Name: MUB40 peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Öğrenin MUB40 peptidi kullanarak nötrofil aracılıklı iltihaplanma olaylarını nasıl algılayacağınızı. Bu yöntem, canlı ve sabitlenmiş dokularda nötrofilleri spesifik olarak etiketleyerek iltihabi hastalıkların teşhisine katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Fondation Laurette Fugain (Eğer-2015-15) (B.S.M.) tarafından desteklenen ve ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.) verir.

Tüm yöntem tanımlamak burada gözden geçirilmiş ve onaylanmış Fransız kuruluşlarca CoRC (Comite de Recherche Clinique), CPP (Comite de koruma des Personnes) ve CNIL (komisyon Nationale Informatique et Liberté).
1. Fluorescently nötrofil histopatoloji doku ile boyama MUB40 etiketli
<ol><li>Histopatoloji için doku elde etmek için en fazla 4 h örnek kalınlığına bağlı olarak doku/biyopsisi bölümleri % 4 paraformaldehyde (PFA) 30 dk için uygun bir birimdeki düzeltmek. Örnekleri fiksasyon sırasında 4 ° C buzdolabında yerleştirin. Not: Alternatif fiksasyon yöntemleri/zamanlamaları kullanıcının benzersiz ihtiyaçlarına göre yedek olabilir.<ol>
<li>PFA kaldırmak ve örnek 4 gece kadar s için 4 ° C'de yer % 16 sükroz çözüm örnek tamamen karşılamak için yeterli hacim ile ekleyin.</li>
		<li>% 16 sükroz çözüm çıkarın ve % 30 sükroz çözüm örnek tamamen kapsayacak kadar geniş bir ses seviyesinde ekleyin ve 4 gece kadar s için 4 ° C'de yerleştirin.</li>
		<li>% 30 sükroz çözümü kaldırmak ve doku kağıt havlu ile fazla çözümden kapalı leke. Doku bölümü en iyi kesim ısı (OCT) medya yerleştirin ve 2-methylbutane bir kuru buz-etanol banyosunda (-72 ° C) soğutmalı içinde ek-kıpırdama. (~ 2 dakika sonra) donmuş bir kez, 2-methylbutane blokları kaldırmak ve tüm blokları bittiğinde ve uzun süreli depolama için hazır olana kuru buza koyun. Uzun süreli depolama için-80 ° C'de donmuş blok saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kes,-80 ° C dondurucudan çıkarıp ve-20 ° equilibrate için C bir gecede yer onları doku taşlarıdır önceki gece.<ol>
<li>Bir cryostat kullanarak, OCT gömülü doku 10 - 30 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin ve yüksek kaliteli cam slaytlara absorbe. Not: Kalın veya ince dilimleri deneysel gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Bir balmumu kalem veya diğer hidrofobik yöntemi, cam slayt üzerinde doku dilim çevresinde bir kutu çizin ve kurumaya bırakın.</li>
		<li>1:1,000 seyreltme MUB40gerçekleştirerek boyama çözüm hazırlamak-Cy5 (ya da Diğer Floresan MUB40yorum, hisse senedi 1 mg/mL solüsyon) % 0,1 saponin PBS çözümde. En iyi son MUB40 konsantrasyon 1 μg/mL olması gerekir. Not: Son düşük konsantrasyonlarda kullanılabilir (0,1-0,01 μg/mL) ama sinyal yoğunluğu azaltmak için neden olabilir. Dikkat: Saponin toz nefes tahrişe neden olabilir. Bir kabin veya korumalı alanda saponin tartmak emin olun. Alternatif permeabilization yöntemleri Triton gibi kullanılabilir. Üretici tarafından önerilen konsantrasyonları ek işaretleyicileri ekleyin (Örn., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, floresan antikor).</li>
		<li>Yavaşça % 0,1 saponin-PBS çözeltisi içine cam slayt üç kez daldırma.</li>
		<li>Dikkatle doku bölüm etrafında uzak aşırı sıvı leke ve tamamen doku bölümü kapsayacak şekilde boyama yeterli çözüm ekleyin. Slayt buharlaşma önlemek ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya nem odası içine koyun. Işıktan korunan devam et.</li>
		<li>Yavaşça slayt % 0,1 saponin PBS çözüm 3 içine daldırma x. Sonra yavaşça slayt PBS çözüm 3 içine daldırma x. Son olarak, yavaşça daldırma distile H2O slayta 3 x. Dikkatli bir şekilde aşırı sıvı slayt kuru.</li>
		<li>Montaj Orta (20 mM Tris pH 8.0, % 0.5 N-propil gallat, % 90 gliserol) doku dilim yanındaki küçük bir miktar (~ 20 μL) ekleyin ve hafifçe aşağı bir cam coverslip cam slayt üstünde yatıyordu. Yavaşça ve eşit coverslip doku bölümü basın ve bir kağıt havlu kullanarak, dikkatle coverslip kenarları dışarı herhangi bir montaj medyayı çıkarın.</li>
		<li>Bağlı slayt kuvvetlendirmek montaj medya izin vermek 24 h için karanlık bir kabine yerleştirin. Alternatif olarak, bağlı slayt 37 ° C için 1 h yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İstenen edinme yöntemine göre floresan mikroskop doku dilimleri görüntü.</li>
</ol>2. görsel olarak nötrofil harekete geçirmek ile Retro-Inverso-MUB40-Cy5 peptid
<ol><li>İnsan nötrofil aşağıdaki iletişim kuralı kullanılarak elde edilir. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak ve anoksik kabine gece kalmak koyun. Oksijen maruz nötrofil etkinleştirmek ve daha fazla hücre ölüm16,17teşvik etmeye başlayacaktır. Not: Nötrofiller alternatif olarak "tezgah" MUB40için saf-deneyler; etiketleme Ancak, oksijen pozlama nötrofil harekete geçirmek etkilemeye başlar unutmayın.<ol>
<li>Ertesi gün eriyik hazırlayın: Eriyik 1 [% 0,9 sodyum klorür (NaCl)]: H2O. filtre çözümü 500 mL NaCl 4,5 g ekleyin. Çözüm 2 (dextran % 6): 6 g dextran için 100 mL NaCl %0.9 çözümde ekleyin. Çözüm 3 (çamaşır arabellek): bir son 2 mM EDTA konsantrasyon için PBS pH 7.2 ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) geçiyoruz. Öyle ki son BSA konsantrasyonu % 10 w/v kullanımdan hemen önce Sığır serum albumin (BSA) PBS/EDTA çözümde geçiyoruz.</li>
		<li>650 x g 20 dk olmadan tatili için de kan toplama tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Ayrılmış kan aksatmadan, kan toplama tüpler 50 mL konik tüp içinde bir anoksik kabine ve toplamak plazma kesirler (üst) aktarın.</li>
		<li>Plazma içeren tüp anoksik kabine ve trombosit cips sonlarıyla 20 dk santrifüj 2,900 x g de kaldırın.</li>
		<li>Pelleted trombosit aksatmadan, yavaşça plazma tüp anoksik kabine ve damlalıklı trombosit zavallı plazma (bundan sonra "plazma" olarak da adlandırılır) bir taze 50 mL tüp içine içine geri aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kırmızı kan hücrelerinin ayrılması lökosit<ol>
<li>2.1.3. adımdaki kırmızı kan hücreleri (RBCs) içeren borular kullanarak., konik 50 mL tüp (5 kan toplama tüp içeriği 50 mL tüp başına) içine RBCs birleştirmek.</li>
		<li>Toplam hacim 44 mL ulaşıncaya kadar % 0,9 NaCl ekleyin. 6 mL dextran %6 (son) ekleyin.</li>
		<li>10 - 20 kez tüp ters çevirme tarafından kan/dextran karışımı karışımı yavaşça. Tüp tortu için en az 30 dakika izin ver.</li>
		<li>Sedimantasyon meydana gelen ise 15 mL konik tüp plazmada 5.8 mL 4,2 mL Percoll çözeltisi eklenerek Percoll degrade hazırlamak ve de tüp ters çevirme tarafından karıştırın.</li>
		<li>Dextran üst kısmını pipetting kırmızı kan hücreleri önlemek çalışırken toplamak.</li>
		<li>Vidalı kapak sıkın, anoksik odasından dextran tüpü çıkarması ve 300 x g sonlu 10 dk de tüp santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Dikkatle pelleted hücreleri bozmadan anoksik odasına tüpü yerleştirin ve pipetting yolu ile sıvı kaldırın.</li>
		<li>Yavaşça hücre Pelet yeniden 1 mL plazma askıya alma ve çok yavaş Percoll çözüm en üstüne ekleyin. Hücrelerin üstüne pipetting zaman katmanları karıştırma teşvik değil dikkatli olun.</li>
		<li>Dikkatle Percoll çözüm tüp anoksik odası (karıştırma kaçınarak) ve 800 x g, santrifüj sonları olmadan 20 dk için kaldırın. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) Percoll çözüm yüzeyde kalır ve nötrofil RBCs ile cips.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RBCs kirletici kaldırma<ol>
<li>Arabellek çözüm 700 μL PBS + % 10 BSA arabellek yıkama 14 mL için ekleyerek yıkama 14 mL hazırlayın.</li>
		<li>Percoll çözüm tüp anoksik odasına koyun. Percoll ve PBMCs pipetting üzerinden kaldırmak ve arabellek Çözüm yıkama 1 mL pelleted hücreleri yeniden askıya alma. Pelet yeniden askıya olmak bulaşıcı RBCs nedeniyle kırmızı bir renk olacak.</li>
		<li>Anti-CD235a (glycophorin) manyetik boncuklar 200 μL yeniden askıya alınmış hücrelere ekleme, karışımı yavaşça ve en az 15 dk için kuluçkaya. Böylece onlar-ebilmek var olmak çıkarmak bu adım manyetik boncuklar ile bulaşıcı RBCs yükler.</li>
		<li>Yıkama yıkama 2 mL ayrılık sütunla tampon 3 x.</li>
		<li>15 mL konik tüp ayrılık sütununun altında tutarak, sütunun üst nötrofil/RBC karışıma yavaş yavaş pipette. Onlar akışı olarak 15 mL konik tüp hücrelerde toplamak. Akış ile bulutlu olmalı ve kırmızı rengini sütuna bağlı kalan RBCs nedeniyle kaybetmek.</li>
		<li>Arabellek sütunun üst için yıkama 2 mL ekleyin ve aynı 15 mL konik tüp toplamak. 2 mL yıkama yılı sonuna kadar akışı aracılığıyla tüm nötrofil toplanmıştır belirten açık olmalıdır.</li>
		<li>Nötrofil eşit dağılımı sağlamak ve hücre sayımı için 10 μL toplamak için tüp karışımı yavaşça. Amacıyla sayım hücre için son hacim unutmayın. Standart herhangi bir hücreyi sayma yöntemi ile toplam sayısı numaralandırır.</li>
		<li>Nötrofil tüp anoksik odasından kaldırın ve 300 x g sonları ile 20 dk için de nötrofiller santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Posalı nötrofil anoksik odanın içine yerleştirin ve pipetting yolu ile çamaşır arabellek kaldırın. Nötrofil Pelet plazma 10 en fazla hücre yoğunluğu ile yeniden askıya7 PMN/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numaralandırma arıtılmış nötrofil ve MUB40 kullanarak görselleştirme<ol>
<li>RI-MUB401 μL eklemek-Cy5 (1 mg/mL) 1 ml Rosewell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta fenol red olmadan. De pipetting tarafından karıştırın.</li>
		<li>Sanki reaktif aktive güçlü bir nötrofil N-formylmethionyl-leucyl-Fenilalanin (FMLP), eklenir bu iletişim kuralının amacı gereği, sonucu açıklanan olmuştur. FMLP 1 mikron RPMI/RI-MUB40' a Ekle-Cy5 tüp ve pipetting ile karışımı yukarı ve aşağı. Not: Her deneysel işlemin ele alınmaktadır sorular bağlı olarak bu noktadan sonra farklı olacaktır.</li>
		<li>1 mL RPMI/RI-MUB40transfer-Cy5/FMLP karışımı bir cam alt mikroskobu yemek için. Bu yemek için saflaştırılmış hücre 106 toplam nötrofiller için karşılık gelen bir birim eklemek. Pipetting tarafından hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Çanak ters bir Floresan Mikroskobu yerleştirin ve resim alma başlatın. Örneğin, bu temel görüntüleri önce nötrofil aktive reaktif FMLP veya bakteri gibi eklenmesi önerilir. Bu örnekte, RPMI/RI-MUB40edinimi başlatmak-Cy5/nötrofil ve bir sonraki timepoint, nötrofil aktive reaktif cam tabak içine pipette ve resim alma devam. Not: Aşağıdaki adımları için değişiklik bilimsel ihtiyaçlarına göre yapılabilir.</li>
		<li>Süreç olarak kullanılan belirli mikroskop ile ilgilidir görüntüleri/zaman-lapse film satın aldı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+Homeostasis%2C+Immunity%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li>
<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%3A+neutral+no+more%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li>
<li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li>
<li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology & Medicine. , (2018).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9160655">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6G%2B+neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li>
<li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li>
<li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+biology%22%5BJournal%5D)">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li>
<li>Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li>
<li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).</li>
<li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).</li>
<li>Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc%CE%B3RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li>
<li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li>
<li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li>
</ol>

B.S.M. bir mucit MUB40 patent üzerinde listelenir:
MUB40: Avrupa Patent EP11290403.2, 09/09/2011.
RI-MUB40: Avrupa Patent AP No 17306746.3, 11/12/17.

Burada, iki deneyleri MUB40 peptid nötrofil inflamasyon ve harekete geçirmek için kullanılan açıklanır. Biz nasıl MUB40 nötrofil histopatoloji bölümlerde ya da canlı arıtılmış nötrofil kullanarak onların harekete geçirmek durum göstermek-ebilmek açığa vurmak göstermek. MUB40 boyama reaktifi kullanmak için kritik adımlar olarak başka bir floresan algılama yöntemi ile aynıdır. Floresan sinyallerin ve güncelliği ve yeterli çamaşır adımlar arka plan boyama kaldırmak için atılmıştır özen göste...

Nötrofil bir doğuştan gelen bağışıklık sisteminin birincil silah ve rutin olarak inflamasyon vücut etrafında siteler için işe. Nötrofil çalışma büyük ölçüde bozulmuş onların kısa ömrü vitro (az 8 h) ve sınırlı algılama araçları bazal koşullar altında veya aktivasyon sonra olmuştur. Burada, sabit/permeabilized örneklerinde memeli nötrofil geniş ve belirli algılanması için iyi sınanmış bir protokol mevcut. Ayrıca canlı nötrofil MUB40ile boyama için detaylı bir protokol sağlar. Canlı nötrofil boyama iletişim kuralını kullanarak, zamanlama ve nötrofil harekete geçirmek konumunu kesin olarak belirlemiş. Bu iletişim kuralı nötrofil harekete geçirmek ya da granül yayın eğitim almak isteyen araştırmacılar için idealdir. Antimikrobiyal işlevlerini, nötrofil şimdi immunomodulatory hücreler çeşitli hastalıklar ve immün yanıt (doğuştan gelen ve edinilmiş)1,2yer olarak takdir edilmektedir. Nötrofil yüksek numaralarından enfekte dokularda, inflamatuar tümörler3, IBS ve Crohn flare-up4sırasında ve romatoid artrit (synovia gibi bulaşıcı olmayan iltihap alanlarında en inflamatuar doku mevcut RA) hastalar5. Nötrofil önceden biçimlendirilmiş granül azurophil (α), özel (β1), Tersiyer (B2) granülleri ve salgı veziküller (γ)6adlı dört sınıfları içerir. Geçiş inflamatuar sitesine üzerine işe nötrofil aktif hale ve sırayla granül içeriği daha fazla istihdamı teşvik ve katkıda bulunur (yapışma, antimikrobiyal bileşikleri ve immunomodulatory molekülleri oluşan), salgılar enfeksiyon çözünürlük (aynı zamanda için ana bilgisayar doku hasarı)7. Nötrofil olarak kabul edilir süre önemli bir özelliği, orada bugüne kadar doğuştan gelen bağışıklık kaç algılama reaktifler onlara eğitim kullanılabilir, ve hatta daha az bu yaşam nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Monoklonal antikor Ly - 6 G2 veya özel olarak nötrofil granül bazal koşullar (Örneğin, myeloperoxidase altında depolanan proteinler gibi hücre yüzeyine maruz antijenlere karşı oluşturulan nötrofil tespit geçerli yöntemleri itimat Laktoferrin). Onların güçlü bağlama, ışık hassasiyeti ve çeşitli tahlil koşullarda çok yönlülük monoklonal antikorlar avantajları şunlardır. Ancak, özellikle kullanarak monoklonal antikorlar ve anti-Ly - 6 G birçok downsides vardır. Ly - 6 G mevcut myeloid hücrelerin bir çoğunluğu kemik iliği ve Eozinofiller de dahil olmak üzere tüm granülosit olduğu gibi bu downsides özgüllüğü, içerir; Böylece, nötrofil eozinofil üzerinden bu marker ile deşifre daha fazla kompleksleri yaklaşımlar8gerektirir. Başka bir sık tradeoff monoklonal antikorlar ile birden fazla hayvan türleri ile karşılaştırma çalışmaları zorlaştırıyor onların kez sınırlı ana özgüllük, aralıktır. Üçüncü ise bir antikor algılama yöntemleri özellikle canlı hücreleri veya içinde vivo kullanırken, hücre işlevi bozabilir veya hücre aktivasyonu için kurşun potansiyellerini dezavantajıdır. Örneğin, yönetim, anti-Ly - 6G farelere yaygın nötrofil tükenmesi ve geçici nötropeni9uygulanır. Ayrıca antikor enjeksiyon nötrofil antitümör işlev10teşvik edebilir kanıtlanmıştır. Son olarak, antikor algılama nötrofil hücre etkinleştirme durumunu ortaya koymuyor.
Biz 40-amino asit peptid MUB40deneyleri bir sayısını nötrofil vitro ve in vivo koşulları altında etiket gibi canlı nötrofil11etkinleştirme durumunu tahlil için kullanılabilir, denilen belirledik. MUB40 MUB7012, aslında onun yetenek mukus13,14bağlamak için açıklanan Lactobacillus reuteri yüzey mukus-bağlayıcı proteinin bir etki elde edilir. MUB40 nötrofil özgü ve Tersiyer granül yüksek konsantrasyonlarda bulunur glikozile Laktoferrin ile etkileşim kurar. MUB40 histopatoloji veya floresan aktif hücre sağlam sabit nötrofil boyama için (FACS) iletişim kuralları sıralama mevcut standart permeabilization adımlarda bu tanecikler için gösterilebilir. Canlı nötrofil Inaktif bir durumda tutulur MUB40 peptid granül içeriğinden söz konusu değildir ve hücreleri marker ile pozitif leke değil. Harekete geçirmek MUB40 maruz laktoferrin bağlamak ve sağlam ile peptid boyama için yol. Böylece, MUB40 arıtılmış nötrofil, yapım o bulaşıcı süreci takip etmek çekici bir işaretleyici etkinleştirme durumunu belirlemek için kullanılabilir. Aktif nötrofil yaşamak için bağlama yeteneği aynı zamanda canlı hayvan modellerinde (Örneğin, bir fare artrit modeli15) nötrofil iltihap alanları tespit etmek için bir araç olarak kullanılacak MUB40 sağlar. Bu el yazması ayrıntılı nasıl fluorescently MUB40 etiketli iletişim kuralları nötrofil Histoloji doku ve nasıl canlı arıtılmış nötrofil vitroaktivasyonu tahlil ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Floresan MUB40 peptit (diğer konjuge floroforlarla kullanılabilir)</td></tr><tr><td>RI-MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Retro-inverso floresan MUB40 peptidi. D-amino asitlerle sentezlenir ve proteazlara dirençli (diğer konjuge floroforlarla birlikte mevcuttur)</td></tr><tr><td>Parformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Histoloji için fiksatif</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>Fazla PFA'yı çıkarmak için kullanılan çözelti</td></tr><tr><td>Optimal Kesme Sıcaklığı Bileşiği (OCT)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>Kriyostat kesitinden önce dokuyu dondurmak için kullanılır</td></tr><tr><td>2-Metilbütan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td>Kriyostat kesitinden önce dokuyu dondurmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00974</td><td>Dokuyu dondurmak için kuru buz banyosu için kullanılır</td></tr><tr><td>Leica Kriyostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1520</td><td>Dokuları kesitlere ayırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Cam mikroskopi slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-101</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>Hi hassas lamel</td></tr><tr><td>Dako kalem&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Doku boyama sırasında sıvı kaybını önlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>IF boyama için hücrelere nüfuz etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>Lekeleri DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Phalloidin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Aktini bağlar</td></tr><tr><td>Altın antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>IF sinyalini ve fotobleachinge direnci uzatır</td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>IF slaytlarını görüntülemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Anoksik Kabin</td><td>Çeşitli</td><td></td> Canlı <td>inaktive nötrofillerin saflaştırılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Çeşitli Sodyum Klorür NaCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Yıkama tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>MACS BSA tamponu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>Yıkama tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td>Nötrofil saflaştırması için gradyan</td></tr><tr><td>CD235a glikoforin manyetik mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td>Kirletici RBC'leri çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>LS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Nötrofillerden RBC'lerin uzaklaştırılmasında kullanılır</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı içermeyen RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8755</td><td>Nötrofil tahlilleri için kullanılır</td></tr></tbody></table>

mub40 peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Burada, biz MUB40, yüksek konsantrasyonlarda nötrofil özel ve Tersiyer granül depolanan glikozile laktoferrin bağlama yeteneği ile sentezlenmiş bir peptid kullanımını içeren bir protokol sağlar. Nasıl Birleşik MUB40 doğrudan bir fluorophore için bu protokolü ayrıntıları bu canlı hücre Imaging'de nötrofil etkinleştirme ve de-granülasyon için tahlil için kullanılabilir ne kadar sabit/permeabilized dokularda de nötrofiller leke için kullanılabilir. Nötrofil algılama yöntemleri her zaman bazı uygulamalar için uygun değildir species-specific monoklonal antikorlar sınırlı olmalıdır. MUB40 hücre zarı nüfuz etmez ve böylece sigara-aktif/sigara-permeabilized nötrofil içinde depolanan laktoferrin üzerinden söz konusu değildir. MUB40 tane laktoferrin geniş ana bilgisayar aralığından, özellikle birden fazla araştırma modeli, ilgili çalışmalarda sonuçları karşılaştırmak için faydalı hale tanıma yararı yinelenen reaktifler sayısını azaltarak ve protokolleri kolaylaştırarak tek adım boyama yoluyla.

Sonuçları MUB40-histopatoloji slaytlardan lekeli dokular genellikle tek tek hücreleri doku dağınık ortaya. MUB40 lactoferrin, nötrofil granül bulunması ve bölümlere olan leke bırakır. Böylece, tipik olarak görülen punctate boyama veya sinyal çeşitli büyük ayrılmış alanlarda bireysel nötrofil (Şekil 1) geliyor. DAPI MUB40 sinyal lekeli hücre ile birlikte yerelleştirilmesine yardımcı gibi ikinci bir hücre işaretçisi eklemek yara...

Burada, sabit/permeabilized Histoloji bölümlerde nötrofil var olup olmadığını belirlemek ve canlı arıtılmış nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Özellikle, MUB40 peptid laktoferrin nötrofil özgü ve Tersiyer granül mevcut bağlar. Pozlama permeabilization veya nötrofil harekete geçirmek granül İçindekiler nötrofil işaretleme için sağlar.

MUB40 peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40, laktoferrin'e bağlanan ve şimdiye kadar test edilen insan ve tüm memeli doku örneklerinde spesifik bir tespite olanak tanıyan yeni bir nötrofil belirtecidir. Nötrofilleri MUB40 ile etiketlemek kolay, hızlı ve özeldir. Şimdi bizim laboratuvarda yaygın olarak kullanılan ve bu tekniğin etkisi inflamatuar hastalıkların tanısı doğru uzanır.Başlamak için, metin protokolüne göre bir, iki ve üç numaralı çözümleri hazırlayın ve bunları bir gecede anoksik bir kabine yerleştirin. Daha sonra, 650 g'de toplanan kan tüplerini 20 dakika santrifüj edin ve hücreleri plazma fraksiyonundan ayırın. Ayrılmış kanı bozmadan tüpleri anoksik kabine aktarın ve plazma fraksiyonlarını 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Bundan sonra anoksik dolaptan plazma tüpünü çıkarın ve 20 dakika boyunca 2900 g santrifüj. Peletli trombositleri bozmamaya özen gösteriyor, tüpü anoksik kabine aktarın ve trombosit zayıf plazmasını 50 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Kan toplama tüpleri kullanarak, konik 50 mililitrelik tüp kırmızı kan hücreleri birleştirmek.Daha sonra, toplam hacmi 44 mililitre ulaşana kadar% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve% 6 dekstran altı mililitre ekleyin. Kan ve dekstran karışımını hafifçe karıştırmak için tüpü 10 ila 20 kez ters çevirin ve tüpün en az 30 dakika tortu letmesine izin verin. Tüp tortuları iken, plazma 5.8 mililitre percoll çözeltisi 4.2 mililitre ekleyerek bir Percoll gradyan hazırlamak ve karıştırmak için tüp ters.Daha sonra, dextran üst kısmını içeren nötrofil toplamak, pipet kırmızı kan hücreleri için değil dikkat. Vida kapağını sıkın, dekstran tüpünü anoksik dolaptan çıkarın ve tüpü 300 g'da 10 dakika santrifüj edin. Peletli hücreleri rahatsız etmemeye özen gösteriyor, tüpü anoksik kabine geri yerleştirin.Daha sonra, pipetleme ile sıvı çıkarın. Bir mililitre plazmadaki peleti yavaşça askıya alın. Yavaş yavaş Percoll çözeltisinin üstlerine resuspended hücreleri ekleyin.Percoll çözelti tüpünü anoksik dolaptan dikkatlice çıkarın ve 800 g'da 20 dakika boyunca nötrofillerden ayırmak için santrifüj edin. Daha sonra, metin protokolüne göre 14 mililitre yıkama tampon çözeltisi hazırlayın. Sonra, anoksik kabine Percoll tüp yerleştirin.Percoll ve PBMCs kaldırmak ve yıkama tampon çözeltisi bir mililitre içinde pelet içeren nötrofil yeniden askıya almak için bir pipet kullanın. Sonra, yeniden askıya alınan hücrelere 200 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Hücreleri ve boncukları en az 15 dakika karıştırıp kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, iki mililitre yıkama tamponu ile iki kez ayırma sütunu yıkayın. Sütunun altında yeni, 15 mililitrelik konik bir tüp tutarken, yavaş yavaş kolon aracılığıyla nötrofil kırmızı kan hücresi karışımı pipet. Sütundan akan bulutlu olmalı ve kırmızı rengini kaybetmeli, nötrofillerin kalan kırmızı kan hücrelerinden tamamen ayrıştığını doğrular.Sütunun üst kısmında yıkama tampon iki mililitre ekleyin ve aynı tüp içinde akış toplamak. Bu yıkamanın sonunda, akış açık olmalıdır. Nötrofillerin eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için toplama tüpünü yavaşça karıştırın.Daha sonra hücre sayma akışı ndan 10 mikrolitre toplandı. Bundan sonra, anoksik dolaptan nötrofil tüp çıkarın ve 20 dakika boyunca 300 g tüp santrifüj. Tortulanmış nötrofilleri anoksik kabine geri yerleştirin ve pipetleme yoluyla yıkama tamponu çıkarın.Sonra, plazmadaki peleti askıya alın. BIR mikrolitre RI-MUB40-Cy5'i bir mililitre RPMI-1640 ortamına, fenol kırmızısı olmadan ekleyin ve pipetleme yoluyla karıştırın. Daha sonra, karıştırmak için FMLP çözeltisi ve pipet bir mikrolitre ekleyin.Karışımı cam alt mikroskopi kabına aktarın. Sonra çanak saflaştırılmış hücrelerin uygun bir hacim ekleyin. Son olarak, ters floresan mikroskobun içine çanak yerleştirin ve görüntü edinimi başlar.Bu protokolde, MUB40 FMLP ile simülasyon üzerine nötrofil salgısını saptamak için canlı hücreler üzerinde kullanılmıştır. Laktoferrin de dahil olmak üzere granül içeriğinin serbest bırakılması dinamikleri, zaman içinde görselleştirilmiş olabilir, burada macenta. MUB40 ayrıca sabit nötrofillerde de kullanılabilir.Burada, zamanlanmış bir seride fagosiyefle floresan boncuklar. Nötrofil granül içeriği burada mavi olarak etiketlenmiştir. Nötrofiller erken zaman noktalarında hücre boyaması çok az gösterdi ve yavaş yavaş, RI-MUB40 etiketleme zaman içinde arttı, plazma membran ve boncuk yüzeyinde hem de.MUB40, metin şekillerinde gösterildiği gibi nötrofillerin özellikle saptanması için sabit inflamatuar dokularda da kullanılabilir. Burada laboratuarımızda rutin olarak uygulanan nötrofil arınma prosedürünü anlatıyoruz. Başka bir yöntem uygundur, MUB40-Cy5 etiketleme hala çalışacaktır.Nötrofil özellikle arınma sonrası MUB40 ile etiketlenebilir, ya da doğrudan hasta veya hayvan modellerinden iltihaplı doku. Kullanımı genişletmek için çeşitli MUB40 türevleri tasarlanmıştır. Gelişiminden sonra, bu teknik inflamasyon alanında araştırmacı için yol açtı, inflamatuar hastalıklarda nötrofilik işe ve aktivasyon keşfetmek için.

the-mub40-peptide-for-use-detecting-neutrophil-mediated-inflammation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, miyeloperoksidaz içeren azurofilik granülleri serbest bırakmak için nötrofillerin uyarılmasını içeren, fare nötrofillerindeki azurofilik granüllerin bir degranülasyon testini göstermektedir. Sonraki enzimatik reaksiyon, miyeloperoksidaz seviyelerini ölçmek için kullanılır ve nötrofil aktivasyonu hakkında bilgi sağlar.

Aktivasyonu Takiben Nötrofillerde Azurofilik Granüllerin Degranülasyonunu İzlemek İçin Bir Test

Biz inflamatuvar aşamaları ayırt için invaziv olmayan bir görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Luminol sistemik teslim nötrofillerinde MPO aktivitesi bağlı akut inflamasyon alanları ortaya koymaktadır. Bunun aksine, lusigenin enjeksiyon makrofajlarda Phox aktivitesi bağlı kronik inflamasyon görselleştirme sağlar.

In vivo Görüntüleme Yöntemi Akut ve Kronik İltihap ayırt

Lipidler hücresel fonksiyonlarda önemli rol oynadıkları bilinmektedir. Burada, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması için HPTLC ve HPLC birlikte kullanarak, kolesterol seviyesi üzerinde durularak, nötrofillerin lipit bileşimini belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Burada nötrofil göçünü ve infiltrasyonu hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için üç yöntem sayılmaktadır. Bu yöntemler nötrofil göç hedefleyen umut verici terapötik keşfetmek için kullanılabilir.

Farelerde Nötrofillerin Göçü ve İnfiltrasyonunun Saptanması

Burada açıklanan protokoller, nötrofil proteazların insan balgamındaki aktivitesini görselleştirmek ve ölçmek için bir kılavuz sağlar. Bu tür analizlerin uygulamaları anti-enflamatuar tedavilerin değerlendirilmesinden biyobelirteç doğrulamasına, ilaç taramasına ve büyük kohort klinik çalışmalarına kadar yayılmaktadır.

İnsan Balgam Örneklerinde Nötrofil Elastase ve Katepsin G Aktivitesinin İzlenmesi

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Aktive edilmiş nötrofillerden türetilen nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarının, miyeloperoksidaz konjuge DNA ve nötrofil elastaz konjuge DNA komplekslerinin iki bileşenini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent test tekniği için bir protokol sunuyoruz.

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Bu protokol, farklı sinyal yollarından gelen fonksiyonları kapsamak için bir tarama yöntemi olarak kullanılacak bir dizi nötrofil fonksiyonel tahlil içerir. Protokol, hücre canlılığının, saflığının, reaktif oksijen türlerinin üretiminin, gerçek zamanlı göçün, fagositozun ve nötrofil hücre dışı tuzakların bir ön önerisinin ilk ve basit bir değerlendirmesini içerir.

Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği

Bu protokol, tümörle ilişkili proteaz aktivitelerinin ex vivo analizi yoluyla bakım noktası kanser teşhisini mümkün kılan bir CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testini açıklar.

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN) birçok hastalıkta önemli ölçüde artar. LDN genellikle hücre sıralaması yoluyla izole edilir. Saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem sunuyoruz. Periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra, hücreler manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, manyetik kolonlar aracılığıyla ayrılır.

Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi

Öğrenin MUB40 peptidi kullanarak nötrofil aracılıklı iltihaplanma olaylarını nasıl algılayacağınızı. Bu yöntem, canlı ve sabitlenmiş dokularda nötrofilleri spesifik olarak etiketleyerek iltihabi hastalıkların teşhisine katkı sağlar.

MUB₄₀ peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için

Daha fazla video keşfet