Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

Sistein-zengin peptidler onların disülfür bağlantısı bağlı olarak farklı üç boyutlu yapılar içine katlayın. Arabellek oksidasyon istenen disülfür bağlantı yol değil tek tek disülfit izomerler hedeflenen sentezi gereklidir. Protokol ile 3 disülfür bağ peptidler ve NMR ve MS/MS çalışmaları kullanarak onların yapısal analiz sentez seçici fırsatlar.

Bu yöntem, disülfür zengin peptidlerin sentezlenmesi ve buna karşılık gelen disülfür köprü deseninin belirlenmesi gibi peptid sentezi alanındaki temel soruların yanıtlandırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı disülfür bondend peptid izomerlerinin seçici sentezine ve sonraki kimyasal ve yapısal karakterizasyonuna olanak sağlamasıdır. Her disülfür zengin peptid farklı davrandığını, çünkü genellikle bireylerin bu yönteme yeni mücadele edecek.

Sentez ve analiz kısmen bireysel peptid veya protein için optimize edilmesi gerekebilir. Metin protokolünde listelenen reaktifleri ilgili damarlara aktarın ve katı faz peptid sentezleyicisinin uygun raketlerine yerleştirin. Daha sonra reaksiyon sütunlarına 100 miligram kuru rezorin ekleyin ve sentezleyicinin raketine koyun.

Metin protokolünde ayrıntılı olarak katı faz peptid sentezini başlatın. Sentez tamamlandıktan sonra, bir gecede resenin liyofilize. Şimdi reçinden peptid cleave ve yan zincirleri derin koruma gerçekleştirmek.

Bunu yapmak için kurutulmuş resini 12 mililitrelik bir tüpte birleştirin ve buz üzerinde sıfır santigrat dereceye kadar soğutun. İlk olarak, bir çöpçü karışımı 150 mikrolitre ekleyin, sonra reçin 100 miligram başına% 95 trifloroasetik asit bir mililitre ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında üç saat hafifçe sallayarak bırakın.

Şimdi, karışımı cam frit'ten süzün. Sekiz ila 10 mililitre dietil eter başına bir mililitre dekolte karışımında buz gibi dietil eterle ayrı ayrı doldurulan tüplerdeki filtratları toplayın. Peptit beyaz bir katı olarak çökelti.

Metin protokolünde açıklandığı gibi tüpleri durulayıp santrifüj ettikten sonra peptidleri dondurun-kurulayın. Yarı preparatif kromatografi ile doğrusal öncül arındırmak için 15 mililitrelik bir tüp ham peptit yaklaşık 70 miligram ekleyin. Sonra su için% 0.1 TFA ve bire bir Asetonitil ham peptid eritin.

Dakikada 10 mililitre lik bir akış hızında 120 dakika içinde sıfır ila %50 Eluent B degradesi kullanarak peptit karışımını ayırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi kütle spektrometresi ve HPLC analizi için seçilen kesirleri hazırlayın ve göründükleri gibi tek tek tüplerdeki kesirleri toplayın. Kesirleri dondurun-kurulayın ve eş kesirlerini birleştirin.

İlk oksidasyonu gerçekleştirerek disülfür bağlarının seçici oluşumunu başlatın. Bunu yapmak için, bir isopropanol su karışımı 105 mililitre dondurularak kurutulmuş lineer peptid 15 miligram çözün. Karışımı temel koşullar altında havada 12-48 saat bekletin.

Adım adım oksidasyon prosedürü çok önemlidir. Reaksiyon kontrolleri bireysel disülfür zengin oluşumunu sağlamak için her üç oksidasyon adımda alınır. Üçüncü oksidasyon en önemli olandır, çünkü en uygun reaksiyon süresi aşıldığında disülfür karıştırma oluşabilir.

Şimdi ikinci oksidasyonu gerçekleştirin. Bir isopropanol su, bir azı hidroklorik asit karışımı 105 mililitre dondurularak kurutulmuş peptid 15 miligram çözün. Çözeltiye metanolde 0,1 molar iyot çözeltisi 158 mikrolitre ekleyin.

Oksidasyon tamamlanana kadar oda sıcaklığında reaksiyonu karıştırın. Daha sonra suya bir azı azı lı askorbik asit79 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun. Son olarak üçüncü oksidasyonu gerçekleştirin.

Bir çöpçü karışımı içeren TFA 5,5 mililitre dondurulmuş kurutulmuş peptit 15 miligram çözünür. Diethyl eter sekiz ila on mililitre başına reaksiyon çözeltisi bir mililitre soğuk dietil eter içeren tüpler içine peptid çökeltmek. 15 mililitrelik bir tüp için dondurulmuş ham ürün 15 miligram peptit arıtma gerçekleştirmek için.

Ham ürünü % 0,1 TFA ve suya bire bir Asetonitil karışımı nı kullanarak HPLC numune halkasının hacminde çözün. Tam çözünme kadar girdap sonra, 3400 kez G.5 mililitreşşile 3.6 mililitrekarışımı çizin ve enjeksiyon döngüsü içine herhangi bir hava kabarcıkları olmadan örnek enjekte bir dakikadan çözelti santrifüj. HPLC sistemine enjeksiyonuyguluyoruz.

Dakikada 10 mililitre lik bir akış hızında 120 dakika içinde sıfır ila %50 Eluent B degradesi kullanarak peptit karışımını arındırın. Göründükleri gibi tek tek tüplerde kesirleri toplayın. Çalışma tamamlandıktan sonra, metinde açıklandığı gibi MS ve HPLC çözümlemesi için seçilen kesirleri hazırlayın.

Tüm kesirleri dondurun-kurutun ve eksi 20 derecede saklayın. Analitik HPLC gerçekleştirmek için, peptit fraksiyonları veya reaksiyon kontrolleri örneklerini bir HPLC şişesine aktarın ve suya bire bir Asetonitril%0,1 TFA karışımında çözün. HPLC şişesini, her numuneden 250 mikrolitre enjekte etmek üzere ayarlanmış analitik ters faz HPLC'nin otomatik örnekleyicisine yerleştirin.

Asetonitile %0,1 TFA olarak suda %0,1 TFA'lık bir degrade elüsyon sistemi kullanın. Amino asit analizi yapmak için, 100 mikrogram saf peptidi 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne aktarın ve altı molar HCL'nin 200 mikrolitresinde tozu çözün. Çözeltiyi cam ampule aktardıktan sonra, boynunu bunsen brülör alevi ile ısıtarak ampulü kapatın.

Daha sonra hidroliz için 110 santigrat derecede 24 saat boyunca bir ısıtma bloğunda ampul tutan bir cam tüp yerleştirin. 24 saat sonra ampulu açın ve çözeltiyi iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Çözeltiyi altmış derecede altı saat ve bir rotasyonel vakum konsantratöründe 210 kez G'de santrifüj edin.

Daha sonra hidrolize ürünü numunelenmiş seyreltme tamponunun 192 mikrolitresinde çözün ve çözeltiyi mikro santrifüj süzgecinden geçirilmesi. Numuneyi 2300 kez G'de bir dakika santrifüj ettikten sonra, 100 mikrolitre filtratı bir amino asit analiz örnek tüpüne aktarın. Tüpü amino asit analizörüne yerleştirin ve analize başlayın.

Bu geçmiş azaltma protokolü sırasında, kütle spektrometresi ile sonraki disülfür analizi için vazgeçilmez olan kappa mido metillenmiş türlerin iki veya dört kat Elde edilmesi için çeşitli reaksiyon kontrolleri yapmak çok önemlidir. İlk olarak 600 mikrogram saf peptidin 0,05 molar sitrat tamponunun 1,2 mililitreiçinde TCEP içeren çözünür. Karışımı oda sıcaklığında, sıfırdan 30 dakikaya kadar değişen birkaç 100 mikrolitrelik reaksiyon kontrol numunesi alarak kuluçkaya yatırın.

Reaksiyonu durdurmak ve serbest tiyol gruplarının karbonil metilasyonunu gerçekleştirmek için numuneleri 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpünde 300 mikrolitre alkillenme tamponuyla karıştırın. %10 TFA ve su 100 mikrolitre ekleyerek beş dakika sonra reaksiyonu durdurun ve kuru buz üzerinde örnekleri saklayın. Şimdi metin protokolünde ayrıntılı olarak örnekler üzerinde HPLC gerçekleştirin.

Oksitlenmiş formların MS/MS analizi için toplanan her fraksiyonun küçük bir miktarını 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne aktarın. Kalan peptiti suda %0.1 TFA olarak çözün ve 10 milimolar son TCEP konsantrasyonu elde etmek için 100 milimolar TCEP çözeltisi üzerinde uygun bir hacim ekleyin. Bu noktada, selektif sistein alkilasyonu peptit dizilimi ile kontrol edilebilir.

Ortada iki peptid ile disülfür köprü deseninin belirlenmesi mümkündür. Farklı izomerlerin NMR analizi bireysel peptit yapılarını ortaya çıkarmak için yapılır. En düşük enerjiye sahip 20 yapı ve farklı izomerlerin disülfür bağlantısı gösterilmiştir.

Özellikle, disülfit bağlantısının kesin olarak tanımlanması için ters fazlı HPLC MS/MS parçalanması ve NMR analizi nin bir kombinasyonu gereklidir. Kök ortalama kare sapma değerinin karşılaştırılması, katı bir peptidin çoğunlukla daha iyi çözülmüş bir NMR yapısına yol açtığını açıklığa kavuşturmuştur. Bu video, istenilen disülfür bağı deseni ile peptidleri seçici olarak nasıl sentezlediğinize bir örnek verecektir.

Ayrıca ihale kütle spektrometresi ile doğru disülfür bağlantısını kontrol etme ve NMR spektroskopisi ile üç boyutlu bir yapı elde etme imkanı nı gösterir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra, peptid sentezi alanında araştırmacıların disülfür bağı desenlerinin üç boyutlu yapı için önemini ve dolayısıyla bu tür peptid izomerlerinin etkinliğini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu prosedürü takiben, belirli biyolojik hedefte farklı peptid izomerlerinin yapı aktivitesi ilişkilerine ışık almak için ASAS aktivitesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.

Bu yöntem conotoxins sentezi ve analizi içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer disülfür köprü peptidler ve fenzenler gibi proteinler uygulanabilir, disülfür açısından zengin hayvan toksinleri ve diğer çoklu sistein içeren moleküller.