Name: Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin, reseptör-enzim etkileşimlerini ve aktivasyonunu paralel olarak değerlendirmek için co-immunoprecipitation ve enzimatik aktivite testi yöntemini. Bu teknik, hücre sinyalizasyonu alanında protein alanlarının işlevsel rollerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje NIH hibe 1R01AI125640-01 ve Romatoloji Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi.

1. transfection hücre
<ol><li>HEK 293T hücre içine on iki 10 cm tabak (tabak başına 5 x 106 hücre) transfection (Şekil 1) önceki gün tohum. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. Her plaka için 10 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanın. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Hücrelerin % 80-90 birleşmesi olduğunda, aşağıdaki Plasmid'ler ile lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak 5 HEK 293T plakaları transfect: SHP2 ifade vektör, PD-1-GFP-ifade vektör [PD-1'in vahşi türü (WT) sürüm], ITIM mutasyona uğramış bir sürüm (Y223F ) PD-1-GFP-ifade vektör ve bir ITSM mutasyona uğramış sürümü (Y248F) bir PD-1-GFP-ifade vektör (Şekil 1). Not: İki tabak ile WT PD-1-GFP-ifade vektör transfected. Bir ek plaka bir sigara transfected hücreleri denetimi (Şekil 1) hizmet edecektir.</li>
	<li>Transfection üreticinin iletişim kuralı göre 10 cm tabak yapışık hücreleri için gerçekleştirin. Not: PD-1 mutasyona uğramış sürümlerinde, her motif olarak (Y) Tirozin tarafından Fenilalanin (F) bu fosforile olamaz değiştirildi.</li>
	<li>İkinci aynı birtakım beş tabak ve ifade edilen protein miktarı [giriş; olarak da bilinen bütün hücre lysate (WCL)] immunoprecipitation (Şekil 1) önce ölçümü için transfected sigara denetimi olarak hizmet veren bir ek plaka transfect.</li>
	<li>Transfected hücreler 37 ° C'de 48 h, % 5 CO2 bir doku kültürü kuluçka için kuluçkaya. Not: Bu transfection başarılı bir şekilde oluştu emin olmak için hücreleri floresan mikroskop kullanarak GFP ifade için inceleyin.</li>
</ol>2. teşvik Transfected hücrelerdeki fosforilasyon
<ol><li>Kuluçka, taze pervanadate %30 H2O250 µL ile sodyum-orthovanadate (100 mM stoktan) 50 µL karıştırılarak hazır olun. Not: Karışım sarımsı bir renk olarak değiştirmeniz gerekir. Pervanadate fosforilasyon Tirozin kalıntıları13teşvik bir hücre geçirgen fosfataz inhibitörü olduğunu. Bu tahlil, bu sağlam PD-1 kuyruk fosforilasyon ikna etmek için kullanılır.</li>
	<li>PD-1 etiketlenmiş sürümlerini fazdan için medya PD-1-GFP-transfected hücrelerden kaldırın ve (olmadan serum veya antibiyotik) düz DMEM ile birlikte pervanadate (adım 2.1) 10 µL 10 mL (sekiz tabak ifade sonuçlanan her 10 cm plaka ekleyin PD-1'in farklı sürümleri) (Şekil 1). Karanlıkta 15 dakika oda sıcaklığında tabak koyun. Not: SHP2-transfected hücreleri (iki tabak; Şekil 1) ve bu levhalar için active SHP2 enzim kaynağı olarak görev yapacak bu yana iki sigara transfected denetim tabak pervanadate ile kabul edilmediği.</li>
	<li>5 mL de buz gibi 1 x PBS hücrelerle yıkayın. Bu iki kez tekrarlayın.</li>
</ol>3. Immunoprecipitation
Not: Aşağıdaki adımları buz üzerinde veya 4 ° C'de yapılmalıdır
<ol><li>Lizis arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 250 mM NaCl, %0.1 NP-40, 2 mM EDTA, % 10 gliserol) proteaz inhibitörleri (10 ml lizis arabellek erime 1 tablet) ve 1 mM sodyum orthovanadate ile ek. Buz gibi lizis arabelleği 500 µL hücrelere eklemek ve kaldırmak ve hücreleri kullanarak hemen bir hücre sıyırıcı plaka toplamak. Not: Sodyum orthovanadate SHP2 transfected plakaları ve sigara transfected denetim plakaları fosfataz aktivitesi saklamanız gerekir bu yana, PD-1-GFP-transfected plakaları için kullanılan yalnızca lizis arabelleğe eklemek önemlidir.</li>
	<li>Lysates 1.5 mL soğuk tüpler içine aktarmak ve onları 0.005 x g, 30 dk için 4 ° C, döndürün.</li>
	<li>Sonrası çekirdeklerin süpernatant (PNS) lysates toplamak için spin aşağı 10.000 x g 4 ° c de 10 dakika lysates ve supernatants yeni tüpler içine aktarın. Pelet atmak. Daha sonra WCL analiz için buz üzerindeki altı tabak (Şekil 1) ikinci kümesi supernatants saklar.</li>
	<li>
PD-1-GFP immunoprecipitation PD-1-GFP-transfected lysates ilk gelen anti-GFP boncuk hazırlanması ayarla (dört tabak) (Şekil 1).
	<ol>
<li>Boncuk yerleşme önlemek için hafifçe açmadan önce boncuk şişeyle sallayın. Anti-GFP boncuk 40 µL Bulamaç başına her koşul kaldırın.</li>
		<li>500 x g 4 ° C'de 3 dk de spin ve boncuk yıkamayı süpernatant kaldırın. Not: Pipet plastik ipuçları ve kaybını önlemek için özel boncuk arasında teması en aza indirmek önemlidir. Bu boncuklar için başka bir tüp aktarmadan önce 200 µL bahşiş kenarına kesmek için tavsiye edilir.</li>
		<li>Boncuk lizis arabelleği (örnek) başına 80 µL resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yıkanmış boncuk doğrudan hücreye lysate (PNS) ilk kümenin (dört tabak) PD-1-GFP-ifade hücrelerden ekleyin (adım 3.3). 0.005 x g immunoprecipitate GFP öğesini proteinler için 4 ° C'de 30 dk için de döndürün.</li>
	<li>Boncuk 1 mL soğuk lizis arabelleği (olmadan orthovanadate) ile 3 kez yıkayın. 2500 x g 10 için de tüp santrifüj kapasitesi s. Not: lizis arabellek için boncuk eklerken, bu doğrudan boncuklar ipuçları ile dokunmadan ekleyin. Yukarı ve aşağı yıkama sırasında pipet için gerek yoktur.</li>
	<li>Aynı derecede ilk kümedeki (bir tabak; adım 3.3) aktif SHP2 lysate bölmek ve yıkanmış PD-1-GFP-içeren boncuk (WT PD-1-GFP ve iki farklı phosphdeficient mutasyonlar, Y223F ve Y248F) üç tüpler için ekleyin. -Üçte birimin WT PD-1-GFP boncuk ikinci tüp sigara transfected hücre lysate ekleyin. Kalan üçte iki atın.</li>
	<li>Boncuk nazik döndürme (0.005 x g) ile 4 ° C'de 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>İki kez ile 1 mL soğuk lizis arabelleği (olmadan, pervanadate veya orthovanadate), boncuk adım 3.6 bildirildiği gibi yıkayın.</li>
	<li>80 µL örnek her tüpün içinde toplam hacim 100 µL (boncuk 20 µL) ve 80 µL lizis arabelleği sağlamak başına lizis arabelleği (olmadan, pervanadate veya orthovanadate) ekleyin. Karışımı yavaşça ve 50 µL her tüp sizden iki taze 1,5 mL tüpler içine aktarın. Not: Bu adımı, orada-ecek var olmak iki tüp boncuk ve lizis arabellek içeren bir karışımı ile dolu: bir tüp co-immunoprecipitated SHP2 western Blot tarafından test etmek için kullanılacaktır ve ikinci fosfataz aktivitesi tayini için kullanılacaktır.</li>
</ol>4. fosfataz etkinliği tahlil
<ol><li>Boncuk fosfataz yıkama arabellek (30 mM Hepes pH 7,4 ve 120 mM NaCl) ile yıkayın. Süpernatant tamamen kaldırın.</li>
	<li>Boncuk için tahlil arabelleği (30 mM Hepes pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) 100 µL ekleyin ve nazik ajitasyon altında 30 dakika 30 ° C'de kuluçkaya. Not: Kuluçka zaman değişir, ancak arabellek dephosphorylation sarı yaşına gelene kadar bekle.</li>
	<li>Reaksiyon sona erdirmek için arabellek sarı döndüğünde 1 M NaOH 50 µL ekleyin.</li>
	<li>Spin aşağı 2500 x g 10 s ve transfer 50 µL süpernatant iki kuyu (iyi başına 50 µL alınanlarla) yarı-alan için için de bir 96-şey plaka. 405 absorbans okumak nm.</li>
	<li>Sonuçları göreli optik yoğunluğu (OD) PD-1-GFP denetim vahşi tipi sürümü üzerine hızlı.</li>
</ol>5. SHP2 Western Blot Analizi
<ol><li>Boncuk spin ve süpernatant kaldırın.</li>
	<li>2 x Laemmli arabelleği 20 µL ekleyin ( Malzeme tabloyabakın) boncuk ve 95 ° c 5 dakika kaynatın.</li>
	<li>Giriş protein konsantrasyonu ölçmek (ikinci bir BCA kullanarak set) denetimleri kiti ( Malzeme tabloyabakın). 30 µL en seyreltilmiş örneği için yeni bir tüp aktarın. Giriş denetimleri lizis arabellek en seyreltilmiş numune olarak aynı konsantrasyonu ile kalan sulandırmak ve 30 µL her biri için yeni bir tüp aktarın. Not: Bu adımı, orada-ecek var olmak 30 µL her, ile 4 tüpler benzer protein konsantrasyonları, giriş temsil eden lysates kontrol eder.</li>
	<li>Lysates ve kaynatın 5 dk. Spin için 95 ° C'de 2 x Laemmli arabelleğe eşit miktarda aşağı boncuk ve süpernatant 4 – %20 jel SDS-sayfa Tris tabanlı yük eklemek ( Malzeme tabloyabakın) için western blot analizi. Buna ek olarak, 50 µL ikinci küme her örnek--dan yük.</li>
	<li>Western blot Analizi protokolüne göre daha önce12açıklanan devam edin.</li>
</ol>

<ol><li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment%3A+the+current+arsenal+of+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li>
<li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li>
<li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li>
<li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation%2C+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li>
<li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46(2012).</li>
<li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li>
<li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li>
<li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70%2FCD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li>
<li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037(2013).</li>
<li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li>
<li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor%2C+pervanadate%2C+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li>
<li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li>
<li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20890902">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 18, Unit18 18 (2010).</li>
<li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Reseptör-enzim etkileşimleri hücre içi sinyal için büyük önem taşımaktadır. Birçok enzim reseptörleri SH2 etki alanları aynı reseptörlerinin kuyrukları süslemeleri fosforile tyrosines bağlama aracılığıyla işe. Ancak, enzimler kez kapalı etkin olmayan biçimler katlanmış ve diğer etki alanlarının aynı reseptör aracılı konformasyonal değişim11 istemek harekete geçirmek. Tahlil reseptörleri ve enzimler gibi faaliyet arasındaki etkileşimler bu etkileşimler tarafından indüklenen önlemler tanımlamak bura...

Katalitik reseptörleri ve reseptör Tirozin kinaz transmembran proteinler neden olan bir hücre dışı ligand bağlayıcı enzimatik aktivite hücre içi yan1' dir. Diğerleri belirli enzimler kinaz ve fosfatazlar sitoplazmik onların kuyrukları için gibi işe iken bazı reseptörleri reseptörü ve enzimatik işlevler, sahip. İşe bir enzim reseptör'ın kuyruğu ve bu enzim sonraki katalitik eylem için her zaman aynı protein etki alanları2tarafından düzenlenir değil iki ayrı işlemler vardır. Ne yazık ki, etkileşim ve enzimatik aktivite aynı anda değerlendirmek için belirli bir aracı vardır. Burada açıklanan fonksiyonel co-immunoprecipitation tahlil bir enzim alımı bir reseptör kuyruğuna onun aktivasyon incelemek için kullanışlı bir yöntemdir. Bu tahlil immunoprecipitation tagged reseptörlerinin antikor kaplı boncuk tarafından kullanır. Daha sonra bir enzim etkinliği tahlil ve western blot Analizi boncuk üzerinde gerçekleştirilir. Hangi protein etki alanlarının reseptörleri ve enzimler (western blot analizi ile değerlendirilmesi) arasındaki etkileşimler için gerekli olduğunu ortaya çıkarmak için bu yöntem genel amacı olduğunu ve hangi etki alanlarının (boncuk üzerinde ölçülen enzimlerin tam harekete geçirmek için zorunlu olduğunu enzimatik aktivite assay). İnsan hastalıkları patogenezinde onların katılımı nedeniyle reseptör ilişkili enzimlerin ayrı işlevleri eğitim araçları geliştirmek önemlidir. Ayrıca, daha fazla bu proteinlerin mekanizmaları anlama roman tedavi müdahaleler tasarım yardımcı olabilir.
Programlanmış ölüm-1 (PD-1) T hücrelerinin yüzeyinde bir inhibitör reseptörü ve aşırı T hücre yanıt-e doğru sınırlamak için gereklidir. Son yıllarda, birden çok maligniteler1,2tedavisinde anti-PD-1 antikorlar karıştığı olmuştur. PD-1 tüp ligasyonu yayılması, yapışma ve salgı birden çok sitokinler3,4,5gibi çok sayıda T hücre işlevi kısıtlayan. PD-1 immünolojik sinaps, T hücreleri ve antijen sunan hücreler6arasında nerede T hücre reseptör (TCR)7ile colocalizes arayüz için yerelleştirilmiştir. Daha sonra Tirozin fosfataz SHP2 [Src Homoloji 2 (SH2) Tirozin fosfataz 2 içeren etki alanını] PD-1 anahtar Tirozin kalıntıları karmaşık TCR ve onun ilişkili içinde proksimal dephosphorylation önde gelen, sitoplazmik kuyruk için oluşturulmuştur sinyal molekülleri3,4,5,8,9. PD-1 sitoplazmik kuyruk iki Tirozin motifleri, bir immunoreceptor Tirozin tabanlı inhibitör motifi (ITIM) ve bir immunoreceptor Tirozin dayalı-anahtar motifi (ITSM)10içerir. Her iki motifleri PD-1 tüp ligasyonu9,10fosforile. Mutagenesis çalışmalar bir birincil rolü için SHP2 işe alım, ITIM rolünü PD-1 sinyal ve fonksiyon açık değildir, aksine4ITSM ortaya çıkardı.
SHP2 ya da kapalı bir (katlanmış) benimser, uyum veya açık bir etkin uyum11(genişletilmiş), inhibe. PD-1 her kuyruk etki alanı SHP2 bağlama ya da harekete geçirmek için katkısını henüz aydınlatılmamıştır değil. Bu soruyu cevaplamak için biz SHP2 istihdamı PD-1 ve onun etkinlik12kuyruk için paralel test sağlar bir tahlil geliştirilmiştir. Co-immunoprecipitation ve etkileşim ve enzimatik aktivite paralel olarak test etmek için bir boncuk üzerinde fosfataz etkinliği tahlil çalıştırmaya başladık. Bu tahlil kullanarak, PD-1 ITSM ITIM PD-1 tam olarak genişletmek ve enzim harekete geçirmek için gerekli süre SHP2 PD-1, kuyruk için işe almak için yeterli olduğunu göstereceğiz.
Çeşitli bitişik etki alanlarına sitoplazmik onların kuyrukları birçok reseptörleri vardır. Fonksiyonel co-immunoprecipitation tahlil protein alımı ya da enzimatik harekete geçirmek için gerekli olan belirli etki alanları rolünü ortaya çıkarmak.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Mikrosantrifüj</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25) Fenol Kırmızı</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Isıyla İnaktive Edilmiş FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td>Fetal sığır serumu</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Fisher</td><td>BP295950</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin içermeyen DMEM yüksek glikoz</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>SuperFect Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SHP2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-280</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; GFP-agaroz</td><td>MBL</td><td>D153-8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Roche</td><td>118144600</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Aktin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-1616</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadat</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>%</td></tr> <tr><td>30Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>EDTA içermeyen</td></tr><tr><td>Tris-Glisin SDS Numune Tamponu (2x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td>Modifiye Laemmli tamponu</td></tr><tr><td>%4-20 Tris-Glisin Mini Jeller</td><td>Invitrogen</td><td>XP04205BOX</td><td>15 kuyulu</td></tr><tr><td>Nitroselüloz membranlar</td><td>General Electric</td><td>10600004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Sodyum klorür</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D1532</td><td>Ditiotreitol</td></tr><tr><td>pNPP</td><td>Sigma</td><td>20-106</td><td>p-Nitrofenil Fosfat</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Sodyum hidroksit</td></tr><tr><td>BCA</td><td>Fisher</td><td>23225</td><td>Bi Sinchoninic Asit tahlili</td></tr></tbody></table>

reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için co-immunoprecipitation tahlil

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Reseptör ilişkili hücresel harekete geçirmek büyük arabulucu enzimlerdir. Bu enzimler, en azından kısmen, reseptörleri sitoplazmik kuyrukları ile fiziksel etkileşimleri tarafından düzenlenmektedir. Etkileşimleri kez aracılığıyla belirli protein etki oluşur ve enzimler harekete geçirmek içinde neden. Proteinler arasındaki etkileşimler incelemek için birkaç yöntem vardır. Co-immunoprecipitation protein-protein etkileşimleri için gerekli olan etki alanları incelemek için yaygın olarak kullanılır iken, bu belge işe enzimlerin etkinliğini belirli etki alanlarına katkı aynı anda hiçbir deneyleri vardır. Buna göre burada açıklanan yöntemi co-immunoprecipitation ve bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil proteinler ve ilişkili enzimatik harekete geçirmek arasındaki etkileşimler aynı anda değerlendirilmesi için birleştirir. Bu iletişim kuralı bir protein ve enzim ve enzim tam harekete geçirmek için zorunlu olan etki alanları arasında fiziksel etkileşimleri için kritik olan etki alanları tanımlamak için hedeftir. Bu testin önemi gösterdi, diğer etki alanlarındaki aynı enzim fonksiyonu düzenlenmesi için gerekli olmakla birlikte bazı reseptör enzim reseptör, sitoplazmik kuyruk için bağlayıcı protein etki katkıda.

Katkı, ITSM PD-1'in SHP2 bağlama için kurulan iken, rol ITIM PD-1, daha az açıktır. SHP2 iki sıralı phosphotyrosines PD-1 (ITSM içinde bir Tirozin) ve ITIM diğerinde bağlayabilirsiniz iki SH2 etki alanı olduğundan, PD-1 ITIM SHP2 aktivite sabitleme ile kolaylaştırır süre ITSM PD-1 PD-1, SHP2 tutturur onaylanmadığına karar onun konformasyon devlet11,14' ü aç. Bu test etmek için bir kombine co-immunoprecipitation ve enzimatik aktivi...

Burada, co-immunoprecipitation ve plazma membran reseptörleri enzim işe alım ve enzim aktivitesi belirli protein etki katkısını aynı anda çalışmaya bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Bu yöntem, reseptör enzim etkileşimi ve enzimaktivasyonunda farklı protein alanlarının önemi gibi hücre sinyalizasyon alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, reseptör enzim etkileşimlerinin ve bu etkileşimin enzim aktivitesi üzerindeki fonksiyonel sonuçlarının birlikte test edilmesine olanak sağlamasıdır. Her plaka için 10 mililitre DMEM kullanın ve %10 FBS ve %1 penisilin ve streptomisin ile tamamlanır.Transfeksiyondan bir gün önce, insan embriyonik böbrek 293-T hücrelerini 12 10 santimetrelik plakalara hemositometre kullanarak hücreleri saymak için tohum. %5 C02'de 37 derecede kuluçkaya yat. Hücreler %80 ila %90 oranında konfluent olduktan sonra, plakaların beşini transfect etmek için lipid bazlı transfeksiyon ajanı kullanın.10 santimetrelik plakalarda yapışma hücreleri için üreticinin talimatları aşağıdaki transfection gerçekleştirin. Daha sonra, immünopresimadan önce ifade edilen protein miktarının ölçümü için transfected olmayan bir kontrol görevi veren ek bir plaka ile birlikte beş plakadan oluşan aynı ikinci seti transfect. Bir doku kültürü kuluçka makinesinde transfected plakaları 48 saat boyunca %5 CO2'de 37 derecede kuluçkaya yatırın.GFP ekspresyonu için hücreleri incelemek ve transfeksiyonun başarıyla meydana geldiğinden emin olmak için floresan mikroskop kullanın. Taze bir pervanaat karışımı hazırlamak için 15 mikrolitre 100 milimolar sodyum ortoovanadate ile %30 hidrojen peroksit 50 mikrolitre karıştırın. PD-1'in etiketli sürümlerini fosforilasyona çıkarmak için, ortamı PD-1-GFP transfected hücrelerden çıkarın.Her plakaya 10 mililitre düz DMEM ve 10 mikrolitre pervanat ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Bundan sonra, yıkama başına beş mililitre PBS kullanarak hücreleri buz gibi PBS'de üç kez yıkayın.İmmünoenaz yapılırken tüm adımlar buzüzerinde veya dört santigrat derecede yapılmalıdır. 10 mililitre tampon inhibitörleri bir tablet eriterek proteaz inhibitörleri ile lysis tampon tamam. Ayrıca PD-1-GFP-transfected plakalar kullanılacak tampon sodyum orthovanadate bir milimolar ekleyin.Hücrelere 500 mikrolitre buz gibi lisis tamponu ekleyin, sodyum orthovanadate içeren lysis tamponunun sadece PD-1-GFP-transfected hücreleri içeren plakalara eklenmesini sağlamak. Hemen kaldırmak ve plakalardan hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Lysatları 1,5 mililitrelik soğuk tüplere aktarın ve 0,005 kat yerçekiminde ve 4 derecede 30 dakika döndürün.Lysates'ten çekirdek sonrası süpernatant'ı toplamak için, 10,000 kat yerçekimi ve 4 santigrat derece 10 dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatants yeni tüpler halinde aktarın ve pelet atın. Daha sonra WCL analizi için buz üzerinde altı plaka ikinci seti için supernatants saklayın.Anti-GFP boncuklar hazırlamaya başlamak için, yavaşça yerleşmeönlemek için açmadan önce boncuk içeren şişe sallayın. Her koşulda bulamaç tan anti-GFP boncuk 40 mikrolitre çıkarın. 500 kat yerçekiminde santrifüj ve üç dakika boyunca dört santigrat derece.Kaybı önlemek için pipet ve boncuk arasındaki teması en aza indirmek için emin olun, boncuk yıkamak için supernatant çıkarın. Örnek başına 80 mikrolitre likis tamponu boncukları yeniden askıya alın. Yıkanmış boncukları doğrudan dört plakalı ilk setin PD-1-GFP ifade eden hücrelerinden hücre lysate'sine ekleyin.GFP etiketli proteinleri immünopprepititate etmek için 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 0.005 kez yerçekimi nde döndürün. Her yıkama için ortovanadate içermeyen bir mililitre soğuk lysis tampon kullanarak boncukları üç kez yıkayın. Sonra 10 saniye boyunca 2,500 kat daha fazla yer çekiminde santrifüj.Aktif SHP2'nin ilk plaka setinden üç eşit bölüme bölün ve yıkanmış PD-1-GFP içeren boncukları içeren üç tüpün her birine bir porsiyon ekleyin. Nontransfected hücrelerden yabani tip, PD-1-GFP boncukikinci tüp için lysate hacminin 1/3 ekleyin. Kalan 2/3'ü atın.0.005 kez yerçekimi nazik rotasyon ile dört derece santigrat dört saat boyunca boncuk kuluçka. Bundan sonra, her yıkama için soğuk lysis tampon bir mililitre kullanarak iki kez boncuk yıkayın. Her numuneye 80 mikrolitre likis tamponu ekleyerek her tüpteki toplam hacmin 100 mikrolitre olmasını sağlar.Bir kesme pipet ucu kullanarak, pipet yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için. Daha sonra her tüpten 50 mikrolitreyi iki, taze, 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Fosfataz yıkama tampon ile bir kez boncuk yıkayın.Sonra tamamen supernatant çıkarın. Boncuklara 100 mikrolitre arbede tamponu ekleyin ve nazik ajitasyon altında 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Tampon sarıya döndüğünde, sodyum hidroksit bir molar çözeltisi 50 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu sona erdirin.10 saniye boyunca 2, 500 kat yerçekiminde santrifüj. Bundan sonra, 96-iyi plaka yarım alanda iki kuyu içine supernatant aktarın. Emicileri 405 nanometrede okuyun ve pd-1-GFP'nin kontrol vahşi tipi sürümü üzerinde göreceli optik yoğunluk olarak sonuçları ifade edin.Önce boncukları 2,000 kat yerçekiminde ve 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın. Iki kez Laemmli tampon 20 mikrolitre ekleyin ve beş dakika boyunca 95 santigrat derecede kaynatın. BCA kiti kullanarak, giriş kontrollerinin protein konsantrasyonu ölçün.En seyreltilmiş numunenin 30 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. Giriş kontrollerinin geri kalanını en seyreltilmiş numuneyle aynı konsantrasyonda seyreltmek için lysis tamponu kullanın. Daha sonra seyreltilmiş giriş kontrollerinin her birinin 30 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın.Lysates iki kez Laemmli tampon eşit hacimlerde ekleyin ve beş dakika boyunca 95 derece santigrat kaynatın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi Western Blot analizi yapmadan önce boncukları 2,000 kat yerçekimi ve 4 santigrat derece ile 30 saniye boyunca aşağı çevirin. Bu çalışmada, reseptör enzim etkileşimlerinin ve aktivasyonunun paralel değerlendirilmesi için kombine ko-immünopreksiyon ve enzimaktivitesi teşrisi geliştirilmiştir.Beklendiği gibi, ITSM mutasyona uğratıldığında SHP2 PD-1'e bağlanmayı başaramadı. Dikkat çekici bir şekilde, ITIM'nin mutant versiyonu SHP2'nin sadece sınırlı bir ölçüde bağlanmasını engelledi. Bununla birlikte, SHP2-fosfataz aktivitesi titretisi, ITIM ve ITSM'nin enzimatik aktivite için eşit derecede vazgeçilmez olduğunu ortaya koymaktadır.Bu, SHP2'nin dinlenme koşullarında otomatik olarak konformasyona katlandığı iki aşamalı bir aktivasyon modelini ortaya çıkarır. PD-1 aktivasyonu üzerine, SHP2 fosforile ITSM için işe alındı. Ancak, ITIM de aktif koformasyon içine SHP2 açığa fosforilted olmalıdır.Gelişiminden sonra, bu teknik reseptör-enzim etkileşimlerinde protein etki fonksiyonlarının işlevini keşfetmek için hücre sinyalalanında araştırmacılar için önünü açabilir.

co-immunoprecipitation-assay-for-studying-functional-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, protein-protein etkileşim analizi için bir PVDF membranı üzerinde birlikte immünopresipite protein komplekslerini göstermektedir. Komplekslerden indirgenmiş proteinler, daha küçük peptitlerde tek tek proteinleri parçalamak için tripsin ile muamele edildi, daha sonra kalan peptitler PVDF zarından ekstrakte edildi. Kompleksteki her iki proteinden türetilen çekilen peptit daha sonra kurutuldu ve daha fazla analiz için düşük bir formik asit konsantrasyonunda yeniden süspanse edildi.

Etkileşim çalışmaları için birlikte immünopresipite edilmiş proteinleri hazırlamak için zar üzerinde protein sindirimi

Bu videoda, anti-GFP antikorları ile kaplanmış boncuklar kullanarak GFP etiketli vahşi tip ve mutasyona uğramış PD-1 proteinlerinin ko-immünopresipitasyonunu gerçekleştirmek için bir teknik gösteriyoruz. Boncuk bağlı PD-1-GFP proteinleri, PD-1 ile etkileşime giren SHP2 proteinleri ile inkübe edilir ve PD-1'de SHP2 etkileşiminde kritik bir rol oynayan spesifik yapısal motiflerin tanımlanmasını sağlar.

Transfekte Edilmiş Hücrelerde Enzim Reseptör Etkileşimlerini İncelemek için İmmünopresipitasyon Testi

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Protein-protein etkileşimleri, hedef proteinlerin işlevini aydınlatmak için önemlidir ve ko-immünopresipitasyon (co-IP), PPI'leri kolayca doğrulayabilir. Epitop etiketli bir proteini kodlayan bir plazmiti HEK-293 hücrelerine geçici olarak transfekte ettik ve iki hedef proteinin bağlanmasını kolayca doğrulamak için bir immünopresipitasyon yöntemi geliştirdik.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Anti-Epitop Etiket Afinite Jeli ile İmmünopresipitasyon

Bu protokol klonal hücre hattı seçimi ve onların cognate GPCRs sentezlenmiş eklembacaklı nöropeptidlerin yapı-aktivite ilişkileri analiz etmek için bir kalsiyum biyoparlaklık tahlil için yönergeler sağlar. Bu testte, sentetik analog tasarım ve peptid / kurşun ilaç keşfi için reseptör deorphanization ve yapı-aktivite ilişkileri çalışmaları için kullanılabilir.

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Öğrenin, reseptör-enzim etkileşimlerini ve aktivasyonunu paralel olarak değerlendirmek için co-immunoprecipitation ve enzimatik aktivite testi yöntemini. Bu teknik, hücre sinyalizasyonu alanında protein alanlarının işlevsel rollerini anlamaya yardımcı olur.

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Daha fazla video keşfet