Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Bu yöntem, makropinositozda belirli bir gen, protein veya moleküler yolun yer alıp almadığı gibi Dictyostelium ve makropinositoz alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, zaman, genetik mutasyonlar, inhibitör konsantrasyonları ve ortam bileşimleri gibi birçok değişkenin paralel olarak test edilebilmesi ve sonuçlara tek hücreli bir çözünürlük vermesidir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi bakterilerle SM agar üzerinde ekili hücreler elde edin.

Hücreleri besleme cephesinden 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 25 mililitre KK2 tamponuna toplayın. Hücreleri ayırmak için tüpü girdaplayın ve üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın ve peleti 50 mililitre taze KK2 tamponunda yeniden süspanse edin.

Santrifüj ederek, süpernatanı çıkararak ve her yıkama için 50 mililitre KK2 tamponunda yeniden süspanse ederek bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, hücre yoğunluğunu belirlemek için bir hemositometre veya başka bir hücre sayma cihazı kullanın. Hücreleri, mililitre başına 100.000 hücre konsantrasyonuna kadar antibiyotik içeren HL5 ortamına seyreltin.

Her koşul için üç kuyucuk kullanarak, düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre seyreltilmiş hücre çözeltisi pipetleyin. 24 saat boyunca 22 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, kullanılan ortamda TRITC-dekstran'i mililitre başına bir miligrama seyreltin.

Her oyukta mililitre başına 0.5 miligramlık bir son TRITC-dekstran konsantrasyonu için her kuyucuğa 50 mikrolitre ekleyin. 22 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Hücreleri akış sitometrisi için hazırlamaya başlamak için, sıfırıncı dakika güncelleme kontrollerine 50 mikrolitre dekstran içeren ortam ekleyin.

Ardından, ortamı plakadan boşaltın ve bir doku üzerinde kurulayın. Plakayı buz gibi KK2 tamponuna batırarak yıkayın ve ardından tamponu plakadan boşaltın. Her oyuğa KK2MC içinde çözünmüş buz gibi soğuk beş milimolar sodyum azid içeren 100 mikrolitre çözelti ekleyin.

Metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometrisi ile sıvı güncellemesini ölçün. Daha önce tarif edildiği gibi, her suş ve koşul için üç kuyucuklu taze düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakası hazırlayın. Tipik bir zaman seyri için, sıvı alımını sıfır, 30, 60, 90, 120 ve 180 dakika olarak ölçmeyi planlayın.

180 dakikalık zaman noktası kuyucuklarına 50 mikrolitre dekstran etiketli ortam ekleyin. 60 dakika sonra, 120 dakikalık zaman noktası kuyucuklarına dekstran etiketli ortam ekleyin. Ortamı tüm plaka için sırayla bu şekilde eklemeye devam edin.

Sıfır dakikada, sıfır dakika kontrol kuyularına 50 mikrolitre dekstran içeren ortam ekleyin. Ardından ortamı hemen boşaltın. Plakayı buz gibi KK2 tamponuna batırarak yıkayın, ardından tamponu plakadan boşaltın.

Metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometrisini kullanarak plakayı analiz edin. Daha önce tarif edildiği gibi, her suş ve koşul için üç kuyucuklu taze düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakası hazırlayın. Mililitre başına bir miligram konsantrasyonda dekstran içeren ortamı hazırlayın.

İlgilenilen bileşiği, istenen maksimum nihai konsantrasyonun iki katı olan bir konsantrasyona seyreltmek için bu ortamı kullanın. Daha sonra, aracın aynı oranında dekstran içeren orta içeren ikinci bir tüp hazırlayın. Her iki çözeltiyi de girdap yaparak karıştırın.

Numune başına 200 mikrolitre dekstran içeren ortamda ilgilenilen bileşiğin bir seyreltme serisini oluşturmak için bu çözeltileri kullanın. Her numuneyi girdap yaparak karıştırın. Her numune kuyucuğuna bu ortamdan 50 mikrolitre ekleyin.

Bir saat sonra, ortamı plakadan boşaltın. Plakayı buz gibi KK2 tamponuna batırarak yıkayın ve ardından tamponu plakadan boşaltın. Metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometrisini kullanarak plakayı analiz edin.

Temsili akış sitometrisi verileri, sitometre bloke edilmediğinde ve hücrelerin ileri saçılma ve yan saçılma profilleri düzgün bir şekilde ayarlandığında, hücrelerin kolayca ayırt edilebileceğini göstermektedir. Mutantlar arasındaki farkları ararken, üç fenotipten birinin olması muhtemeldir. Mutantlar normal bir sıvı alımına sahip olabilir, kısmi bir kusura sahip olabilirler veya sıvı alımı tamamen ortadan kaldırılabilir.

Ortalama medyan sıvı alımı, içselleştirilen sıvı hacmini hesaplamak için kullanılır. Sıvı alım süresi seyrinde, içselleştirilmiş floresan 60 ila 90 dakika artar. Bundan sonra dekstran ekzositoza uğramaya başlar ve bir platoya ulaşılır.

Ortalama medyan sıvı alımı, hücreleri makropinositoza karşı etkili inhibitörlerle tedavi ederken olduğu gibi, verileri bir kontrolle karşılaştırırken de kullanılır. Tedavi edilen hücrelerde, bir saat içinde içselleştirilen dekstranın azaldığı ve daha yüksek inhibitör konsantrasyonlarında neredeyse sıfıra düştüğü görülür. Makropinositoz ile sıvı alımının sadece% 50'sini engelleyen nokodazol gibi tüm inhibitörler tamamen etkili değildir.

Bu prosedürü takiben, makropinositozu azalmış hücrelerin daha az veya daha küçük makropinozom yapıp yapmadığı gibi, sıvı alımının belirli bir durumda farklı olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için mikroskopi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.