Name: Lentiviral vektör-aracılı gen terapisi tetkikine Ex Vivo domuz otolog nakli için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Keşfedin eks vivo gen tedavisi ve otolog hücre nakli yöntemini, domuz karaciğerinde kalıtsal tirozinemi tip 1 tedavisi için. Bu teknik metabolik hastalıklar için umut vadeden bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Duane Meixner destek için gösteri cerrahi işlemler sırasında portal ven enjeksiyon, Steve Krage, Joanne Pederson ve Lori Hillin uzmanlık için teşekkür ederiz. Bu eser Çocuk Hastanesi Minnesota Vakfı ve rejeneratif tıp Minnesota tarafından desteklenmiştir. R.D.H. rejeneratif tıp kariyer geliştirme Ödülü NIH K01 DK106056 ödül ve bir Mayo Kliniği Merkezi üzerinden finanse edildi.

Tüm hayvan yordamları kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilen ve incelenmeli ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından çalışma kuralları önce onaylanmalıdır. Burada açıklanan yordamları büyük beyaz çiftlik erkek ve dişi domuz (% 50 Landrace/50% büyük beyaz genetik arka plan) kadar sağlıklı ve cerrahi için uygun olarak kabul edilir 3 ay yaş için yapıldı.  Hayvan sosyal kurumsal hayvan hastalıklarıyla ilgili kaygı personeli tarafından uyumsuz kabul sürece yerleştirilmiştir.  Hayvanlar chow iki kez günlük ve gözlenen klinik belirtiler için uygun düzeyde en az bir kez her gün bakım personeli tarafından beslenir.
1. ameliyat için hazırlık
<ol><li>5 mg/kg telazol ve 2 mg/kg xylazine intramüsküler sedasyon ikna etmek için yönetmek. Buprenorfin SR subkutan, ameliyat sonrası analjezi için 0,18 mg/kg doz yönetmek (beklenen bu doz analjezi-ecek var olmak en fazla 72 saat). El ile sedasyon doğrulamak yanıt için hayvan kontrol edin.</li>
	<li>Yatıştırıcı bir kez farmakolojik erişim için bir periferik kulak damar damar içi kateter takın.</li>
	<li>İntravenöz 25 mg/kg sülfadiyazin ve kas içi 5 mg/kg ceftiofur pre-operatively yönetmek.<ol>
<li>Normal salin damarlarından kan basıncı ve kalp hızı prosedürü boyunca normal fizyolojik sınırlarda tutmak için yönetmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mide basıncı azaltmak için bir orogastric tüpü yerleştirin. Uygun ölçekli bir Endotrakeal tüp endotrakeal entübasyon gerçekleştirmek için el ile soluk verme algılamak için göğüs sıkıştırarak uygun yerleştirme doğrulayın ve mekanik olarak % 1-3 isoflurane hayvanla hava basarım.</li>
	<li>Elektrokardiyogram (EKG) müşteri adayları, kan basıncı Manşet, sıcaklık probu ve darbe-oksimetre monitör ve kayıt yaşam belirtileri için yerleştirin. Hayvan sırtüstü pozisyonda yerleştirin, göğüs kafesi üzerinden pelvis betadin ile karın bölgesinde fırçalayın ve sterilely üstünü örtmek.</li>
	<li>Konu % 1-3 isoflurane ile cerrahi uçağa anestezi korumak için işlem sırasında havalandırın. Devam hayati değişiklikleri izlemek ve isoflurane buna göre kan basınç kayıpları önemli ölçüde, isoflurane azaltmak ve canlılık, gibi geri yüklemek için kurumsal olarak onaylı Ajanlar başlatırsanız kalp atışı öncesi kesi düzeyde korumak için ayarlayın. intravenöz epinefrin verin.<ol>
<li>Kalp atışı, solunum hızı, kan basıncı ve vücut sıcaklığını izlemek ve büyük hayvan refahı standartları ile uyum sağlamak için kurum özel ilke göre hayvan refah korumak için bir cerrahi işlem kaydı kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Laparoskopik kısmi Hepatectomy
<ol><li>Başlangıç bağlantı noktası site giriş göbek cephalad için bir açık Hassen tekniği kullanarak gerçekleştirin. Karın zarını görselleştirildiği, güvenli bir şekilde karın boşluğuna 12 mm trokar tanıtmak. 5 mm, 30 °, kapsam bu bağlantı noktası üzerinden geçmek.</li>
	<li>CO2 ' ye 15 mmHg ile karın insufflate. Laparoskopik kamera ile doğrudan görselleştirme altında karaciğer sol yanal lobda nirengi iki ek 5 mm bağlantı noktası yerleştirin. Bağlantı noktalarının tam yerleşim boyutu ve hayvan anatomisi bağlı olacaktır.<ol>
<li>Bu noktada, karnın 5 mm bağlantı noktalarından birini yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Karaciğer sol lob büyük yarığın noktasında sol yanal kesimini tanımlar. Bu çatlak tıbbi ve sol yanal kesimleri ayırır. Portal yapıları ile birlikte bir cerrahi zımba kullanarak bu çatlak boyunca hepatik ven güvenli ( Tablo malzemelerigörmek). 60, 45 veya 30 mm uzun vasküler yükler kullanarak zımba üzerinden sıralı atış kullanarak bu çatlak aracılığıyla parankimi transect.<ol>
<li>Yeterli hemostaz sağlamak için kalan karaciğer parenkima rezeksiyon tamamlandığında değerlendirmek. Herhangi bir parankimi koter veya dikiş ile kanamayı kontrol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Endoskopik tutucu ve endoskopik doku alma çanta kullanma karaciğer bölümüne almak.</li>
	<li>Bağlantı noktalarını kaldırmak ve 12 mm bağlantı noktası kesi ile kesintiye uğramış boyutu 0 dikiş orta hat fasya, derin dermal tabaka için çalışan 2-0 dikiş ve subcuticular katman için çalışan 4-0 dikiş için üç katmanlarında kapatın. 5 mm bağlantı noktaları bir katman 2-0 ile kapalı.</li>
	<li>Yer ( Tablo malzemelerigörmek) insizyon steril bir remake.</li>
	<li>Hücreleri az 4 saat içinde hazır olacak, genel anestezi altında hayvanlar post-operatively autotransplantation zamana kadar korumak.</li>
	<li>Alternatif olarak, hücre manipülasyonlar daha uzun süre gerektiriyorsa (Hepatosit pulcuklarının veya üzerinde bu yöntemin tek tek uygulamalara göre daha uzun iletim/seçim süre izin gibi) anestezi ve tekrar kurtarmak hayvan izin anestezik indüksiyon adımları hücreleri hazır olduğunuzda autotransplantation önce.</li>
</ol>3. hepatosit yalıtım
<ol><li>Çözüm sıcaklık 38 ° C üzerine doku giriş öyle ki peristaltik pompa (43 ° C su banyosunda tutulur) sıcak dağılım çözümler sunmak için ayarla perfüzyon ile karaciğer bölümünün maruz büyük gemilerin yerleştirilmesini kateter takın. Tüm boru, ekipman ve çözümleri hücreleri ekimi için uygun olduğundan emin olmak için steril muhafaza edilmelidir.<ol>
<li>Prime pompa ve boru başına II ile ben ve doku başına II teslim başına arasında geçiş yapmak için konumlandırılmış bir stopcock kadar. Stopcock başına getirin ve boru seti, geri kalanı tamamen tanıtımı önlemek için bir satır içi kabarcık tuzak doldurma Başbakan geçiş dokusu içine hava kabarcıkları.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dik kesit portal ven şube ortaya çıkarmak için hepatik dolaşımı kesmek temiz bir enine hazırlamak ve hepatik kateterizasyon için damarlar.</li>
	<li>Perfusate kaçağı önlemek için rahat uygun kateter ile mevcut maruz damarları catheterize. En az 1 portal ve doku yeterli perfüzyon sağlamak için 1 hepatik ven cannulate.<ol>
<li>Catheter(s)-astar/ücretsiz hava var bir damar içine kateter yerleştirmeden önce olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mL/dk, çıkış tüp damar damar 30 saniyede 1 dk. döngüsü için 15-20 dk için tüm kullanılabilir damarlar yoluyla hareket başına ben sıcak sıvı. Sırasında infüzyon, belirlediğim bir tahliye Tüp vakum altında atık bir kaba yordamı tepsisini boşaltın.</li>
	<li>100 mL/dk, damarları ile ben, başına 30 dk toplam üzerinden Bisiklete binme II başına geçin. Başına II sırasında başına II başa rezervuar yeniden yönetim etkin enzim hazırlanması korumak için geri dönüşüm için bir dönüş pompa kullanın. Dönüş pompa çıkış pompa bir değere ayarlayın (Örneğin, 94 mL/dk), aşırı hava kaynak biberondan değil dönmek için dikkatli olmak.<ol>
<li>Karaciğer kapsülü kırılırsa, bu sefer azaltılabilir.</li>
		<li>Eğer karaciğer değil tamamen sindirilmiş (hafif fokal basınç ile çukurlu kalmaz) perfüzyon bir ek 5 dk gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zaman zaman (yaklaşık 5 dakikada) belge yüzey sıcaklığı kabarcık tuzak ve/veya karaciğer tetkikine değil soğuk alıyorsanız emin olmak için. Eğer karaciğer soğuk elde ettiğini (< 35 ° C) daha yakın Karaciğer sıcaklığı 38 ° C'ye geri yüklemek için su banyosu ısı artışı Perfüzyon devam ederken karaciğer blanche gerekir.</li>
	<li>Karaciğer steril plaka veya hücre kültür hood taşınmaya Petri kabına kaldırın. Hepatosit işleme sırasında bütünlüğünü korumak için steril bir örtü ile steril alan kapak.</li>
	<li>Steril örtü karaciğer bölümünden açığa ve karaciğer ile soğuk hepatosit yıkama kitle iletişim araçları (HWM) daldırın. Kapsül makas üstünde sürükleyerek bozabilir. Steril eldivenler, hepatositlerin Orta serbest bırakmak için karaciğer yavaşça masaj.</li>
	<li>HWM tetkikine steril gazlı bez ile geniş (~ 200 mL) santrifüj şişe içeren filtre. Aşağıdaki yordam aracılığıyla tetkikine (hangisi uygunsa) ilk resuspension sonra birden fazla şişe dan hücre Pelet birleştirerek nüsha, yıkayın:<ol>
<li>Santrifüj 50 x g, 5 dk, 4 ° C.</li>
		<li>Aspire edin ve 150 mL HWM resuspend.</li>
		<li>Pelet HWM içinde 3rd yıkama sonra bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir hemasitometre veya başka bir aygıt olarak kullanılabilir kullanarak hücre konsantrasyonu saymak. Bu hücreler gen tedavisi, hücre sıralama veya diğer uzmanlık autotransplantation önce gibi ilgi ex vivo manipülasyon için hazırsınız. HWM son hacim belirli konsantrasyon (hücre/mL) hedeflemek için ayarlanabilir.</li>
</ol>4. hepatosit iletim
<ol><li>Hepatositlerin medyada resuspend (Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta [DMEM], % 10 fetal Sığır serum [FBS], penisilin-streptomisin, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit [HEPES], deksametazon, epidermal büyüme faktörü [EGF] ve NTBC) 1-2 buz üzerinde konik tüp içinde mL başına milyon hücre.</li>
	<li>Oda sıcaklığında lentiviral vektör çözülme ve enfeksiyon (MOI hücreleri bağlamak için) hedef 20 çokluğu, buzda konik tüp ekleyin. Hücre için hücre yüzeyine viral vektör bağlamak 90 dk 10 rpm 4 ° C'de döndürün.</li>
	<li>Tüpler 37 ° C 30-40 dk. ilişkili hücreleri transducing vektör kolaylaştırmak için her 5 dakikada karıştırmak için ters çevir'i transfer.</li>
	<li>Hücreleri 50 x g 4 dk. Resuspend hücre Pelet tuz buz üzerinde istenen konsantrasyon, içinde için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi. Bu yıkama hazırlık herhangi bir ilişkisiz vektöründen kaldırılmasını sağlamak için yineleyin.</li>
	<li>Mümkünse, (Yani, 500.000 başına iyi bir 6 hücre kültür plaka de hücre) hücre canlılığı, adezyon, iletim verimliliği, vb için denetlemek için yeterli aliquots plaka Not: Bu autotransplantation, özellikle aynı gün yordamları için önce bu parametreleri değerlendirmek mümkün değildir kez. Örneğin, burada açıklanan yordamı bir etiketsiz Fah cDNA bağlantıları ve füze rampaları kolayca transplantasyon öncesi tetkikine assayable değildi Alfa-1 antitripsin karaciğer özgü organizatörü, istihdam. Ancak, bu kaplama hücreleri iletim (Western blot üzerindenyani ) başarısı veya yordam genel başarı bir tahmin bir göstergesi olarak autotransplantation sonraki denetlesinler.</li>
</ol>5. hepatosit
<ol><li>2-5 MHz transducer kullanılarak ultrason ile portal ven tanımlayın. Bir 18 G, 5 inç iğne ana portal ven onun çatallanma proksimal doğru yönlendirin.</li>
	<li>Bir Ģırınga kullanarak 1 x 109 tetkikine (yaklaşık 10 g) kadar yavaş el ile infüzyonu başlar. Portal baskılar bir infüzyon kateter kullanarak nakli sırasında izlemek.<ol>
<li>Portal basınç temel yukarıda 8'den çok mmHg artırırsanız, infüzyon duraklatmak ve temel seviyelere dönmek baskı sağlar.</li>
		<li>Portal baskılar taban çizgisine duraklattıktan sonra döndürmezse infüzyon beş dakikalığına durdurma infüzyon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transplantasyon ve kateter kaldırma sonra ultrason trombotik olaylar varlığı için değerlendirmek ve portal ven akışını iletmek için kullanın.</li>
</ol>6. ameliyat sonrası kurtarma ve bakım
<ol><li>Tabi bir uygun kurtarma alana ve hayvan tamamen Ambulatuvar, her 15-30 dk. koru vücut sıcaklığı sıcak battaniye ile veya bir hava ısıtmalı şal gerektiği gibi kalp hızı, oksijen doygunluğu ve vücut sıcaklığını izlemek kadar izleyebilirsiniz.</li>
	<li>1 mg/kg omeprazol ağzından günlük (çalışma son) tarafından oluşabilir gastrik ülser inappetence nöbetleri ile azaltmak için yönetmek için.</li>
	<li>Postoperatively, hayvan laboratuarı ve hayvan hastalıklarıyla ilgili personel tarafından yakından izlenir ve genellikle ek ağrı kesici pre-operative buprenorfin doz ayrı gerektirmez.  Eğer sıkıntı/ağrı belirtileri nitelikli hayvan hastalıklarıyla ilgili kaygı personeli (kesi koruyan, inappetence, uyuşukluk) tarafından gözlenir, Anti-inflamatuar ajanlar (yani Carprofen) yönetilen.</li>
</ol>7. yemek tarifleri
<ol><li>Bu protokol için kullanılan yemek tarifleri için bkz. Tablo 1 .</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>HWM</td>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Ben (10 x)</td>
			<td>Başına II (10 x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Williams ın-E toz (g/L)</td>
			<td>10,8</td>
			<td>NaCl (g/L)</td>
			<td>83</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (g/L)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>KCl (g/L)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (g/L)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>HEPES (g/L)</td>
			<td>24</td>
			<td>240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep (100 x, mL/L)</td>
			<td>10</td>
			<td>EGTA (g/L)</td>
			<td>9.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fetal sığır Serum (mL/L)</td>
			<td>100</td>
			<td>N-Asetil-L-sistein</td>
			<td rowspan="2">8</td>
			<td rowspan="2">8</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH</td>
			<td>7.3</td>
			<td>(N-A-C, g/M)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Nitrogliserin (mL/L)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CaCl2 2 H2O (g/L)</td>
			<td>-</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>-</td>
			<td>0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7,6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Hepatosit karaciğer bölümleri izolasyonu kullanılan çözümler için yemek tarifleri.

<ol><li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening%3A+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li>
<li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li>
<li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism%3A+advancing+towards+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43(2017).</li>
<li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism%3A+progress+towards+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Italian+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2(2008).</li>
<li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li>
<li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors%3A+from+virology+to+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li>
<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+basic+to+translational%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li>
<li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li>
<li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li>
<li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663(2013).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu rapor bir domuz model HT-1'in tedavi bir ex vivo otolog gen terapisi yaklaşım açıklar. Ex vivo hepatosit yalıtım ve izole tetkikine iletim düzeltici transgene taşıyan lenti virüsle ardından kısmi bir hepatectomy içerir. Düzeltilmiş otolog tetkikine sonra geri FAH eksik hayvan ile portal ven8nakledilmektedir. Açıklanan yöntemi bazı değişiklik ile tüm büyük hayvan modelleri için geçerli olsa da, FAH eksikliği domuz için düzeltilmiş hücreleri13,...

Karaciğer metabolizmasının doğuştan hataları topluca 1 800 canlı Doğum1en çok etkileyen genetik hastalıkların bir aileyiz. Çoğu bu hastalıkların tek gen kusurları2 ve işlevsel olarak etkilenen gen tek bir düzeltilmiş kopyasını tetkikine3yeterli sayıda tanıtarak tedavi edilebilir. Düzeltilmesi gereken tetkikine gerçek yüzdesi hastalığı4 tarafından değişir ve büyük ölçüde bu kodlar, örneğin, atılan protein karşı sitoplazmik protein niteliğine bağlıdır. Çoğu durumda, herhangi bir tedavi etmek için metabolik etkinliğini kolayca aracılığıyla biyolojik dolaşımda bulunan çoğu kullanılabilir varlığı denetlesinler.
HT-1 sonuç fumarylacetoacetate hidrolaz (FAH)5bir üründe, Tirozin metabolizma6enzimatik son adımda karaciğer metabolizmasının doğuştan bir hatadır. FAH eksikliği için sürüme akut karaciğer yetmezliğine ve ölüme neden olabilir veya hastalık kronik şeklinde siroz ve hepatosellüler karsinom neden olabilir karaciğerde toksik metabolitleri, uzun ve zorludur. Hastalığın klinik olarak 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), küçük molekül inhibitörü olan bir enzim akıntıya karşı FAH, Tirozin metabolizması İdaresi tarafından yönetilir. Gibi başarılı tetkikine bile az sayıda düzeltilmesi hem küçük hem de büyük hayvan modellerinde düzeltilmiş hücrelerle sonunda tüm karaciğer repopulation içinde sonuçlanır hastalık hangi gen tedavi yöntemleri, test etmek ideal bir ortam sağlar 7 , 8. bu düzeltilmiş için hücreleri var toksik metabolitleri birikimi nedeniyle düzeltilemeyen hücreleri üzerinde derin hayatta kalma avantaj ikincisi oluşur. Düzeltilmemiş tetkikine kaybı düzeltilmiş tetkikine seçici genişleme için karaciğer yeniden üretim kapasitesi ile tutarlı sağlar. Tedavi kolayca nakli takip tirozin ve succinylacetone düzeyleri dolaşan içinde azalma ölçerek izlenebilir.
Kısmi bir hepatectomy içerir, yordam, invaziv doğası haklı göstermek için bu yaklaşım amacı dayanıklı bir tedavi olmalı. Bu nedenle, stabil hepatosit genom9içine entegre olacak çünkü çoğaltma beceriksiz lentiviral vektörler kullanılır. karaciğer olarak tüm kızı hücreleri için düzeltilmiş gen teslim sağlanması büyür ve düzeltilmeyen hücrelerinin hızlı kaybı değiştirmek için genişler. Bu sadece tek bir kızı hücre mitoz10 böylece herhangi bir etkisi birkaç hafta içinde tedavisinin kaybetme sırasında geçirilen episomes olarak öncelikle mevcut ilişkili adeno virüs (AAV) vektörler üzerinde avantajlıdır.
Edebiyat büyüyen bir vücut üzerinde lentivirus11, endişeleri Emanet desteklese genotoksik olaylar kontrollü vitro ortama konak hücreleri iletim sınırlayarak hafifletilmiş. Bu yöntem gerçekleştirildiğinde portal ven yoluyla otolog nakli ile yeniden kullanılmaya olacak tetkikine maruz sınırlayan ücretsiz vektör asla sistemik ana bilgisayara giriliyor.
Bu rapor cerrahi yöntemin ve gen terapisi ex vivo için tetkikine ve sonraki otolog transplantasyon12 HT-1 domuz8tedavisi için ayırmak için kullanılan ex vivo yordamlar açıklanmaktadır. Tam işlem tetkikine ve bir ana bilgisayarın karaciğer için büyüme uyarıcı bir kaynak, 2) ardından ex vivo gen düzeltme ve son olarak 3) reintroduction eksize karaciğer üzerinden tetkikine yalıtım olarak hizmet veren 1) bir kısmi hepatectomy içerir düzeltilmiş tetkikine ev sahibi geri. Açıklanan yöntemi bazı değişiklik ile tüm büyük hayvan modeller için geçerlidir ama sadece FAH eksikliği domuz13 seçici çevre düzeltilmiş tetkikine için avantaj olacaktır.

<table><tbody><tr><td>2-(2-nitro-4-triflorometilbenzoil)-1,3-sikloheksandion (NTBC)</td><td>Yecuris</td><td>20-0027</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Trokar</td><td>Covidien</td><td>B12STS</td><td></td></tr><tr><td>5 mm Trokar</td><td>Covidien</td><td>B5SHF</td><td></td></tr><tr><td>Endo Cerrahi Zımba 60</td><td>Covidien</td><td>EGIA60AMT</td><td></td></tr><tr><td>Endo Cerrahi Zımba 45</td><td>Covidien</td><td>EGIA45AVM</td><td></td></tr><tr><td>Endo Cerrahi Zımba 30</td><td>Covidien</td><td>SIG30AVM</td><td></td></tr><tr><td>Endo yakalama çantası</td><td>Covidien</td><td>173050G</td><td></td></tr><tr><td>0 PDS</td><td>Ethicon</td><td>Z340H</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J459H</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J426H</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond</td><td>Ethicon</td><td>DNX12</td><td>Steril Pansuman</td></tr><tr><td>Williams'-E Toz&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>ME16060P1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (g / L)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S1679-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl (g / L)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (g / L)</td> <td>Meşe Ağacı Kimyasal</td><td>45172</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil-L-sistein</td><td>Meşe Ağacı Kimyasal</td><td>3631</td><td></td></tr> <tr><td>(VAC, g / L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<alt>2</alt> 2H<alt>2</alt>O (g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D (mg/mL)</td><td>Hilal Kimyasalı</td><td>17456.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Fresenius Kabi</td><td>NDC6337</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü</td><td>Gibco</td><td>PHG0314</td><td></td></tr></tbody></table>

lentiviral vektör-aracılı gen terapisi tetkikine ex vivo domuz otolog nakli için

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Gen tedavisi karaciğer metabolizmasının birçok doğuştan hataları tedavisi için ideal bir seçimdir. Ex vivo, lentiviral vektörler kullanılmıştır başarıyla insanlarda, hematopoetik birçok hastalığın tedavisinde kullanımları vector öğesinin ana bilgisayar genom entegre yeteneği nedeniyle istikrarlı transgene ifade sunduğundan. Bu yöntem ex vivo gen terapisi tetkikine, uygulamaya büyük bir hayvan modeli kalıtsal tyrosinemia türü gösterir ben. Bu işlem 1) birincil tetkikine otolog donör/alıcı hayvandan 2 yalıtım oluşur) bir lentiviral vektör ve düzeltilmiş tetkikine yolu ile taşınabilir 3) otolog nakli ile hepatosit iletim yoluyla ex vivo gen teslim Enjeksiyon damar. Başarı yöntemi genellikle karaciğer rezeksiyonu, uygun tetkikine izole hücreler yeniden engrafting, yüksek yüzdesi iletim için yeterli yalıtım için çıkarılan numune taşıma dikkatli verimli ve steril kaldırılması üzerine dayanır ve Aseptik cerrahi işlemler boyunca enfeksiyonu önlemek için. Bu adımlardan herhangi birini teknik başarısızlık otolog nakli için uygun transduced tetkikine düşük verim veya donör/alıcı hayvan enfeksiyonu neden olur. Düzeltilmiş hücre engraftment bile küçük bir yüzdesi için karaciğer repopulation sağlıklı hücreler üzerinde güçlü bir temel sağlayacaktır gibi domuz insan tipi 1 kalıtsal tyrosinemia (HT-1) Bu yaklaşım için seçilen benzersiz olarak böyle bir yönteme mükellef modeldir yerli hastalıklı tetkikine seçici avantaj. Bu büyüme seçimi için tüm göstergeler gerçek olmayacak olsa da, bu yaklaşım diğer göstergeler doğru genişleme için bir temel ve ek hastalıklar, her ikisi de karaciğer içinde adres ve ötesinde, süre için bu ortamda manipülasyon için sağlar viral vektör ve hedef kapalı toksisite ve tumorigenicity için fırsat maruz için kontrol etmek.

Karaciğer rezeksiyonu ve otolog transplantasyon şematik resim 1' de temsil edilir. Hepatik rezeksiyon uygulanan 5 domuz temsilcisi bir kohort içinde çoğu verimi vardı &gt; hücreler bol sağlayan herhangi bir türü için 1 x 109 tetkikine yaklaşık % 80'i canlılık (Tablo 2), ile istenen manipülasyonlar, gene de dahil olmak üzere terapi. Her bu 5 domuz gösterdi iyi canlılığı ve yapışma, tipik hepatosit morfoloji iletim ve ilk kaplama (<s...

Bu iletişim kuralı modelleri otolog hücre transplantasyonu ile metabolik hastalıkların tedavisi için domuz hepatosit yalıtım ve ex vivo gen teslim açıklamak için tasarlanmıştır. Her ne kadar bu modelle başarılı terapi lehine benzersiz avantajlar sahiptir, uygulama ek hastalıklar ve göstergeler yönelik olarak ilgili bir temelidir.

Lentiviral vektör-aracılı gen terapisi tetkikine Ex Vivo domuz otolog nakli için

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Karaciğerde doğuştan gelen metabolizma hatalarının tedavisinde ek vivo gen tedavisi ve otolog hücre nakli bu hastalıkların tedavisine önemli bir alternatiftir. Ve bize sadece bu bozuklukları tedavi etmek için izin verir, ama biyokütle terapötik bir sonuç elde edebilmek için gerekli anlamaya. Bu yaklaşım aynı zamanda farklı tedavi türleri ile immünsupresyon ve diğer sonuçları önemli sonuçları önler.Mevcut bağlamda, kalıtsal tyrosinemia tip 1 tedavisinde bu yaklaşımı kullanıyoruz. Ancak, fikir bu minimal değişiklik ile farklı karaciğer hastalıklarının çok sayıda tedavi etmek için bir platform yaklaşım olacaktır. Bu tekniği görselleştirebilmek önemlidir, çünkü perfüzyonun verimliliğini görselleştirmek söz konusu olduğunda bazı değişkenlikler vardır, ki bu da transplantasyon için uygun hepatosit elde etmek için gereklidir.Robert Kaiser ve Joseph Lillegard tarafından yapılan cerrahi işlem. Zeji Du, Bruce Amiot tarafından gerçekleştirilen hücre izolasyonu. UAU hücre arınması ve hücrelerin ex vivo transdüksiyonu Caitlin VanLith tarafından yapıldı.Hayvanların hazırlanması ve ameliyatla hazırlık Kari Allen ve Laurie Hillin tarafından yapıldı. İlk liman sitesi girişini gerçekleştirmek için,

lentiviral-vector-mediated-gene-therapy-hepatocytes-ex-vivo-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Onkolitik viroterapiler, hepatosellüler karsinom (HCC) tedavisinde yeni terapötikler olarak geliştirilme aşamasındadır.  Burada, onkolitik virüsün hepatik arteriyel uygulaması yoluyla HCC'nin lokorejyonel tedavisi için bir yöntem tanımlanmıştır.

Sıçanlarda Ortotopik HCC Lokorejyonel Tedavisi için oncolytic virüs transarteryel İdaresi

Decellularized bir sıçan karaciğerinin hücreselleştirilmiş hücre dışı matrisi, bir virüsün veya viral vektörün dağılımını ve transgen ekspresyonunu incelemek için insanlaştırılmış, üç boyutlu bir ex vivo model olarak kullanılabilir.

Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon dayalı Tümleştirme vektörlerin sağlar fare tetkikine istikrarlı transfection içinde vivo. Burada, tek bir transgene uzun vadeli kurucu ifade veya kombine kurucu ve Doksisiklin indüklenebilir ifade bir transgene veya miR-shRNA karaciğerde sağlayan pratik bir protokol transfection sistemler mevcut.

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

Biz bir rahim içinde nakli (IUT) intravenöz ve içi amniyotik yolları enjeksiyon fare modeli gerçekleştirmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı hücreleri, viral vektörel çizimler ve diğer maddelerin benzersiz bağışıklık dayanıklı fetal ortama tanıtmak için kullanılabilir.

İntravenöz ve içi amniyotik rahim içinde nakli fare modeli

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Domuz heterotopik kalp nakli modelinde terapötiklerin tüm kardiyak allogreftlere verilmesi için normotermik ex vivo sanguinöz perfüzyon sisteminin kullanılması için bir protokol sunuyoruz.

Terapötiklerin Kardiyak Allogrefte Verilmesi için Domuz Heterotopik Kalp Transplantasyonu Protokolü

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Bu protokolde, engraftman sırasında veno-venöz bypass kullanılmadan donör organların 20 saat boyunca statik soğuk depolanmasından sonra domuz ortopik karaciğer transplantasyonu modeli tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, anhepatik fazın en aza indirilmesi ve sofistike hacim ve vazopresör yönetimi ile basitleştirilmiş bir cerrahi teknik kullanmaktadır.

Veno-Venöz Bypass Olmadan Domuz Karaciğeri Transplantasyonu Genişletilmiş Kriterli Donör Modeli Olarak

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Bu protokol, AAV8 ile verilen küçük firkete RNA'sının intrasplenik enjeksiyonunun, karaciğerde portal ven enjeksiyonu ile aynı gen yıkım etkinliğini nasıl sağladığını açıklar ve çok daha düşük perioperatif ve postoperatif mortalite ve komplikasyonlar ile daha basit bir prosedürü temsil eder.

Adeno-ilişkili virüs serotip 8 (AAV8) ile verilen küçük firkete RNA'sının intrasplenik enjeksiyonu yoluyla karaciğerde etkili gen yıkımı

Keşfedin eks vivo gen tedavisi ve otolog hücre nakli yöntemini, domuz karaciğerinde kalıtsal tirozinemi tip 1 tedavisi için. Bu teknik metabolik hastalıklar için umut vadeden bir platform sunar.

Lentiviral vektör-aracılı gen terapisi tetkikine Ex Vivo domuz otolog nakli için

Daha fazla video keşfet