Name: Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Öğrenin yetişkin omurilik çekirdeği yalıtımını kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için. Bu yöntem, donmuş veya taze dokulardan yüksek kaliteli çekirdek izolasyonu sağlar ve tek hücreli transkripsiyon profillerini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NINDS Intramural programı tarafından desteklenmiştir (1 ZIA NS003153 02) ve NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Biz L. Li ve onların teknik destek ve yararlı tartışmalar için CI Dobrott ve C. Kathe el yazması gözden geçirme için teşekkür ederim.

Sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol uyarınca gerçekleştirilmiş tüm hayvan işleri. Erkek ve dişi ICR/CD-1 yaban-farelerde tip, 8 arasında örnekleri dengeli ve 12 hafta yaşlı, tüm deneyler için kullanılmıştır. Fareler yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi kılavuzlarınıza uygun olarak ele alınmalıdır.
1. malzeme ve arabellekleri hazırlanması
<ol><li>Tüm arabellekleri kullanımı gün hazırlamak ve önceden buza chill (bkz. Tablo 1).<ol>
<li>Deterjan-mekanik lizis kullanıyorsanız, deterjan lizis arabellek (> 500 μL örnek başına), düşük sükroz arabellek (> 6 mL örnek başına), sukroz yoğunluğu arabellek (> 12,5 mL örnek başına) ve resuspension çözüm (> 1 mL) hazırlayın.</li>
		<li>Hipotonik-mekanik lizis kullanıyorsanız, hazırlamak hipotonik lizis tampon (> 5 mL örnek başına), HEB Orta (> 5 mL örnek başına), düşük sükroz arabellek (> 3 mL örnek başına), sukroz yoğunluğu arabellek (> örnek başına 12.5 mL) ve resuspension çözüm (> 1 mL).</li>
		<li>Dithiothreitol (DTT) 25 μL düşük sükroz arabelleği 25 mL ve DTT başka bir 25 μL 25 mL sukroz yoğunluk gradient arabelleği için protokol başlatmadan önce ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek kağıt havlu veya tek hücre çekirdeği yakalamak için kullanılan mikrosıvısal kanalları tıkayabilir tezgah koruyucular lifleri ile kirlenme en aza indirmek için alüminyum folyo ile parçalanmış yüzeyi kapsamaktadır.</li>
	<li>Parçalanmış araçlar ve tezgah alanı RNase dekontaminasyon çözümünü ile sprey. Ayrıca, (deterjan-mekanik hücre lizis kullanıyorsanız) Dounce homogenizer tüp ve Oak Ridge tüp içine RNase dekontaminasyon çözümünü ile sprey. Dounce ve Oak Ridge tüp ultrasaf, RNase free su ile durulayın.</li>
	<li>Önceden tüm koleksiyon tüpler (50 mL konik, Oak Ridge) ve buz üzerine Dounce homogenizer boruları, sakin ol.</li>
	<li>Yangın Lehçe Pasteur pipetler bir dizi (hipotonik-mekanik hücre lizis kullanıyorsanız).</li>
</ol>2. omurilik hazırlanması
<ol><li>Taze doku kullanıyorsanız, fare CO2 inhalasyon tarafından ötenazi. Ötenazi, sprey fare kat saç kirlenme örnek en aza indirmek için % 70 etanol ile.</li>
	<li>Fare ile keskin, RNase free cerrahi makas başını kesmek. Sonra yavaşça karın kaldırma forseps ile deri ve iç organlar ortaya çıkarmak için vücut uzunluğu boyunca bir kesi yapmak.</li>
	<li>Fare forseps kullanarak vücut boşluğu üzerinden iç organları çekerek içini. Alanı temizlemek için veya bu kirletici tanıştırabilir miyim gibi organları kaldırmak için kağıt havlu kullanmayın. Makas kullanılarak, vertebral sütunun L2 ve L3 omurilik omurga arasında kesme. Not: uygulama ile bu adımı 30 saniyeden az bir sürede elde edilebilir.<ol>
<li>Spinal kord dışarı atmak için 25 G ¼ inch iğne ile buz gibi PBS içeren bir 3 mL şırınga uygun. İğne ucu sakral vertebral sütunun sonuna yerleştirin. İğne ucu etrafında sıkı bir mühür oluşturmak ve aşağı pistonu üzerinde spinal kord rostrally çıkarmak için basın için omurga çimdik için iki parmağınızı kullanın. Spinal kord buz gibi PBS ile petri kabına yerleştirin.</li>
		<li>Bu noktada, doku dondurma ve-80 ° C'de depolayın veya hemen deterjan-mekanik (adım 3) veya hipotonik-mekanik (adım 4) lizis için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Donmuş doku, kullanarak korumak, doku Kuru buz üzerinde deterjan-mekanik (adım 3) veya hipotonik-mekanik (adım 4) lizis için devam edin.</li>
</ol>3. deterjan-mekanik hücre lizis
<ol><li>Lomber spinal kord bir önceden soğutulmuş Dounce homogenizer yerleştirin ve 500 mL deterjan lizis arabellek önceden soğutulmuş ekleyin. Not: Bir fare lomber spinal kord 325.5 mg ± 63.9 mg standart değerlerin ortalamasının hatadır (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g doku başarıyla kullanılabilir.</li>
	<li>Havan tokmağı ('gevşek' havaneli) 5 vuruş sonra 5-10 vuruş havaneli B ('sıkı' havaneli) ile Dounce. Homogenizer lizis çözüm vuruşları arasında dışarı kaldırma önlemek ve kabarcıklar tanıtan kaçının.</li>
	<li>Bir 40 mm süzgeç önceden soğutulmuş 50 mL konik tüp ve prewet ile 1 mL düşük sükroz arabelleği yerleştirin.</li>
	<li>Ham çekirdeklerin lizis arabellek içeren Dounce homogenizer için düşük sükroz arabellek 1 mL ekleyin ve karışımı yavaşça 2-3 kez pipetting.</li>
	<li>Ham çekirdeği hazırlık 40 mm süzgeç üzerinde önceden soğutulmuş 50 mL konik tüp içine geçmek.</li>
	<li>Bir ek 1 mL düşük sükroz arabellek son hacim 3 mL düşük sükroz arabellek ve 500 mL lizis arabelleği getiren 40 mm süzgeç üzerinden geçmek.</li>
	<li>Birden çok kordonlar, aynı konik tüp havuzu birleştirme adımları 3.1 – 3,6 yineleyin.</li>
	<li>3200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnek santrifüj kapasitesi Santrifüjü tamamlandıktan sonra süpernatant dikkatle boşaltmak. Adım 5'e geçin.</li>
</ol>4. hipotonik-mekanik hücre lizis
<ol><li>Lomber spinal kord 5 mL de bir doku kültürü yemek hipotonik lizis arabellekte yerleştirin. Bahar makas künt sonu omurilik bisect, sonra 3-4 mm parçalar halinde göbek bağını kes için bahar makas kullanın kullanın, ancak değil kıyma. Not: 50 mg-1.5 g doku başarıyla kullanılabilir.</li>
	<li>2-3 kez dönen 15dk için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Hipotonik lizis arabellek sulandırmak için HEB orta 5 mL ekleyin.</li>
	<li>5 mL serolojik pipet ile 10 kat veya tüm doku adet pipet açıklıktan ahenkli kadar doku triturate.</li>
	<li>Triturate bir dizi üç yangın cilalı Pasteur pipetler giderek daha dar fan çapı (~ 900-600 mm).<ol>
<li>Her pipet triturate 5 - 15 kat, doku yerleşmek, 1-2 mL Disosiye çekirdek içeren süpernatant kaldırmak ve bir 40 mm süzgeç üzerinde önceden soğutulmuş 50 mL konik tüp içine geçmek izin.</li>
		<li>En küçük ölçekli Pasteur pipet ile toz sonra emin olun homogenate sorunsuz pipet ucu akar. Kalan çözüm üzerinde 40 mm süzgeç 50 mL konik tüp içine geçmek. Not: Triturations toplam sayısı ayarlanabilir istediğiniz gibi. Fare spinal kord meninkslerde kalır, ancak spinal kord görünür herhangi bir boyutta triturate önemlidir. Kalan homogenate 40 m süzgeç geçmek. Kabarcıklar sırasında toz tanıtan kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtre uygulanmış örneği ' 1000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Santrifüjü tamamlandıktan sonra dikkatle boşaltmak ve süpernatant atın. Adım 5'e geçin.</li>
</ol>5. homojenizasyon ve sukroz yoğunluk Gradient
<ol><li>Adım 3 veya 4 sonra 3 mL düşük sükroz arabellek kullanarak Pelet resuspend. Yavaşça resuspension kolaylaştırmak için duvardan Pelet kaldırmak için girdap. Buz 2 min için oturmak ve süspansiyon bir Oak Ridge tüp transfer örnek ver.</li>
	<li>Homogenizer, kullanarak 1 olarak ayarlayarak, homojenize çekirdekleri düşük sükroz arabelleği 15 – 30 s, örnek buz üzerinde tutmak için. Not: Eğer bir lomber spinal kord veya 30 kullanarak kullanım 15 s kullanıyorsanız s havuza alınmış örnekleri ya da bütün bir omurilik.</li>
	<li>Serolojik pipet, katman yoğunluğu sükroz arabelleği yoğunluğu katmanları bozan bir kabarcık yaratmak değil dikkat çekici düşük sükroz arabellek homogenate altında 12,5 mL kullanarak.</li>
	<li>3200 x g 4 ° C'de 20 dk için de tüpler santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Santrifüjü tamamlandıktan sonra hemen süpernatant flicking bir hareketle dikkatle boşaltmak. Not: Sükroz arabellek kalan hacmi (daha az 400 mL) düşük ses ve son örnek temiz üretmek için isterseniz atılır, ama artık bu birimi çekirdek içerir ve çekirdekleri verimi en üst düzeye çıkarmak için korunmuş.</li>
	<li>100 mL - 1 mL resuspension çözeltisi kullanarak, duvardaki kalan çekirdeği resuspend. 'Deterjan tabanlı hazırlıkla kalır miyelin kaşlarını' kaçının.</li>
	<li>Çekirdeklerin 30-35 mm gözenek boyutu süzgeç aracılığıyla filtre ve önceden soğutulmuş bir tüp içinde toplamak.</li>
	<li>Çekirdek çekirdek 10 X amaç altında saymak için bir hemasitometre kullanma verim belirlemek. Not: Trypan mavi mavi görünmesi gereken çekirdek görselleştirmek için eklenebilir. Hücresel enkaz miktarını Not.</li>
	<li>Adım 6 veya 7 için devam edin.</li>
</ol>6. ağır snRNA-sıralama paralel: Akademik Platform7
<ol><li>Kitlesel paralel snRNA sıralama (Örneğin, damla-Seq) gerçekleştirin yöntemi daha önce açıklandığı gibi7 aşağıdaki değişiklikler ile:4<ol>
<li>Çekirdeklerin mL başına 225 çekirdeği son bir konsantrasyon için ayarlayın.</li>
		<li>Barkodlu boncuk mL başına 250 boncuk bir konsantrasyon, hazır olun.</li>
		<li>% 0.7 sarkosyl lizis önbellekle hazırlayın.</li>
		<li>Akış oranları min boncuk, min için çekirdek başına 35 mL ve petrol için min başına 200 mL başına 35 mL için ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. kitlesel paralel snRNA-sıralama: ticari Platform26
<ol><li>Kitlesel paralel snRNA-sıralama (Örneğin, krom tek hücre gen ifade çözümü) ticari platformu kullanarak gerçekleştirmek aşağıdaki değişiklik ile üreticinin yönergeleri26 uygun ürünler:<ol>
<li>Ters-transkripsiyon ek PCR çevriminin hücrelere kıyasla çekirdekleri dan azalmış cDNA telafi etmek için hedeflenen hücre kurtarma temel cDNA amplifikasyon devredir hesaplanan sayısını ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967(2016).</li>
<li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells%2C+monocytes%2C+and+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022(2016).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/110/49/19802.short">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. <a target="_blank" href="https://www.salk.edu/wp-content/uploads/2017/11/10XUserGuide.pdf">Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide</a>. , (2018).</li>
<li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/12/25/239749">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
</ol>

Hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu iletişim kuralı, nihai hedefi aşağı akım transkripsiyon analiz için yüksek kaliteli RNA içeren çekirdeklerin izole etmektir. SnRNA-Seq yöntemleri tüm hücre tiplerinin spinal kord profil için uyarlanmış. Başlangıçta, biz omurilik sinir hücreleri hücre ölümü için özellikle savunmasız olduğu gibi tipik hücre ayrılma yöntemleri tek hücre RNA sıralama için etkisiz bulundu. Ayrıca, hücre ayrılma yöntemleri hundred-fold kadar birçok çeşitli etkinlik ve stres tepkisi genler tarafından ifade ikna etmek. 3</su...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 &#956;L pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 &#956;L of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 &#956;L) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 &#956;L - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were&#160;updated from:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.</li>
</ol>
to:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per &#956;L.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per &#956;L.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 &#956;L per min for beads, 35 &#956;L per min for nuclei, and 200 &#956;L per min for oil.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Sinir sistemi hànzú morfolojik, biyokimyasal ve elektrofizyolojik özellikleri çeşitli bir dizi görüntüleyen hücreler kümesinden oluşur. Süre toplu RNA sıralama gen ekspresyonu farklı koşullar altında doku genelindeki değişiklikleri belirlemek için yararlı olmuştur, transkripsiyon değişiklikleri tek hücre düzeyinde algılanması engellemektedir. Tek hücreli transkripsiyon analiz son gelişmeler hànzú hücreleri sınıflandırması moleküler kendi repertuar göre fonksiyonel gruplara etkinleştirdiyseniz ve hatta son zamanlarda aktif nöron kümeleri bulmak için kullanılacak olabilir. 1 , 2 , 3 , 4 son on yıl içinde gen ifadesinde bir görünüme hücre tipi çeşitlilik sağlayan tek tek hücreler, çalışma tek hücre RNA (scRNA-Seq) sıralama gelişimini sağlamıştır. 5
Gibi kitlesel paralel scRNA-Seq, ölçeklenebilir yaklaşımlar ortaya çıkması sıra heterojen dokulara, merkezi sinir sistemine sahip pek çok bölge de dahil olmak üzere platformlar sağlamıştır. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ancak, tek hücre ayrılma yöntemleri gen ifadesinde deneysel değişikliklerin yanı sıra hücre ölümüne yol açabilir. 16 tek hücre sıralama yöntemleri endojen transkripsiyon profilleri korunması etkinleştirmek için son çalışmasını benimsemiştir. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 bu stratejileri hemen erken gen (IEG) ifade duyusal uyarıcı veya davranış aşağıdaki algılamak için özellikle uygun olmuştur. 3 , 4 gelecekte, bu strateji de dokularda hastalık durumlarında veya strese yanıt dinamik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Bu yöntemleri, tek çekirdek RNA sıralama (snRNA-Seq) hücre ayrılma stres-inducing içermeyen ve zor doku (örneğin, spinal kord) ayırmak için yanı sıra dondurulmuş kullanılabilir bir umut verici yaklaşımdır doku. 4 , 17 , 18 , 19 uyarlama önceki çekirdek izolasyon yöntemleri,20,21,22,23,25 snRNA-Seq genellikle hızlı doku bozulması ve hücre kullanır lizis soğuk koşulları, Santrifüjü ve ayrılık çekirdeği, hücresel enkaz altında. 4 çekirdek çoklu mikrosıvısal damlacık kapsülleme platformlarda aşağı akım nesil sıralama için ayrılmış olabilir. 4 , 7 , 24 , 25 bu yöntem bir anda zaman içinde binlerce hücre transkripsiyon etkinliği bir anlık görüntü için izin verir.
Çekirdeklerin hücrelerden yalıtım ve sıralama, her biri kendi avantajları ve dezavantajları önce serbest bırakmak için birden çok strateji vardır. Burada, biz tanımlamak ve aşağı akım kitlesel paralel snRNA Seq için yetişkin omurilik üzerinden çekirdek yalıtım etkinleştirmek için iki protokol karşılaştırın: deterjan-mekanik lizis ve mekanik hipotonik lizis. Deterjan-mekanik lizis tam doku bozulması ve çekirdekleri daha yüksek bir son verim sağlar. Hipotonik mekanik-lysis doku bozulması, miktar ve saflık son nükleer verim arasında bir denge seçmek için bir fırsat sağlayan kontrol edilebilir bir ölçüde içerir. Bu yaklaşımlar karşılaştırılabilir RNA verim, çekirdek ve hücre tipi profil başına genlerin algılanan numaraları sağlar ve aynı zamanda her ikisi de başarılı bir şekilde snRNA-devamı için kullanılabilir

<table><tbody><tr><td>Sükroz</td><td>Invitrogen</td><td>15503-022</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgAc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td> Triton-X Sigma Aldrich T8787'yi <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> kullanmadan hemen önce DTT ekleyin <tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Crystalgen</td><td>221-238-10</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Hazırda Bekletme-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Kristalgen</td><td>221-133-10</td><td></td></tr><tr><td>%0,04 BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>0,2 U/ &mu; L RNAse İnhibitörü</td><td>Lucigen</td><td>30281-1</td><td></td></tr><tr><td>Meşe Sırtı Santrifüj Tüpü</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Pamuk Tıkalı Borosilikat-Cam Pastör Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>Cam Doku Dounce (2 mL)</td><td>Kimble</td><td>885303-002</td><td></td></tr><tr><td>Cam büyük açıklıklı havaneli</td><td>Kimble</td><td>885301-0002</td><td></td></tr><tr><td>Cam küçük boşluklu havaneli</td><td>Kimble</td><td>885302-002</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Temel Ultra Turrax Homojenizatör</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td></td></tr><tr><td>Dispersiyon aracı (S 10 N &ndash; 5G)</td><td>IKA</td><td>3304000</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke (%0,4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m hücreli süzgeç</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers, 30 &mu; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Konik borular</td><td>Denville Scientific</td><td>1000799</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F15-6 x 100y Sabit Açılı Rotor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Sterolojik Pipetler: 5 mL, 10 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>Chemgenes Barkodlama Boncukları</td><td>Chemgenes</td><td>Macosko-2011-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dekontaminasyon Solüsyonu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeç Kapaklı Falcon Test Tüpü (35 &mu; m)</td> <td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios Hücre Sıralayıcı</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Krom i7 Multipleks Kiti, 96 rxns</td><td>10X Genomik</td><td>120262</td><td></td></tr><tr><td>Krom Tek Hücre 3 ' Kütüphane ve Jel Boncuk Kiti v2, 4 rxns</td><td>10X Genomik</td><td>120267</td><td></td></tr><tr><td>Krom Tek Hücreli A Çip Kiti, 16 rxns</td><td>10X Genomik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı (60 mm x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek rna sıralama için

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Tek bir hücre'nın gen ekspresyonu sondalama hücre tipi ve hücre devlet sağlar. Tek hücreli RNA sıralama transkripsiyon profilleri hücrelerinin, merkezi sinir sistemi gibi heterojen dokuları özellikle eğitim için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, tek hücre sıralama için gereken ayrılma yöntemleri gen ifade ve hücre ölümünde deneysel değişikliklere yol açabilir. Ayrıca, bu yöntemler genellikle böylece arşivleme üzerine çalışmalar ve biyo-banka malzeme sınırlama taze doku için kısıtlanır. Tek çekirdek RNA sıralama (snRNA-Seq) transkripsiyon çalışmaları, verilen bu doğru hücre tipleri tanımlar, donmuş ya da ayırmak zor doku çalışma ruhsatı için çekici bir alternatifi ve ayrılma kaynaklı azaltır Transkripsiyon. Burada, yüksek üretilen iş iletişim kuralı çekirdeği aşağı akım snRNA-devamı için hızlı yalıtım için mevcut Bu yöntem çekirdeği taze veya dondurulmuş omurilik örneklerinden yalıtım sağlar ve iki kitlesel paralel damlacık kapsülleme platformları ile kombine edilebilir.

Burada, çekirdeği olan yetişkin fare lomber spinal kord aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için üzerinden gerçekleştirilen. Protokol üç ana bileşenini dahil: doku bozulması ve hücresel lizis, homojenizasyon ve sukroz yoğunluğu Santrifüjü (Şekil 1). Saniye içinde çok sayıda çekirdeği hem de hücresel ve doku artıkları (Şekil 2ATablo 2) ham çekirdeği hazırlıkla deterjan-mekanik lizis vermiştir. On beş dakika s...

Burada, hızlı bir şekilde yüksek kaliteli çekirdekleri aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için taze veya dondurulmuş dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İkisi de çekirdek yalıtımı için kullanılan deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik doku bozulma ve hücre lizis seçenekleri, içerir.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Tek hücreli RNA dizilimi, özellikle merkezi sinir sistemi gibi heterojen dokularda hücrelerin transkripsiyonel profillerini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokol, tek çekirdekli RNA dizilimi için çekirdekleri yalıtmak için bir yöntem sağlar. Hücreler yerine çekirdekler kullanılarak, bu yöntem zor ayrıştırılan dokulara ve donmuş dokulara uygulanabilir.Ayrıca, bu yöntem hastalık veya yaralanma sonrası hücrelerde hücre tipine özgü değişiklikleri incelemek için uygulanabilir. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi fare ötenazisi ile başlayın. Sonra, iç organları ortaya çıkarmak için vücudun uzunluğu boyunca bir kesi yapmak.İç organları vücut boşluğundan forceps kullanarak çekerek fareyi boşaltın. Bu kirletici maddelere neden olabilir gibi, bölgeyi temizlemek veya organları kaldırmak için kağıt havlu kullanmayın. Makas kullanarak, L2 ve L3 spinal vertebra arasındaki vertebral kolon kesti.Omurilik çıkarmak için, bir 25 gauge 1 / 4 inç iğne ile buz gibi PBS içeren üç mililitrelik şırınga uygun. İğneucunu vertebral sütunun sakral ucuna yerleştirin. İğneucu etrafında sıkı bir mühür oluşturmak için omurları çimdik iki parmak kullanın ve omurilik rostrally çıkarmak için piston aşağı basın.Buz gibi PBS ile bir Petri kabına omurilik yerleştirin. Kordonun lomber kısmı gerekiyorsa, omuriliğin sakral ve torasik kısımlarını kesin. Bu noktada, eksi 80 santigrat derece doku dondurun veya metin protokolünde açıklandığı gibi deterjan mekanik hücre lisis veya hipotonik mekanik lysis için hemen kullanın.Deterjan mekanik hücre lizis belirlemek için, önceden soğutulmuş Dounce homogenizer bel omurilik yerleştirin ve önceden soğutulmuş deterjan lizis tampon 500 mikrolitre ekleyin. Gevşek havaneli beş vuruş ile dounce, A, ve sonra sıkı havaneli beş ila 10 vuruş, B.Vuruş arasında lizis çözeltisi dışında homogenizer kaldırma kaçının, ve kabarcıklar tanıtmakkaçının. Şimdi, önceden soğutulmuş 50 mililitrekonik tüp ve önceden ıslak bir mililitre düşük sakaroz tampon ile 40 mikron süzgeç yerleştirin.Lysis tamponundaki ham çekirdekleri içeren Dounce homogenizer'e bir mililitre düşük sakaroz tamponu ekleyin ve 2-3 kez borulandırarak hafifçe karıştırın. Ham çekirdekleri 40 mikronluk süzgeç üzerinden önceden soğutulmuş 50 mililitrelik konik tüpe geçirin. 40 mikronsüz süzgeç üzerinde ek bir mililitre düşük sakaroz tampon geçirin, düşük sakaroz tampon üç mililitre ve lysis tampon 500 mikrolitre son hacmi getirerek.Aynı konik tüpte soğutma, birden fazla kablo birleştirerek bu adımları tekrarlayın. Daha sonra, numuneyi 3200 kez G'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Santrifüj tamamlandıktan sonra, supernatant decant.Paleti üç mililitre düşük sakaroz tamponu kullanarak askıya alıyoruz. Yavaşça geri süspansiyon kolaylaştırmak için duvardan pelet kaldırmak için girdap. Numunenin iki dakika buzda olmasına izin verdikten sonra süspansiyonu Oak Ridge tüpüne aktarın.Birinci ayarda homogenizer kullanarak, düşük sakaroz tampon çekirdekleri homojenize 15-30 saniye, buz üzerinde örnek tutmak. Daha sonra, düşük sakaroz tampon homojenate altında, yoğunluk sakaroz tampon 12,5 mililitre katman için serolojik pipet kullanın, yoğunluk katmanları bozan bir kabarcık oluşturmak için değil dikkat. Tüpleri 3200 kez G'de, 20 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Santrifüj tamamlandıktan sonra, hemen bir hareket supernatant decant. Bu prosedürü çalışırken, hemen santrifüj gelen Oak Ridge tüp kaldırmak için hatırlamak önemlidir, ve hızlı bir şekilde supernatant decant. 100 mikrolitre ile bir mililitre resuspension çözeltisi kullanarak duvarda kalan çekirdekleri askıya alıyoruz.Deterjan bazlı hazırlık ile kalır miyelin kaşlarını kaçının. Bu adımların hızlı bir şekilde yapılmaması, aşırı hücresel enkaz veya miyelin ile çekirdek hazırlığına neden olabilir, bu da tek çekirdekli RNA diziliminin aşağı yayılışını engelleyebilir. Çekirdekleri 30 ila 35 mikron gözenek boyutunda bir süzgeçten süzün ve önceden soğutulmuş bir tüpte toplayın.Metin protokolünde açıklandığı gibi tek çekirdekli RNA sıralamasına geçmeden önce çekirdek verimini 10 x hedefi altında saymak için bir hemositometre kullanarak çekirdek verimini belirleyin. Deterjan mekanik lysis protokolü kullanılarak izole edilen çekirdeklerin parlak alan ve epifloresan görüntüleri 10 x olarak gösterilmiştir. Bu çekirdekler tarafsız bir şekilde izole edilerek, tek bir hücre düzeyinde endojen gen ekspresyonu profillerinin incelenmesine olanak sağlar.Burada gösterilen, tek çekirdekli RNA sıralama temsili bir tSNE arsa, bir fare lomber omurilik, bir kitlesel paralel damlacık kapsülleme platformu kullanarak. Taze veya dondurulmuş dokudan izole edilmiş çekirdekler hem ticari hem de akademik platformlarda dizileme için kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların transkripsiyonel profilleri tek hücre düzeyinde keşfetmelerini sağlar, omurilik gibi ayrıştırılaması zor dokuları, hatta biyobank materyali gibi dondurulmuş dokuları kullanırlar.Bu prosedürü çalışırken, ötanazi ve hücresel lisis arasındaki süreyi azaltmak önemlidir. Ayrıca, hücresel lysis resuspension için çözümler içine tanıtılan kabarcıklar en aza indirmek için önemlidir, ve özenle evcil hayvan çekirdekleri satın almak için. Bu yordamı takiben, çekirdekler belirli hücre türlerini izole etmek için facs sıralama gibi alternatif uygulamalar için kullanılabilir.

isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Tümör içi heterojenlik gliomalar da dahil olmak üzere tümörlerin doğal bir özelliğidir. Tek çekirdek RNA ve ATAC dizileme çalışmaları için tek çekirdekleri taze donmuş glioma dokularından izole etmek için tamponlar ve gradyan santrifüjleme kombinasyonunu kullanan basit ve verimli bir protokol geliştirdik.

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

Burada, medüller böbrek hücresi tiplerinin temsilini geliştiren ve enzimatik doku ayrışmasından kaynaklanan gen ekspresyon artefaktlarını önleyen donmuş fare böbreklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

Bu protokol, fare üstün servikal ve yıldız gangliyonunun diseksiyonu, hücre ayrışması, kriyoprezervasyon, çekirdek izolasyonu ve hashtag barkodlaması dahil olmak üzere tek çekirdekli dizileme için ayrıntılı, düşük girişli numune hazırlığını açıklar.

Düşük Girişli Çekirdek İzolasyonu ve Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Fare Sempatik Ganglia'nın Barkodlu Antikorları ile Çoklama

Burada, tek çekirdekli RNA-seq, ATAC-seq ve eklem multiomikleri (RNA-seq ve ATAC-seq) için flaş dondurulmuş, arşivlenmiş karaciğer dokularından çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Hücreli Multiomikler için Flaş Dondurulmuş Karaciğer Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

İntermüsküler yağ dokusunun (IMAT) biyolojisi, insan dokusunun sınırlı erişilebilirliği nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Burada, bu benzersiz yağ deposunun hücresel bileşimini tanımlamak için tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş insan IMAT'ının çekirdek izolasyonu ve kütüphane hazırlığı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan İntermüsküler Yağ Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu ve Aşağı Akış Tek Çekirdekli RNA Dizilemesi

Öğrenin yetişkin omurilik çekirdeği yalıtımını kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için. Bu yöntem, donmuş veya taze dokulardan yüksek kaliteli çekirdek izolasyonu sağlar ve tek hücreli transkripsiyon profillerini incelemeye olanak tanır.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Daha fazla video keşfet