Name: Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, Holstein süt sığırı karaciğer mitokondrilerinde oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetiğini ölçme yöntemini. Bu teknik, mitokondriyal verimlilik ve yem verimliliği ilişkisini doğrudan değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, gıda hayvan sağlığı, UC Davis Veteriner Tıp Fakültesi için merkezi aracılığıyla Alltech ve USDA kapak fon tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntemleri, protokolü ve burada açıklanan çalışmaları Davis kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kaliforniya Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. alma karaciğer biyopsisi bir Holstein süt ineği
Not: Karaciğer biyopsisi lisanslı bir veteriner tarafından gerçekleştirilmelidir. Karaciğer biyopsi inekler konumlandırıldığı sitenin süt gerçekleştirilebilir. Laktasyondaki süt inekleri normalde Sağılan devam edebilir ve süt gıda tedariki önce veya sonra yordamın geri olması gerekmez. Bu en az 4 kişi karaciğer biyopsisi süt ineği üzerinde gerçekleştirmek için gereken önerilir: biyopsi, ineğin beyinsizler biyopsi alan ve hayvan hastalıklarıyla ilgili, laborant palaşma kaleme dışındaki korumak için durmak için bir hayvan işleyicisi gerçekleştirmek için a hayvan hastalıklarıyla ilgili er, malzemeleri ve biyopsi örnek için ve veteriner ve bir araç (Şekil 1) ve karaciğer örnek almak ve mitokondrial yalıtım başlamak için bir teknisyen arkasında olabilir temiz alan korumak.
<ol><li>Karaciğer biyopsisi önce bir ay vermek clostridia aşı inekler. Isıyla cerrahi havlu, biyopsi enstrümanı, neşter sahipleri ve cerrahî donanımlar tarafından cerrahi paketleri oluşturun.</li>
	<li>Bir gün önce karaciğer biyopsisi, inek subkutan boynundan Ceftiofur hidroklorid 0,044 mL/kg vücut ağırlığı ile enjekte. Monitör inek sıcaklık, alımı ve dışkı puanları normal fonksiyonu için taban çizgisi olarak kullanın.</li>
	<li>Mitokondri yalıtım medya (MIM) containining 220 mM mannitol, 70 mM sükroz, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA ve %0,1 (w/v) yağ asidi ücretsiz BSA, pH 7.4 4 ° C'de oluşturmak Örnek başına yaklaşık 30 mL-ecek var gerek.</li>
	<li>İnek (Şekil 2) bir dersin bir yular ile gerektiği gibi fiziksel olarak kullanan dizginlemek. Yular kullanarak, kafasını ağından sol tarafına bağla. Gerekirse, kimyasal bir kısıtlama (Xylazine hidroklorür 100 mg/mL IV 0.010-0,015 adlı mg/kg vücut ağırlığı) kullanılabilir.</li>
	<li>Biyopsi alanının sağ 10 - 11. interkostal alan (Şekil 3) bulunur. Düz bir çizgi doğru yumru bacak sağ omuz noktasına çizmek. Bu hat ile 10-11. interkostal alan kesiştiği biyopsi sitedir. 10 cm kare alan (Şekil 4) traş tarafından biyopsi olmak inek bölgeyi sterilize. Alan dairesel bir hareket kullanarak % 10 providone bodur (Şekil 5) ile yıkayın. Alan sprey % 70 etanol çözüm (Şekil 6). Tekrar providone ve etanol yıkar. Not: Holstein süt sığır et sığırı kıyasla biraz daha farklı bir konumda ciğer var.</li>
	<li>%2 lidokain HCl (10-15 mL) yerel olarak deri ve temel kas ve bağ dokusu (Şekil 7) anestezi sağlamak için bölgeye enjekte et. Tekrar providone ve % 70 etanol yıkar. Not: Sinir uçlarının deride vardır ve kaslı değil iç organlar, yalnızca bir yerel anesthestic ama gereklidir. En az, inek sadece biraz baskı ve acısız biyopsi işlemi sırasında hissetmeniz gerekir.</li>
	<li>1-2 cm bıçak-kesi 10-11. interkostal alan (Şekil 8) deri yoluyla olun. Schackelford-Courtney sığır karaciğer biyopsisi enstrüman deri yoluyla geçmek ve diyafram ve karaciğer (Şekil 9, Şekil 10) içine devam ederken hafif bir kranial yönde biyopsi enstrümanı doğrudan. 1 g örnek karaciğer ve enstrüman (Şekil 11) kaldırın. Deri dikiş yerleşim (Şekil 12) ile kapatın.</li>
	<li>Karaciğer örnek örnek, buz hemen mitokondri yalıtım için karşılamak için yeterli MIM bir konik boru yerleştirin</li>
	<li>Onay kesi için herhangi bir kızarıklık, şişlik, ısı, veya biyopsi 24 saat içinde ağrı ve inek günde bir sonraki 3 gün (Şekil 13) için subkutan boynundan Ceftiofur hidroklorid 0,044 mL/kg vücut ağırlığı ile enjekte. İneğin sıcaklık, alımı ve dışkı puanları günlük 1 hafta sonra karaciğer biyopsisi için izleyin. Ateşi geliştirirse, antibiyotik veteriner takdirine devam edin. Not: bir inek karaciğer biyopsisi sonra 1s içinde dokunmak kesi site, recumbancy, kızarıklık, ısı veya reaksiyon tekme gibi ağrı, belirtileri varsa 1 mg/kg vücut ağırlığı IV enjeksiyonu sonucu flunixin meglumin ağrı ve iltihaplanma hafifletmek için kullanılabilir. İkinci bir enjeksiyon gerekirse yönetilebilir.</li>
	<li>Dikişler 7 gün sonra biyopsi kaldırın.</li>
</ol>2. süt ineği karaciğer üzerinden mitokondri yalıtma
<ol><li>En kısa zamanda karaciğer örnek inek kaldırıldıktan sonra karaciğer örnek kırmızı kan hücreleri kaldırmak ve ince örnek makasla kıyma MIM (adım 1.3) yıkayın. Karaciğer doku nemli tutmak için yeterli yalıtım ortamı içeren bir soğutulmuş ölçek kıyılmış.</li>
	<li>Kıyılmış karaciğer buzun içinde inkübe ve MIM (1:4 w/v) içeren 0,16 mm izni bir teflon havaneli ile 30 mL Cam şişe yerleştirin.</li>
	<li>500 rpm'de teflon havaneli ile 4 vuruş/dk dk için karaciğer örnek lunaparkçı. Not: Karaciğer homogenate bir buz dolu ölçek MIM içinde tüm işlemi sırasında tutulur ve tüm aşağıdaki Santrifüjü adımları 4 ° C'de tamamlanır</li>
	<li>Homogenate vasıl 500 x g 10 dk santrifüj kapasitesi, Pelet atmak, soğutulmuş santrifüj tüpü süpernatant aktarmak ve ardından elde edilen süpernatant 10.000 x g mitokondrial Pelet elde etmek 10 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Resuspend ve Pelet MIM yağ asidi ücretsiz BSA ile 10 mL yıkayın ve 8100 x g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Resuspend ve Pelet MIM yağ asidi ücretsiz BSA olmadan 10 mL yıkayın ve 8100 x g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Pelet yalıtım medya 200 µL içinde askıya alma ve oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik deneyleri için kullanılan kadar buz üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Bicinchoninic asit (BCA) seti üreticisinin Protokolü başına BSA ile standart olarak kullanarak protein konsantrasyonu Pelet süspansiyon (1/100 seyreltme) belirlemek. Tüm protein mitokondrial protein olarak kabul edilir.</li>
</ol>3. ölçme mitokondrial oksijen tüketimi (devlet 4 3 ve devlet)
<ol><li>Oksijen tüketimi medya (OCM) 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2oluşturmak, 5 mM Hepes ve 1 mM EGTA, pH %7,4 0,3 ile 30 ° C'de BSA kakaoyu. Yaklaşık 3 mL örnek başına gerekli olacaktır. Ayrıca 8 μg/mL oligomycin etanol çözeltisi hazırlamak.</li>
	<li>30 ° C'de OCM kuluçkaya Solunum odası, pompa ve oksijen elektrot üretici talimatları (oxygraph sistemi) göre ayarlayın. Oxygraph yazılım zaten bilgisayarda yüklü.</li>
	<li>1 mL OCM solunum odanın içine koyun ve karistirin. Bu çözüm hava ile doymuş hale gelir temin yardımcı olur.</li>
	<li>0.35 mg protein mitokondrial proteinin solunum odasına ekleyin ve sıcaklık 30 ° C'de muhafaza</li>
	<li>Oksijen tüketimi yaklaşık 5 min için kaydedin. Oxygraph sistem kayıtları oksijen konsantrasyonu çok solunum arttıkça oksijen konsantrasyonu azalır. Ne zaman oksijen tüketimi olur sabiti (azalan düz bir çizgi), kayıt oksijen tüketimi (çizgisinin eğimini yoğunlukta oksijen/saat =). Bu temel oksijen tüketimi var.</li>
	<li>Karmaşık etkisizleştirmek için 4 mM Rotenon çözümün 1,25 µL ekleyin ben ve 5 mM süksinat solunum odasında son bir konsantrasyon ulaşmak için 1 M süksinat çözümün 5 µL ekleyin. Bu durum 4 solunum var.</li>
	<li>100 μm kalınlığında solunum odasında son bir konsantrasyon ulaşmak için 100 mM ADP çözeltinin 1 µL ekleyin. Oksijen konsantrasyonu (artan solunum) azalacak ve sonra yaklaşık 5 dk düz bir çizgi haline geldikten sonra. Kayıt oksijen tüketimi (çizgisinin eğimini yoğunlukta oksijen/saat =). Bu durum 3 solunum var.</li>
	<li>İsteğe bağlı: Çalıştır sonunda maksimal solunum ikna etmek için FCCP (0,2 mikron toplam hacim) ekleyin. Solunum için yaklaşık 5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur. Maksimal oksijen tüketimi bu.</li>
	<li>Solunum Denetim oranı (RCR) durum 3 oksijen tüketimi denklemi kullanarak hesaplamak / 4 oksijen tüketimi eyalet.</li>
	<li>Tüm solunum odası dışında çözümler Aspire edin. Odası Çift Kişilik deiyonize su ile birkaç defa durulayın.</li>
</ol>4. ölçme mitokondrial membran potansiyeli (MMP) ve Proton sebep kuvvet (PMF)
<ol><li>80 ng/mL nigericin etanol çözeltisi hazırlamak. Not: Bu kimyasalların etanol içinde çözülür ve etanol etanol elektron taşıma sistemi Böl ve mitchondrial disfonksiyon neden bu yana, 1 μL için eklenir miktarını sınırlamak için her türlü çabayı yapılmalıdır.</li>
	<li>İyice odası Çift Kişilik deiyonize su ile durulama sonra OCM 1 mL solunum odanın içine yerleştirin ve bir manyetik heyecan bar ile karistirin. Bu çözüm hava ile doymuş hale gelir temin yardımcı olur. Kurulum odası için metil-triphenyl-phosphonium (TPMP +) hassas elektrot ekleyin. TPMP + elektrot bir pH metre bağlantısının kurulması ve değerleri pH metre ile okunur.</li>
	<li>Mitokondrial protein 0.35 mg solunum odasına ekleyin.</li>
	<li>Karmaşık ı. kayıt solunum için 2-5 dk (yaklaşık) etkisizleştirmek için 4 mM Rotenon çözümün 1,25 µL ekleyin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur.</li>
	<li>0,56 μL 2.8 µg oligomycin /0.35 mg mitokondrial protein ADP kullanımı engellemek için son bir konsantrasyon için 8 μg/mL oligomycin çözümü ekleyin. Solunum için 2-5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur.</li>
	<li>0,112 μL 80 ng/mL nigericin çözüm pH degrade mitokondriyal iç membran kaldırılması için ekleyin. Solunum için 2-5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur. Not: Elektron taşıma engellemek için kullanılır Rotenon ve oligomycin zincir kompleksi ben ve ATP sentaz, anılan sıraya göre. Nigericin bir elektrot ile ölçülebilir bir K + degrade transmembran S + degradeyi dönüştürmek için eklenir.</li>
	<li>Standart bir eğri hazırlamak için TPMP + 10 mM TPMP + çözüm 5 µL mitokondrial kuluçka ekleyerek. 2,5 μM TPMP + toplam konsantrasyon eklendi bu kadar dört kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Solunum 1 M süksinat 5 μL odasına ekleyerek başlatın.</li>
	<li>İstikrarlı bir izleme elde ettik kadar solunum kaydı ve sonra sistem malonat ekleyerek titre. Malonat eklemeler 0.5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3.0 µL, 6.0 µL, 9.0 µL, sonra 12.5 µL 0,1 mM malonat konsantrasyonları kuluçka odasında 0,1 0,2 0,3, 0.6, 1.2, 1.8 art arda gelen eklemeler elde etmek için malonat çözüm ve 2.5 mM olmalıdır.</li>
	<li>İki elektrot (oksijen ve TPMP+) üzerinden veri toplama. Veri toplama yazılımı oxygraph sisteminden mitokondrial oksijen tüketimi ve mitokondri zar potansiyel simultane ölçümleri toplamak ve değişiklikleri gerçek zamanlı olarak oksijen tüketiminde gözlemlemek için kullanılabilir. Şekil 14 oxygraph sistemi deneme ilerledikçe oksijen tüketimi kayıtları nasıl gösterir.</li>
	<li>MMP üzerinde Nernst denklemi dayalı mV Hesapla: MMP 61,5 günlük = (dış [TPMP +] [TPMP +] eklendi-) x TPMP+ bağlama düzeltme / (0,001 x mg protein/ml x [TPMP +]) Bir TPMP + bağlama düzeltme 0.4 µL/mg mitokondrial protein-1 kullanılır. Örnek hesaplama protokolü konsantrasyonlarda göre: MMP = 0,4 x 61,5 x oturum (5 mikron-2 µM) / (0,001 x 0.35 mg mitokondrial protein/mL x 2 µM) MMP 198.9 = mV</li>
	<li>Oksijen tüketimi vs MMP (Şekil 15) bir grafik olarak çizme tarafından tahmin PMF. PMF 165 membran potansiyeli, oksijen tüketimi bildirilen mV. Not: malonat (0,1-2.5 mM) ile elektron taşıma zinciri Titrating proton sızıntı kinetik yanıt MMP için gösterir. O zaman, MMP oksijen tüketimi karşı komplo proton sızıntı kinetik belirler. PMF ortak membran potansiyeli, oksijen tüketimini hesaplama tarafından belirlenir (165 mV).</li>
	<li>Örnek son çalışması sonunda maksimal solunum teşvik ve TPMP + temel düzeltme için serbest bırakmak için FCCP (0,2 mikron toplam hacim) ekleyin.</li>
	<li>Tüm solunum odası dışında çözümler Aspire edin. Odası Çift Kişilik deiyonize su ile birkaç defa durulayın. Günün sonunda, odası da birkaç kez etanol ile durulanır.</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li>
<li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+in+metabolic+health%3A+A+genetic+and+environmental+tug+of+war%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li>
<li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+B+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li>
<li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li>
<li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567724909001536">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li>
<li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radicals+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li>
<li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper%2C+Manganese+and+Zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Physiology+Animal+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li>
<li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li>
<li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li>
<li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li>
<li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/archive/2015/194014/abs/">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li>
<li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalliwell%2C+B+%22Free+Radicals+in+Biology+and+Medicine%22">Free Radicals in Biology and Medicine</a>. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nutrient+Requirements+of+Dairy+Cattle%22">Nutrient Requirements of Dairy Cattle</a>. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).</li>
<li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+energy+intake%2C+energy+expenditure%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li>
<li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+immunity%3A+beyond+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li>
<li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li>
<li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression%2C+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li>
<li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li>
<li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759(2008).</li>
<li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li>
<li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioenergetic+health+index%3A+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

En kritik nokta protokolündeki temsilcisi karaciğer doku örneği alma ve mitokondri yalıtım en kısa zamanda biyopsi sonra başlangıcı. Solunum ölçüleri içinde çeşididir inek laboratuvar bir kısa ulaşım zaman nedeniyle düşük (Tablo 1). Taşıma süresini azaltmak için küçük bir laboratuvar süt ofiste kurulmuştur ve mitokondri biyopsi 10 dk içinde izole böylece her toplanan gibi karaciğer örnekleri için office laboratuvar sürüldüler. Kurulum ve proton degradeler kayıt farklılıkları için toplama ve işleme örnekl...

Mitokondri stres çok duyarlıdır ve hücresel çevreleri çok çeşitli metabolik hastalıklar katkıda bulunabilir. Oksijen tüketimi ve mitokondri proton sızıntısı mitokondri sağlık göstergeleri vardır. Bu kağıt tahmin mitokondrial enerji verimliliğinde oksijen tüketimi ve proton sızıntısı olmayan temel RCR kullanarak açıklanan yöntemleri. Bu sonuçlar besin kullanımı1' kayıp enerjinin % 30 için hesap. Oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikleri için metabolik hastalık katkıda bulunur ve azalan enerji verimliliği sonuçları mitokondrial disfonksiyon tanımlayabilirsiniz. Bu yöntemler aynı zamanda mitokondrial solunum üzerinde farklı tedaviler etkisini incelemek için kullanılabilir. Mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik ölçme genel mitokondriyal işlev ve enerjik etkinliğini değerlendirmek için hedeftir.
Hepatik mitokondrial disfonksiyon süt sığır çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Hücresel metabolizma erken emzirme bir enerji açığı ile karşı karşıya zaman karbonhidrat ve lipid yakıtlar arasında geçiş yapma yeteneği sayısı ve mitokondri2hücre işlevi etkilenir. Mitokondri enerji ve artan β-oksidasyon için artan bir talep uyum yeteneği kusurları insülin direnci ile ilişkili hücre içi lipid birikimi yol açabilir ve erken emzirme süt ineklerin yağlı karaciğer oluşumuna yol açabilir. Mitokondri, keton vücut üretim ve kullanımı, site olarak ketozis süt inekleri3önemli bir rol oynayabilir. Mitokondri veya mitokondrial disfonksiyon eksikliği yakıt durumu çevre etkileyecek ve oksijen tüketimi veya RCR değişiklikleri yansıması.
Mitokondrial oksijen tüketimi değişiklikleri yanıt olarak inflamasyon. Yedi günlük eski yumurtlayanlar rastgele Eimeria maxima ve kontrol grubu4ile enfekte bir gruba ayrıldı. Coccidiosis meydan geçmesi değil yumurtlayanlar proton sızıntı ve daha yüksek RCR karaciğer mitokondri artan proton sızıntısı tarafından bir bağışıklık sınamasına yanıt belirten nedeniyle daha az oksijen tüketimi vardı. Proton sızıntı ve reaktif oksijen türleri üretim bir kez mitokondri zar disfonksiyon belirtisi olarak kabul edildi ve enerjik verimliliği için zararlı, şimdi bu protein ve kalsiyum içe mitokondri5 aktarmak için önemlidir Bilindiği ve ısı1nesil için.
Solunum zinciri elektron sızıntı mitokondri reaktif oksijen türleri üretim ve oksidatif hasar mitokondri zar proteinleri, lipidler ve mitokondriyal DNA getirir; Mitokondri yaşlandıkça, hasar için özellikle daha fazla mitokondriyal metabolizma6 ve daha fazla duyarlılık inek hastalığı disfonksiyon neden mtDNA birikir. Pratikte, çok hayvancılık hayvan takviyeleri Cu, Zn ve Mn antioksidan işlevi artırmak için gibi yüksek düzeyde beslenir. Ancak, Cu yüksek düzeyde besleme, Zn ve Mn süt üretimi azalmıştır ve oksijen tüketimi proton sızıntısı (devlet 4 solunum)7nedeniyle arttı.
Sığır enerji verimliliği mitokondriyal işlevde rolünü önceki araştırma mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikler üzerinde odaklanan. Çok az sayıda çalışmalar süt sığır yayınlanmış ve üretim verimliliği sığır mitokondriyal işlev artık yem alımı (RFI) şeklinde en kartları karşılaştırın. Mitokondrial solunum oranları emzikli Holstein inek ve emzikli sığır ciğeri state 3, devlet 4 ve RCR ölçerek incelenmiş değişkenliği (Angus, Brangus ve Hereford)8inekler. Araştırmacılar herhangi bir korelasyon büyüme veya özellikleri sığır için sağım mitokondrial solunum bulamadık ama mitokondrial solunum ve özellikleri Holsteins için sağım arasında bir ilişki rapor vermedi. İki çalışmalarda, RFI sığır mitokondrial solunum oranları (state 3, devlet 4 ve RCR) kas mitokondri9,10' karşılaştırıldı. DMI cevaben mitokondrial solunum oranları değişti ve düşük oranları daha az verimli sığır eti steers ile ilişkili bulunmuştur. Başka bir çalışmada, yüksek veya düşük RFI bulls gelen ederek RFI mitokondrial solunum oranları ve proton sızıntı kinetik Döl11iki grubu ile karşılaştırıldığında. Kazanç kazanç sonuç içinde sığır mitokondrial solunum etkisi yapar teyit nedeniyle farklılıklar vardı.
Bu kağıt, RCR 3 antioksidan mineral laktasyondaki süt sığır besleme yanıt ölçmek için yöntemleri kullanılışını karaciğer inceleyerek bir deney sırasında oksijen tüketimi 4 devlet ve devlet 3 solunum ve PMF.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Karaciğer Biyopsisi< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Schackelford-Courtney sığır karaciğer biyopsi aleti</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>Sütür</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>Sütür iğneleri</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Dahil Sütür</td></tr><tr><td>Neşterli</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td> <td># sap ve bıçaklar için</td></tr><tr><td>Ameliyat havluları</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>Şahin tüpleri 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>50 mL şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon iğneleri (22, 2 1/2)</td><td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>yular</td><td>Traktör Tedarik A.Ş.</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>Pamuklu çubuk</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>pamuklu gazlı bez kareler (4x4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>Tıbbi makas</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coccidiosis Aşısı 0.75 şişe/</td><td></td><td></td><td>Tarafından sağlanan Veteriner</td></tr><tr><td>Clostridia Aşısı</td><td></td><td></td><td>Veteriner Hekim Tarafından Sağlanan</td></tr><tr><td>Karaciğer biyopsisi antibiyotikler 3 gün</td><td></td><td></td> boyunca 2 cc / 100 lbs <td>Veteriner</td></tr> Hekim <tr><td>tarafından sağlanır Providone Scrub</td><td>Aspen Veteterinary Resources</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>Etanol% 70</td> <td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin hidroklorür 100 mg / mL IV 0.010-0.015 mg / kg'da vücut ağırlığı</td><td></td><td></td><td>Veteriner Hekim tarafından sağlanan</td></tr><tr><td>% 2 lidokain HCl (10-15 mL)</td><td></td><td></td> <td>Veteriner Hekim tarafından sağlanan</td></tr><tr><td>1 mg / kg IV fluniksin meglumin</td><td></td><td></td> enjeksiyonu <td>Veteriner Hekim tarafından sağlanan</td></tr> <tr><td><güçlü>Mitokondri (karaciğer) izolasyonu< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wheaton flakon 30 mL, 0,16 mm boşluklu Teflon havaneli</td><td>ile Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör Motoru</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör Probu</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Pipet (10 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu Beher (500 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı mikrofüj</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj tüpleri (1.5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Kimyasallar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bikchinoninik asit (BCA) protein tahlil kiti (plaka okuyucu için mikroplakalar)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (yağ asidi içermez)</td> <td>Sigma - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mitokondri izolasyon ortamı oluşturmak için kullanın: 220 mM mannitol, 70 mM sükroz, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ve %0.1 (a/h) yağ asidi içermeyen BSA,&nbsp; pH 7.4 4 ° C'de; C, buzdolabında</td><td></td><td></td><td></td> 2 gün sürecek</tr><tr><td><güçlü>Mitokondriyal Oksijen Takviyesi< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oksigraf Kurulumu + Clark tipi oksijen elektrodu</td><td>Hansatech (PP Sistemleri)</td> <td>OXY1</td><td></td></tr><tr><td>Termoregüle Su Pompası</td><td>Ekipmanları</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>Clark tipi Oksijen elektrodu</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Pipet (1 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>Oxy1 ile birlikte verilir</td></tr><tr><td>Küçük manyetik karıştırma çubuğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet (10 & mu; L)</td> <td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Kimyasallar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mitokondriyal oksijen tüketim ortamı yapmak için kullanın: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes ve 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7.4 30 ° C'de; % 0.3 yağı alınmış BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotenone içeren C (4 mM çözeltisi)</td> <td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>Süksinat (1 M çözeltisi)</td> <td>Sigma - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (100 mM çözeltisi)</td> <td>Sigma - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin (8 & mu çözeltisi; etanolde g / mL)</td> <td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Mitokondriyal Membran Potansiyeli ve Proton Hareket Kuvveti< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TPMP elektrot</td><td>Dünya Hassas Aletleri.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>kimyasal çözeltilerin taze olması gerekmez, ancak çalışmalar arasında bir dondurucuda saklanmaları gerekir</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malonat (0.1 mM çözelti)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin (8 & mu; etanolde g/mL), dondurucuda saklayın</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin (etanolde 80 ng/mL), dondurucuda saklayın</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>TPMP çözeltisi: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes ve 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7.4 30 &°C'de; %0,3 yağı alınmış BSA</td><td></td><td></td><td></td> ile C</tr></tbody></table>

karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oksijen tüketimi, proton sebep kuvvet (PMF) ve proton sızıntı mitokondriyal solunum veya ne kadar iyi mitokondri NADH ve FADH ATP dönüştürmek mümkün ölçülerini vardır. Nasıl verimli oksijen kullanımı ve doğrudan ATP üretmek mitokondri de oksijen ve karbon dioksit ve su besin oksidasyon birincil site olduğundan, besin metabolizma, verimliliği ile ilgilidir hayvanın besin gereksinimleri ve hayvan sağlık. Bu yöntemin amacı farklı ilaçlar, diyetler ve mitokondriyal metabolizma üzerindeki çevresel etkileri etkilerini incelemek için kullanılan mitokondrial solunum incelemektir. Sonuçları proton bağlı solunum (durum 3) ve proton sızıntı bağımlı solunum (devlet 4) ölçülen oksijen tüketimi içerir. Devlet 3 / devlet 4 Solunum oranı solunum denetim oranı (RCR) tanımlanır ve mitokondrial enerjik verimliliği temsil edebilir. Mitokondrial proton sızıntı ADP ATP sentezi verimliliğini azalan dan uncoupling Oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri zar potansiyel (MMP) dağılımı sağlar bir süreç var. Oksijen ve TRMP + Hassas elektrotlar mitokondrial yüzeylerde ve elektron taşıma zinciri inhibitörleri ile durum 3 ve devlet 4 solunum, mitokondri zar PMF (veya ATP üretmek için potansiyel) ölçmek için kullanılır ve proton sızıntısı. Bu yöntem için kısıtlamaları karaciğer dokusu gibi taze olmalı ve tüm biyopsi ve deneyleri az 10 h içinde gerçekleştirilmesi gerekir vardır. Bu toplanan ve bir günde yaklaşık 5 için tek bir kişi tarafından işlenen örneklerin sayısını sınırlar. Ancak, yalnızca 1 g karaciğer doku, bu yüzden örnek gerekli miktarda süt sığır gibi büyük hayvanlarda karaciğer boyutuna göre küçük ve küçük kurtarma zaman gerekli gereklidir.

RCR ve proton sızıntı kinetik gösteren olumlu sonuçları Tablo 1 ve Şekil 15, sırasıyla gösterilir. Bu çalışmada7, RCR ve protein sızıntısı kinetik ölçülen Holstein Süt ineklerin süt 70 gün, inekler 28 gün boyunca 1, Cu, Zn ve Mn 5 farklı seviyelerde beslenen sonra. Devlet 4, en fazla proton sızıntı bağlı solunum, Cu, Mn ve Zn (p &lt; 0,1) mineral alımını tarafından etkilenmiş gibi bir eğilim vardı. Devlet 3 so...

Burada, mitokondrial oksijen tüketimi, beslenme enerji bilimi ve proton sızıntı, verimsizlik birincil nedeni mitokondriyal ATP nesil belirleyici bir kavram ölçme yöntemleri paylaşmak. Bu sonuçlar besin kullanımı mitokondriyal işlev değerlendirmek yardımcı olmak için kayıp enerjinin % 30 için hesap.

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Bu yöntem, mitokondriyal sağlık, enerji verimliliği ve enerji kullanımı gibi enerji alanında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı izole mitokondri oksijen tüketimi doğrudan ölçülür olmasıdır. Diğer hücre içi metabolik süreçler için sonuçların düzeltilmesi gerekmez.Mitokondriyal verimliliğin yem verimliliğini nasıl etkilediğini incelemek istediğimizde ilk olarak süt sığırlarında bu yöntemi sürdürmeye karar verdik. Mitokondriyal izolasyondaki adımların anlaşılması zor olduğundan, tutarlı ve kesin olmaları gerektiğinden, bu yöntemin video gösterimi çok önemlidir. Karaciğer örneği kaldırıldıktan sonra en kısa sürede kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için mitokondri izolasyon medya örnek yıkayın.Makas kullanarak ince doku nemli tutmak için yeterli izolasyon ortamı içeren bir soğutulmuş kabıiçine doku kıyma. Kıyılmış karaciğeri mitokondri izolasyon uğrama içeren 30 mililitrelik cam şişeye aktarın. 0.16 milimetre lik bir açıklığa sahip ve buzda kuluçkaya yatan bir Teflon haşere ekleyin ve dakikada dört vuruşla bir dakika boyunca 500 RPM'de karaciğer örneğini homojenize edin.Bundan sonra, mitokondri izolasyon ortamı içeren bir tüp için homojen aktarın ve bir buz dolu kabın içine yerleştirin. Santrifüj 500 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede homojen. Pelet atın ve soğutulmuş bir santrifüj tüp için supernatant aktarın.Mitokondriyal pelet elde etmek için 10, 000 kez G ve dört derece santigrat 10 dakika sonuçlanan supernatant santrifüj. Yağ asidiiçermeyen BSA ile 10 mililitre mitokondri izolasyon medyasında peleti yeniden askıya alın ve yıkayın. Sonra 8, 100 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derece santrifüj.Supernatant atın ve izolasyon medya 200 mikrolitre pelet resuspend. Oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik tahliller için kullanıma hazır olana kadar buz bu yerleştirin. Standart olarak BSA kullanarak üreticinin talimatları başına bir bicinchoninic asit kiti kullanarak pelet süspansiyon protein konsantrasyonu belirleyin.İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi oksijen tüketim ortamı oluşturun. Oksijen tüketim ortamını 30 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre oksigraf sistemi için solunum odası, pompa ve oksijen elektrotunu ayarlayın.Daha sonra solunum odasına bir mililitre oksijen tüketimi ortamı yerleştirin. Sonra haznemine 0.35 miligram mitokondriyal protein ekleyin. Çözeltinin havayla doymasını sağlamak ve 30 santigrat derecelik bir sıcaklığı korumak için şiddetle karıştırın.Oksijen tüketimini yaklaşık beş dakika kaydedin. Oksijen tüketimi azalan düz bir çizgi ile sabit hale geldiğinde, bunu temel oksijen tüketimi olarak kaydedin. Karmaşık bir inhibe etmek için dört milimolar rotenon çözeltisi 1.25 mikrolitre ekleyin, ve sonra solunum odasında beş milimolar succinate son konsantrasyonulaşmak için bir azı succinate çözeltisi beş mikrolitre ekleyin.Bu durum IV oksijen tüketimidir. Bundan sonra, solunum odasında 100 mikromolar nihai konsantrasyonulaşmak için 100 milimolar ADP çözeltisi bir mikrolitre ekleyin. Oksijen tüketimi yaklaşık beş dakika azalacak ve daha sonra düz bir çizgi haline gelecektir.Bu oksijen tüketimini durum III solunumu olarak kaydedin. Metin protokolünde belirtildiği gibi solunum kontrol oranını hesaplayın. Daha sonra tüm çözeltileri solunum odasından aspire edin.Odayı birkaç kez çift deiyonize suyla durulayın. İlk olarak, bir mikrolitreden daha az eklenen etanol miktarını sınırlayan etanol de nigericin mililitre başına 80 nanogram bir çözüm hazırlamak. Ayrıca, etanol mililitre oligomisin başına sekiz mikrogram bir çözüm hazırlamak.Odayı çift deiyonize suyla iyice duruladıktan sonra, oksijen tüketim ortamının bir mililitresini solunum odasına yerleştirin ve manyetik bir karıştırma çubuğuyla şiddetle karıştırın. Solunum odasına 0.35 miligram mitokondriyal protein ekleyin. Diğer ucunun bir pH metreye düzgün bir şekilde bağlı olduğundan emin olmak için oda kurulumuna metil trifenilfosfonyum duyarlı elektrot ekleyin.Kompleks I.Record solunumu iki ila beş dakika boyunca inhibe etmek için dört milimolar rotenon çözeltisinin 1,25 mikrolitresini ekleyin. Sabit olduğunda oksijen tüketim değerini kaydedin. Daha sonra, ADP kullanımını inhibe etmek için bir oligomisin çözeltisi 0.56 mikrolitre ekleyin.Solunumu yaklaşık 2-5 dakika kaydedin. Sabit olduğunda oksijen tüketim değerini kaydedin. Sonra mitokondriyal iç membran boyunca pH gradyanı kaldırmak için mililitre nigericin çözeltisi başına 80 nanogram 0.112 mikrolitre ekleyin.Solunumu 2-5 dakika kaydedin ve sabit olduğunda oksijen tüketim değerine dikkat edin. Standart bir eğri hazırlamaya başlamak için mitokondriyal kuluçkaya beş mikrolitre 10 milimolar metil trifenifosfonyum çözeltisi ekleyin. Toplam 2,5 konsantrasyona kadar bu eklemeyi dört kez daha tekrarlayın.mikromolar eklenmiştir. Bundan sonra, solunum başlatmak için odasına bir azı çözeltisi çözeltisi beş mikrolitre ekleyin. Kararlı bir iz elde edilene kadar solunumu kaydedin.Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi sistemi titre etmek için malonate ekleyin. Bu çalışmada, RCR ve proton kaçak kinetik süt 70 gün sonra süt bakır, çinko ve manganez farklı düzeylerde 28 gün beslendi sonra süt ölçülür. Devlet IV solunum manganez düşük düzeyde verilen en yüksek olarak görülür, henüz kontrol en düşük, manganez proton sızıntıbağımlı solunum en aza indirmek önemli bir rol oynadığını gösteren.Hepatik proton sızıntıya bağımlı solunum analizi, bu solunumun düşük manganez ile tedavi edilen en yüksek, kontrol ise en düşük olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar düşük manganez grubunun en büyük durum IV solunumuna sahip olduğunu, kontrol grubunun ise en düşük olduğunu doğrulamaktadır. Düşük RFI boğalarından doğan Angus'larda yem verimi yüksek RFI boğalarına göre daha yüksek olsa da, bu mitokondriyal RCR'ye veya proton sızıntısı kinetiklerine yansımadı.Bu işlemi gerçekleştirirken mitokondriyi işlerken tüm şişeleri ve gagaları buzda tutmak önemlidir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra süt ürünleri beslenmesi alanında araştırmacıların karaciğerde yem verimliliği ve mitokondriyal fonksiyondaki mitokondri verimliliğinin rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır. Rotenon ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven takmak, göz koruması ve uygun PPE gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

measuring-liver-mitochondrial-oxygen-consumption-proton-leak-kinetics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kaynak:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros EnstrümanlarıBu video, canlı ve geçirgen memeli hücrelerinde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akışının nasıl kullanıldığını açıklamaktadır. Farklı solunum durumlarını karakterize etmek için digitonin, metabolik substratlar, ADP, bir ayırıcı ve bir inhibitörün sıralı kullanımını gösterir. Ortaya çıkan oksijen akışı profili, tanımlanmış koşullar altında mitokondriyal fonksiyonu ve enerji...

Canlı ve geçirgen hücrelerde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akısı ölçümleri

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Tarla lokasyonlarında yakalanan vahşi hayvanların izole mitokondrilerindeki solunum hızlarını ölçmek için mobil bir laboratuvar tasarladık ve inşa ettik. Burada, mobil bir mitokondriyal laboratuvarın tasarımını ve donanımını ve ilgili laboratuvar protokollerini açıklıyoruz.

Sahada Mitokondriyal Enerjileri Ölçmek için Mobil Mitokondriyal Fizyoloji Laboratuvarının Geliştirilmesi

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.

At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Öğrenin, Holstein süt sığırı karaciğer mitokondrilerinde oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetiğini ölçme yöntemini. Bu teknik, mitokondriyal verimlilik ve yem verimliliği ilişkisini doğrudan değerlendirir.

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme (Video) | JoVE Journal

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Daha fazla video keşfet