Name: İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin, RT-LAMP yöntemiyle idrar, serum ve sivrisinek örneklerinde Zika virüsünü hızlı ve maliyet etkin şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu teknik RNA izolasyonu gerektirmeden yaklaşık 30 dakikada sonuç verir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Maureen ve Ronald Hirsch aile hayırsever katkısı ve alan Nöroloji Enstitüsü, St Mary's Michigan tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. Biz de Dr Bernadette Zwaans ve Elijah Ward el yazması onların eleştiri için teşekkür ederim.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) Beaumont sağlık tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde yapıldı.
Dikkat: Tüm potansiyel bulaşıcı malzemeler kişisel koruyucu ekipman kullanımı da dahil olmak üzere seviye 2 standartlarına göre ele alınmalıdır. Aerosol üretebilir tüm yordamlar bir Biyogüvenlik kabini yapılmalıdır. Ayrıca, çalışma canlı sivrisinek ile uygun eklem bacaklılar koruma düzey 1-3 tesisinde gerçekleştirilmelidir. Konjenital anormallikler ile ZIKV enfeksiyon Derneği göz önüne alındığında, gebe kalmaya çalışan hamile kadınlar veya bu kadınlar ortaklarının önemli ölçüde ZIKV laboratuvar maruz kaldıkları en aza indirmek gerekir. ZIKV örnekleri taşıma Amerika Birleşik Devletleri'nde Kategori B biyolojik maddeler uyarınca bölümü ulaşım tehlikeli malzemeler düzenlemeler olarak sınıflandırılmış (49 CFR bölüm 171-180) ve bu nedenle örnekleri sevkiyat için uygun yönergeleri. ZIKV Amerika Birleşik Devletleri biospecimens içe aktarma işlemi bir merkezleri hastalık kontrol ve önleme (CDC) ithalat izni gerektirir. Onlar bulaşmamış olsa bile, bir vektör ZIKV iletimi için bir ABD Tarım Bakanlığı (USDA) gerektirdiği hizmet verebilecek herhangi bir Artropodların ithalat izni. Bu bilgiler yayın sırasında geçerli olur. Güncel öneriler https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html bulunabilir.
Not: deneysel planlamasında önlemler alınmalıdır böylece RT-lamba reaksiyonlar yanlış olumlu tepkiler, daha yüksek oranda yatkındır. Tüm kurulum ve RT-lamba reaksiyonlar yürütülmesini belirlenen Pipetler ve filtre ipuçları kullanmanız gerekir. İdeal olarak, bir yan iş akışı kurulmalıdır. Mümkünse, analiz ve (Bölüm 5) görüntüleme kontaminasyonu önlemek için ayrı bir kapalı odada gerçekleşmelidir. Test tüpleri RT-lamba ürünleri içeren açılışı minimumda tutulmalıdır.
1. RT-lamba astar hazırlama
<ol><li>Her lyophilized RT-lamba astar moleküler sınıf su 100 µM (Tablo 1) son bir konsantrasyon için yeniden oluşturma. Kısaca astar çözüm homojen bir çözüm sağlamak ve kısaca çözüm tüm astar çözüm toplamak için bir masa üstü santrifüj maksimum hızda aşağı spin girdap.</li>
	<li>Hazırlamak bir 10 x RT-lamba Tablo 2' de birimleri kullanma FIP, BIP, F3, B3, Eğer ve LB astar astar karışımı. Kısaca astar çözüm homojen bir çözüm sağlamak ve kısa bir süre içinde herhangi bir kaybı önlemek için bir masa üstü santrifüj maksimum hızda çözüm aşağı spin girdap. Not: Ae. aegypti aktin (AEDAE) için ayarla RT-lamba astar LB astar içermiyor (döngü astar her zaman RT-lamba reaksiyonlar için gerekli değildir). Bu durumda, LB astar birim moleküler sınıf su ile değiştirin.</li>
	<li>Astar kullanır arasında-20 ° C'de depolayın ve ücretsiz-çözülme döngüsü önlemek.</li>
</ol>2. numune hazırlama
<ol><li>
İnsan idrar numuneleri için: Taze idrar, donmuş idrar veya idrar koruyucu kullanın. Taze veya dondurulmuş örnek için: hemen koleksiyon için vasıl 700 x g, 10 dk sonra örnek spin ve süpernatant analizi için kullanın veya ileride kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak. Kullanmadan önce buzda donmuş numuneler çözülme.</li>
	<li>
İnsan serum numuneleri için: Her iki taze veya dondurulmuş serum numuneleri kullanın.</li>
	<li>
ZIKV için hücre hatları enfekte: klimalı ortamları veya hücre lysates kullanın. Not: Boş hücre Ae medyadan şartına. albopictus C6/36 hücreleri 8 gün sonrası enfeksiyon olumlu denetimleri ZIKV RT-lamba reaksiyonlar için kullanılabilir.</li>
	<li>
Ae. aegypti sivrisinek için: ya da tamamen taze veya dondurulmuş sivrisinek leşleri kullanın. Buzda donmuş sivrisinekler çözülme. Ham sivrisinek lysate fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 100 µL içinde bireysel bir sivrisinek koyarak hazırlamak ve 10 kez P10 damlalıklı ucu (Şekil 1) ile sivrisinek kırma tarafından homojenize. Kısa bir süre herhangi bir enkaz cips lysate ham santrifüj kapasitesi. Süpernatant aşağı akım RT-lamba çözümleme için kullanın. Not: Pozitif denetimleri bir laboratuvar ortamında dişi sivrisinekler yaklaşık 103 genom virüs 200 birimindeki karşılıkları ile intratorasik mikroenjeksiyon kullanarak bulaşmasını tarafından oluşturulabilir nL ve sivrisinek 5 gün hasat sonrası enfeksiyon.</li>
</ol>3. hazırlayın RT-lamba Master Mix
<ol><li>Buz bir RT-lamba ana mix tepki her astar Tablo 3' te toplu Kılavuzu kullanarak kullanılacak ayarlamak için hazır olun. Not: Kullanım thermolabile urasil DNA Glycosylase (UDG), yanlış pozitif önlemede yardımcı olur.</li>
	<li>Kısaca tüm örneklerini de karıştırılır sağlamak için girdap sonra spin aşağı kısaca güç kaybını önlemek için.</li>
</ol>4. RT-lamba tahlil
<ol><li>
Damlalıklı 23.0 µL tepki 200 µL PCR tüp içine başına RT-lamba ana karışımı. 2.0 µL örneği (idrar, serum veya ham sivrisinek lysate süpernatant 2. adımda açıklandığı gibi) ekleyin. Buna 25,0 µL RT-lamba tepki başına toplam hacim getirecek. Negatif kontrol için moleküler sınıf su kullanın. Olumlu bir denetim içerir. Not: Bir PCR standart veya virüs stokları süpernatant enfekte hücre hatları üzerinden olumlu bir denetim olarak kullanılabilir.<ol>
<li>İsteğe bağlı: ilgili Abdovirüs dang virüs (DENV) gibi bir özgüllüğü denetim reaksiyon içerir. Örnek örnek türüne göre adım 2'de açıklandığı şekilde hazırlayın. Özgüllük denetiminin 2.0 µL 23.0 µL 200 µL PCR tüp içine RT-lamba ana karışımı ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri için ısı blok, su banyosu veya thermocycler kullanarak 30 dk 61 ° C'de ısı.</li>
	<li>Isı devre dışı bırakmak ve polimeraz ile 80 ° C arasında 10 dk Isıtma tarafından.</li>
</ol>5. RT-lamba Analizi
Not: Ayrı, kapalı alanda RT-lamba çözümlemesi gerçekleştirin.
<ol><li>
Kuluçka sonra RT-lamba reaksiyonlar görsel olarak bir renk değişikliği varlığı için bakarak erişin.
	<ol>
<li>Floresan nükleik asit boya 1:10 TAE (40 mM Tris, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA) arabelleği sulandırmak. Dikkat: Herhangi bir nükleik asit leke nükleik asitler için bağlar ve bu nedenle bir kanserojen. İşlerken eldiven.</li>
		<li>İçin 12 µL RT-lamba tepki floresan nükleik asit boya seyreltme 2 µL ekleyin. Not: Olumsuz tepkiler turuncu renkte olacak ve olumlu tepkiler sarı/yeşil renkte olacak.</li>
		<li>İsteğe bağlı: bir kamera ile beyaz bir arka plan üzerinde RT-lamba reaksiyonlar fotoğraf çekmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>302 nm UV altında örnekleri floresans tarafından RT-lamba ürünleri varlığını doğrulamak ışık yerleştirin. Bir kamera ile sonuç resmini çek. Not: Pozitif RT-lamba reaksiyonlar floresan bir çıkış olacak. Dikkat: UV koruyucu göz googles ya da yüz kalkan UV ışığı ile çalışırken giyiyorum.</li>
	<li>
İsteğe bağlı: RT-lamba ürün örnekleri üzerinde jel elektroforez gerçekleştirerek onaylayın.
	<ol>
<li>1 x TAE arabellek görüntüleme için bir nükleik asit leke ile % 2 özel jel dökmek. Dikkat: Herhangi bir nükleik asit leke nükleik asitler için bağlar ve bu nedenle bir kanserojen. İşlerken eldiven.</li>
		<li>Bir DNA merdivenin 5 µL moleküler ağırlık karşılaştırmak için ilk şeritte ekleyin.</li>
		<li>Her RT-lamba tepki için RT-lamba tepki karışımı 13 µL boya yükleme DNA 2 µL ile karıştırın. Boya yükleme DNA içeren 15 µL karışımı yerleştirin.</li>
		<li>Jel 90 V 90 dk ya kadar bantları ayrılır ve görüntü 302 nm UV ışık ile çalıştırın. Not: Pozitif RT-lamba reaksiyonlar laddering bir model olacaktır. Olumsuz RT-lamba tepkiler hiç grup içermemesi gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. elden çıkarma
<ol><li>RT-lamba reaksiyonlar çift mühürlü torbalar içinde atın. Bu yanlış pozitif tepkiler gelecekte önde gelen RT-lamba ürünleri yaymakolduğunu değil otoklav yap.</li>
</ol>

<ol><li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1602113">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Microbiological+Societies+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method%3A+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).</li>
<li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25741643">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803(2018).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18674965">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948(2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li>
<li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223(2016).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li>
<li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li>
<li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika%2C+chikungunya%2C+and+dengue+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778(2017).</li>
</ol>

LEL ve MBC Zika virüs tanı yöntemleri üzerinde fikri mülkiyet hakkına sahiptir. Kalan yazarların hiçbir rakip çıkarları vardır.

Bu kağıt işler insan ve sivrisinek örnekleri6kullanarak açıklanan ZIKV RT-lamba tahlil. Semptomatik enfekte ZIKV hastanın normal viral yük 10 olduğundan yeterli olacaktır yaklaşık 1 genom eşdeğer6, algılama sınırı olduğunu3 ' e 106 PFU/mL7. Ayrıca, bu yöntem ilk izole RNA ve hücre kültüründe virüsü amplifikasyon olmadan örneklerdeki ZIKV algılayabilir. Bu önemli ölçüde zaman, maliyet ve sağlık riskleri qRT-PCR için ka...

Gebelik sırasında enfeksiyon bağlı için düşük, distres, microcephaly, hem de diğer konjenital dahil olmak üzere ağır nörolojik Doğum kusurları için 2015 yılında Zika virüs (ZIKV) önde gelen küresel dikkat endişe bulaşıcı bir hastalık olarak elde Doğum kusurları1. Nadir de olsa bazen ZIKV Guillain-Barré sendromu ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. ZIKV öncelikle Aedes sivrisinekler tarafından iletilir; Ancak, bu da cinsel temas1ile yayılır. Verilen bu ZIKV enfeksiyonla insanların çoğu asemptomatik veya diğer arborviruses1enfeksiyon belirtileri olan üst üste hafif grip benzeri belirtiler sunar, hızlı ve düşük maliyetli algılanması için gelişmiş yöntemler için bir ihtiyaç vardı Hem insanlar hem de yerel sivrisinek nüfus ekran ZIKV.
Nicel Ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) ZIKV algılama için güvenilir bir tahlil olduğunu; Ancak, bu teknik pahalı özel ekipman, eğitimli personel ve örnek RNA izolasyonu ilgi gerektirir. Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (RT-lamba) sadece bir kuluçka sıcaklık iplikçik ile termofilik DNA polimeraz kullanımı nedeniyle gerektirir PCR teknolojisi tabanlı bir tek adımlı nükleik asit amplifikasyon yöntemdir yer değiştirme özellikleri. Bu bir thermocycler ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve tahlil tamamlamak için gereken süreyi azaltır. RT-lamba ek avantajları şunlardır onun yüksek özgüllük ve hassasiyet, pH seviyeleri ve sıcaklıklar ve birçok PCR inhibitörleri2direnç bir mesafeden sağlamlık. Reaktifler oda sıcaklığında kararlı ve nispeten düşük maliyet vardır. Bu özellikleri göz önüne alındığında, RT-lamba bir laboratuvar veya alana dağıtılabilir. Bu nedenle, lamba tepkiler çeşitli patojenler ve diğer tür enfeksiyon3,4,5algılamak için geliştirilmiştir. Bu raporda açıklanan RT-lamba Protokolü amacı RNA izolasyon insan serum ve idrar örneklerinde de RT-lamba üzerinden 30 dk içinde tek bir virüslü sivrisinek gibi olmadan ZIKV tespit etmektir. Bu yöntem hızlı bir şekilde ve ayarları laboratuvar dışında çalışır bir duyarlı, hızlı tanı aracı olarak qRT-PCR değiştirmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Bst 2.0 WarmStart DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0537S</td> İzotermal Amplifikasyon Tamponu<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0537S</td><td></td></tr><tr><td>WarmStart RTx Ters Transkriptaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0380S</td><td></td></tr><tr><td>Antarktika Termolabil UDG</td><td>New England Biolabs</td><td>M0372S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>New England Biolabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP Çözümü</td><td>New England Biolabs</td><td>N0440S</td><td>Deoksinükleotid Seti N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dCTP Çözeltisi</td><td>New England Biolabs</td><td>N0441S</td><td>Deoksinükleotid Seti N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dTTP Çözeltisi</td><td>New England Biolabs</td><td>N0443S</td><td>Deoksinükleotid Seti N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dGTP Çözeltisi</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td>Deoksinükleotid Seti N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dUTP Çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0133</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Yeşil I Nükleik Asit Jel Leke</td><td>İnvitrojen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Nancy-520</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01494</td><td></td></tr><tr><td>Düşük DNA Kütle Merdiveni</td><td>İnvitrojen</td><td>10-068-013</td><td></td></tr><tr><td>Zika Pozitif Kontrol</td><td>Robert Koch Enstitüsü, Almanya</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>BlueJuice Jel Yükleme Tamponu</td><td>İnvitrojen</td><td></td><td></td>10816015</tr><tr><td>Primerler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Özel Oligo</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Ambion</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>İdrar Koruyucu</td><td>Norgen Biotek</td><td>18126</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV PCR Standardı</td><td>Robert Koch Enstitüsü</td><td>N/A</td><td>Vero E6 hücre süpernatanları</td></tr><tr><td>DENV2 Yeni Gine C Kontrolü</td><td>Connecticut Tarımsal Deneyi İstasyon</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

İzotermal amplifikasyon (rt-lamba) transkripsiyon-loop-aracılı tahlil zika virüs ve housekeeping genler idrar, serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Zika virüs (ZIKV) ile enfeksiyon yetişkinlerde asemptomatik olabilir, ancak, gebelik sırasında enfeksiyon çocuk düşürme ve ağır nörolojik Doğum kusurları yol açabilir. Bu iletişim kuralı, hızlı bir şekilde insan ve sivrisinek ZIKV algılamak için hedeftir. ZIKV algılama için geçerli altın standart olduğunu nicel Ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR); Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (RT-lamba) bir daha verimli ve düşük maliyetli pahalı ekipmanlara gerek kalmadan test etmek için izin verebilir. Bu çalışmada, RT-lamba ZIKV algılama 30 dk içinde çeşitli biyolojik örneklerde için ilk örnekten RNA izole olmadan kullanılır. Bu tekniği kullanarak ZIKV hasta idrar ve serum enfekte ve sivrisinek örnekleri enfekte gösterilmiştir. 18s ribozomal ribonükleik asit ve aktin insan ve sivrisinek örnekleri, denetimler olarak sırasıyla kullanılır.

RT-lamba reaksiyonlar üç farklı yöntem kullanılarak çözümlenebilir. İlk olarak, bir floresan nükleik asit boya eklenmesiyle, olumlu tepkiler olumsuz tepkiler turuncu renkli çıplak gözle görüneceği yeri sarı/yeşil renkte olacaktır. İkinci olarak, floresan nükleik asit boya RT-lamba tepki için ek floresan sinyal oluşur örnekleri UV ışığıyla heyecanlı mısın. Olumsuz tepkiler algılanabilir bir floresan sinyal negatif kontrol küçük miktarlarda mevcut olabilir herhangi bir arka plan floresans ü...

Bu iletişim kuralı Zika virüs tespit veya hedefleri insan serum ve idrar örnekleri veya sivrisinekler Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon tarafından (RT-lamba) denetlemek için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu yöntem does değil istemek RNA izolasyon ve 30 dk içinde yapılabilir.

İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Bu yöntem, örneklerin Zika virüsü içerip içermediğini hızlı bir şekilde belirleyebilir. Bu, hamile kadınlar, gebe kalmaya çalışan çiftler veya Zika enfeksiyonu riski altında olan yerel sivrisinek popülasyonlarının izlenmesi için yararlıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, hızlı, kolay, pahalı ekipman gerektirmez ve rna izolasyon adımı olmadan yapılabilir.Bu tekniğin sonuçları Zika enfeksiyonunun tanısına kadar uzanır, çünkü gebelik sırasında enfeksiyon düşük, ölü doğum ve diğer ciddi konjenital, nörolojik doğum kusurları ile bağlantılıdır. Bu yöntem Zika'ya ışık sağlasa da, virüse özgü astarlar kullanılarak dang, chikungunya veya Batı Nil virüsü gibi diğer bulaşıcı hastalıklara da uygulanabilir. Başlamak için, moleküler sınıf sudaki her RT-LAMP astarını 100 mikromolar son konsantrasyona yeniden oluşturun.Çözeltinin homojen olduğundan emin olmak için astar çözeltisini kısaca girdaplayın. Astar çözeltisini toplamak için maksimum hızda yaklaşık beş saniye santrifüj yapın. Daha sonra teknoloji protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi 10x RT-LAMP astar karışımı hazırlayın.Vortex kısaca homojenliği sağlamak için. Ve herhangi bir kaybı önlemek için maksimum hızda kısa bir süre santrifüj. Astarları eksi 20 santigrat derecede, kullanımlar arasında saklayın, herhangi bir donma-çözülme döngüsünden kaçının.İnsan idrar örnekleri için, koruyucu taze idrar, dondurulmuş idrar veya idrar kullanın. Kullanmadan önce buz üzerinde herhangi bir dondurulmuş örnekleri eritin. İnsan serum uyrcusu taze veya dondurulmuş, ZIKV enfekte hücre hatları ise şartlı ortam veya hücre lisatları içermelidir.Son olarak, Aedes aegypti sivrisinekler için, taze ya da dondurulmuş tüm leşler kullanın. Buzdaki donmuş sivrisinek leşlerini eritin. PBS 100 mikrolitre bireysel bir sivrisinek yerleştirin.P10 pipet ucu kullanarak sivrisinek 10 kez ezmek ve ham bir sivrisinek lysate oluşturmak için homojenize. Kısaca herhangi bir enkaz pelet ham lysate santrifüj ve aşağı RT-LAMP analizi için supernatant kullanın. Başlamak için, teknoloji protokolünde tablo üç anahat olarak, kullanılacak her astar için buz üzerinde bir RT-LAMP ana karışım reaksiyonu hazırlayın.Girdap her örnek iyi karışık olduğundan emin olmak için. Sonra kısa bir süre ses kaybını önlemek için aşağı spin. Her reaksiyon için, pipet 23.0 rt-LAMP ana karışımı mikrolitre 200 mikrolitre PCR tüp içine.Daha sonra, toplam hacmi 25,0 mikrolitreye çıkarmak için iki mikrolitre numune ekleyin. Negatif kontrol için moleküler sınıf su kullanın ve pozitif bir kontrol içerdiğinden emin olun. İsteğe bağlı olarak, teknoloji protokolünde belirtildiği gibi, dang virüsü gibi ilgili bir arbovirüs bir özgüllük kontrol reaksiyonu içerir.Isı bloğu, su banyosu veya termocycler kullanarak numuneleri 61 derecede 30 dakika ısıtın. Bundan sonra, polimeraz devre dışı bırakmak için 10 dakika boyunca 80 derece santigrat ısı artırın. RT-LAMP çözümlemesi ayrı bir kapalı alanda gerçekleştirin.Floresan nükleik asit boyasını TAE tamponunda 1'den 10'a seyreltin. RT-LAMP reaksiyonunun 12 micorlitresine floresan nükleik asit boya çözeltisinin iki mikorlitresini ekleyin. Rt-LAMP reaksiyonlarını bir renk değişikliğinin varlığını arayarak görsel olarak değerlendirin.İsteğe bağlı olarak beyaz bir arka plan üzerinde RT-LAMP reaksiyonlarının fotoğraflarını çekmek için bir kamera kullanın. Daha sonra, floresan rt-LAMP ürünlerinin varlığını doğrulamak için 302 nanometre UV ışığı altında örnekleri yerleştirin. Sonucun fotoğrafını çekmek için kamera kullanın.Elektroforez yapmaya başlamak için 1x TAE tamponuna %2 agarose jel dökün ve görselleştirme için nükleik asit lekesi dökün. Moleküler ağırlıkları karşılaştırmak için ilk şeritte bir DNA merdiveni beş mikrolitre ekleyin. Her RT-LAMP reaksiyonu için 13 mikrolitre RT-LAMP reaksiyon karışımını iki mikrolitre DNA yükleme boyasıyla karıştırın.Bu 15 mikrolitre karışımı yükleyin. Jeli 90 voltta 90 dakika veya bantlar ayrılana kadar çalıştırın. 302 nanometre UV ışıklı bir görüntü.Bittiğinde, RT-LAMP reaksiyonlarını çift mühürlü torbalara atın. Bu çalışmada RT-LAMP reaksiyonlarını analiz etmek için üç farklı yöntem kullanılmıştır. Floresan nükleik asit boyası kullanırken pozitif reaksiyonlar sarı-yeşil renkte olurken, negatif reaksiyonlar turuncu görünür.Bu boya aynı zamanda numuneler UV ışığı yla heyecanlandığında floresan sinyalle sonuçlanır. Son olarak, RT-LAMP reaksiyonları bir agarose jel üzerinde çalıştırılabilir. Pozitif RT-LAMP reaksiyonları bantlama deseni olurken, negatif reaksiyonların DNA bandı olmayacaktır.Bu yöntemler ZIKV RT-LAMP reaksiyonunun özgüllüğünü göstermek için kullanılır. Sadece ZIKV moleküler kontrolünde rt-LAMP reaksiyonu pozitif. Ayrıca ZIKV enfeksiyonu olduğu bilinen bir hastanın hem idrarında hem de serumunda ZIKV saptanırken, ZIKV enfeksiyonu olmayan asemptomatik kontrol hastalarında görülmez.Örnekler daha sonra insan 18S rRNA için test edilir. Sadece hastalardan alınan örneklerin 18S rRNA pozitif olduğu görülmektedir. Sivrisinek örnekleri benzer şekilde ZIKV veya RT-LAMP kalite kontrol AEDAE için test edilebilir.ZikV ve ZIKV ile enfekte olan sivrisineğin sadece pozitif moleküler kontrolüzikv için pozitif olarak görülmektedir. Ancak tüm sivrisinekler RT-LAMP ile AEDAE için pozitif. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa 30 dakika altında yapılabilir.RT-LAMP reaksiyonlarının yanlış pozitif reaksiyonlara yatkın olduğunu unutmamak önemlidir. Önleme adımları reaksiyonlarda termobile urasil DNA glikozilaz kullanarak, yanal bir iş akışı kullanarak, ayrı bir alanda analiz yapma ve zaman sonrası amplifikasyon tüpleri açık azaltılması içerir. Bu yordamı takiben, örnekte virüsün kaç kopya veya diğer hedefler olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için QPCR gibi başka yöntemler de yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, Zika virüsü ve insan idrar ve serum hedef kontrolleri tespit etmek için RT-LAMP nasıl kullanılacağı nı iyi bir anlayışa sahip olmalıdır, yanı sıra sivrisinek. Zika virüsü ve nükleik asit lekesi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır. Zika virüsü enfeksiyonunun konjenital anomalilerle ilişkisi göz önüne alındığında, hamile, gebe kalmaya çalışan kadınlar veya bu kadınların partnerleri, laboratuvarda Zika virüsüne maruz kalmalarını önemli ölçüde en aza indirmelidir.

reverse-transcription-loop-mediated-isothermal-amplification-rt-lamp

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu video, gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak viral enfeksiyonu tespit etmek için nicel bir yöntemi göstermektedir. Ters transkripsiyon adımı, RNA'yı cDNA'ya dönüştürür ve bu daha sonra PCR döngüleri yoluyla amplifiye edilir. Numunede viral RNA'nın varlığı, PCR'den elde edilen DNA'nın amplifikasyon ve ayrışma eğrileri analiz edilerek doğrulanır.

Viral enfeksiyonları teşhis etmek için gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Virüs iletim kaynaklı sivrisinek verimli kontrol ilgili sivrisinekler vektör potansiyelini bilgisine özel ilgi içindir. Biz zorla salya vektör yetkinlik Aedes albopictus ve üç farklı Culex takson Zika virüs iletimi için analiz etmek için bir yöntem olarak tanımlamak.

Salya vektör yetkinlik sivrisinek analiz etmek için bir yöntem olarak zorla

Biz insan serumu, birincil insan hücreleri ve enfeksiyon miktar nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu tarafından kullanarak Zika virüs enfeksiyonu önceden varolan bağışıklık dang virüs karşı etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

Sunulan protokol, Aedes aegypti sivrisinek popülasyonlarının Zika gibi belirli bir virüs için vektör yeterliliğini bir muhafaza ortamında belirleyebilir.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

Bu çalışmada, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini yüksek verimli bir tarama formatında taramak için replikon bazlı ve viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan protokolleri açıklıyoruz.

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Merkezi olmayan testler için topluluğa dağıtılabilecek merkezi olmayan, düşük maliyetli ve yüksek kapasiteli tanılamaya erişim, küresel sağlık krizleriyle mücadelede kritik öneme sahiptir. Bu makale, taşınabilir bir optik okuyucu ile tespit edilebilen viral RNA dizileri için kağıt tabanlı teşhislerin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır.

Kağıt Tabanlı Toehold Anahtarı Tanılamanın Geliştirilmesi ve Hasta Doğrulaması için Tasarımdan Uygulamaya Çalışma

Burada, nispeten kısa zaman dilimleri içinde ağaç ikincil kök dokusunda gen ve promotör yapılarının orta ila yüksek verimli fonksiyonel karakterizasyonunu kolaylaştıran bir protokol sunuyoruz. Verimlidir, kullanımı kolaydır ve çeşitli ağaç türlerine yaygın olarak uygulanabilir.

Ahşap Formasyonu ve İkincil Kök Gelişimi ile ilgilendim Genler ve Promoters incelenmesi için Kaynaklı Somatik Sektör Analizi (ISSA) Kullanımı

Adacık β hücre ölümü, tip 1 diyabet gelişiminden önce gelir ve bu sürecin tespit edilmesi, erken terapötik müdahaleye izin verebilir. Burada, β hücre ölümünün bir biyobelirteci olarak insan serumundaki diferansiyel olarak metillenmiş INS DNA türlerinin nasıl ölçüleceğine dair ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz.

Farklı Olarak metile ölçümü<em&gt; INS</em&gt; Bir Biyomarker Islet β Hücre Ölümü İnsan serum Örnekleri DNA Türler

Öğrenin, RT-LAMP yöntemiyle idrar, serum ve sivrisinek örneklerinde Zika virüsünü hızlı ve maliyet etkin şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu teknik RNA izolasyonu gerektirmeden yaklaşık 30 dakikada sonuç verir.

İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters (Video) | JoVE Journal

İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Daha fazla video keşfet