleyin ve trakeayı birkaç damla ılık PBS ile nemlendirin.

Daha sonra metal bir tutucuya bir lamel yapıştırın ve lamelin cerrahi preparatın üzerine yerleştirilmesine izin vermek için tutucuyu XYZ tercümanına vidalayın. Dokuyu görüntüleme için yeterince uzun süre stabil tutmak için trakeayı düzgün bir şekilde açığa çıkarmak ve uzatmak ve lamel ile hafifçe bastırmak çok önemlidir. İn vivo hızlandırılmış görüntüleme için, cerrahi paneli iki fotonlu mikroskobun 37 santigrat derece inkübasyon odasına yerleştirin ve lamel üzerine bir damla su ekleyin.

Kurulumu ortaladıktan ve trakeal dokuya odaklandıktan sonra, tarama frekansını 520 x 520 piksel, 440 x 440 mikrometre görüş alanı ve çizgi ortalaması bir ile 800 hertz'e ayarlayın. Titanyum safir lazerleri, uyarma floroforlarına göre uygun dalga boyuna ve güç yüzdesine ayarlayın ve eşzamanlı uyarma ile 3D ve hızlandırılmış çekim modunu ayarlayın. Ardından, z ekseni boyunca üç mikrometrelik bir adım boyutuna sahip 50 mikrometrelik bir aralık tanımlayın ve 30 dakika boyunca her 30 saniyede bir görüntü kaydedin.

Bu deney kurulumunu takiben, 30 dakikalık bir izleme süresi boyunca enfekte trakea içinde yerinde stabil 4D görüntüler yakalanabilir. 4D görüntülerin analizi, dendritik hücre ile işe alınan nötrofil hareketi arasında, ikincisi tarafından gösterilen önemli ölçüde daha hızlı bir hız ile önemli farklılıklar olduğunu ortaya koymaktadır. Dendritik hücrelerin karmaşık morfolojisi, hücre takibinde sık sık hatalara neden olur, bu da ölçülen yönlü davranışta daha kısa süreli ve artan bir varyansa sahip izler üretir.

Bu nedenle, iz süresi dikkate alınarak yönlülüğü ölçmek için sağlam bir metrik oluşturuldu ve dendritik hücrelere kıyasla nötrofillerin yönlülüğünde önemli bir fark ortaya çıktı. Ek olarak, nötrofiller ve dendritik hücreler arasındaki mesafenin hesaplanması, zaman içinde temaslarının tespit edilmesine ve analizine izin verir, bu temsili deneydeki bazı nötrofiller dendritik hücrelerle çok sayıda kısa temas oluşturur ve bazıları görüntüleme süresi boyunca dendritik hücrelerle herhangi bir temas oluşturmaz. Ayrıca, nötrofiller ve dendritik hücreler arasındaki mesafenin zaman içindeki ortalama eğiliminin incelenmesi, hücrelerin genel konumunun incelenmesini kolaylaştırırken, belirli hücrelerdeki eğilimin araştırılması, her bir hücrenin davranışının karakterizasyonuna izin verir.

Bu prosedürü bilerek, enfekte trakeadaki farklı bağışıklık hücrelerinin alımlarının nicelikini ve karakterizasyonunu değerlendirmek için trakeanın akış sitometrisi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Herhangi bir grip virüsü türüyle çalışmanın, fareye uyarlanmış olsa bile, tehlikeli olabileceğini ve bu nedenle her prosedürün biyogüvenlik seviye iki koşul altında gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.