Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil
12 Şubat 2019
Burada, biyolojik ve biyomedikal çalışmalarda 3D akciğer doku kültürleri modeli insan akciğer hastalıkları için oluşturmak için uygun özel dolu insan hassas kesim akciğer dilimleri rezeke hasta dokusundan hazırlanması için bir iletişim kuralı mevcut.
Bu yöntem, canlı insan dokusunun doğal 3Boyutlu yapısında ve bileşiminde, temel laboratuvar bulgularının potansiyel tedavilere çevrilmesine olanak sağlar. Bu teknik özellikle cerrahi olarak rezeke veya bireysel ölen hasta akciğer dokusu örneklerinin görselleştirilmesi için insan akciğer dokusu ekstrektidoku kültürleri nesil sağlar. Hastalıksız akciğer dokusu, yüksek spatiotemporal çözünürlükte erken patomekanizmaların analizini sağlayan akciğer hastalıkları ex vivo modellenmesi nde 3D doku kültürleri olarak kullanılabilir.
Rezeke akciğer örneğini steril 15 santimetrelik kültür çanağı ve steril metal tepsiye 15 mililitrelik bir tarım ortamına yerleştirerek başlayın ve 30 mililitrelik şırıngayı 42 derece düşük erime noktası agarose ile doldurun. Obturator'u periferik venöz kateterden çıkarın ve kateteri 30 mililitreşşile takın. Doku bozulmamış bir bölümünde ventilat doku da 0,5 ila 3 milimetre çapında bronş tanımlayın ve yavaşça bronş içine mümkün olduğunca kanula takın.
Kanula etrafında bronşiyol duvarı sıkıştırmak için forceps kullanın, ideal aynı anda herhangi bir komşu pulmoner arter kenetleme, kanula etrafında bronş mühür ve diğer ek hava yollarını tıkamak için cerrahi bir kelepçe kullanmak, agarose sızıntısını önlemek için. Daha sonra, kültür çanak akciğer dokusunu kaldırmak için forseps kullanın, ve el ile kanula yoluyla agarose teslim etmek için şırınga kullanın, saniyede 0.3 mililitre daha hızlı. Akciğer dokusu tamamen doku şişirme olmadan doldurulduğunda, hemen kanula kaldırmak ve bronş kelepçe.
Agarose katılaşmasını kolaylaştırmak için 4 derece lik kültür ortamına dokuyu 30 dakika batırın ve ek bronşiyol açıklıkları için agarose dolum işlemini tekrarlayın. Daha sonra, agarose dolu akciğer dokusu bölümlerini dilimleyene kadar dört derece lik bir ortamda saklayın. Hassas kesilmiş akciğer dilimleme için, akciğer dokusu içinde katı agarose dolu bölgeleri belirlemek, yavaşça hücre kültür çanak altına karşı cımbız ile basıldığında çökmez.
Bir tarafı hala plevra ile kaplı katı dolu bölgenin 1 ila 1,5 santimetreküplük blok excise ve vibratom tutucu için her doku bloğunun çoğul tarafı eklemek için siyanoakrilat tutkal kullanın. Dilim uzun doku bloğu boyunca, doku sadece 2-3 milometers dilimlenmemiş kalana kadar. Her 500 mikrometre lik kesiti, elde edildikleri gibi, ekim ortamı içeren on iki kuyuluk bir plakanın bir kuyuya aktarmak için çereksiler kullanmak.
Tüm doku kesitli olduğunda, her kuyudan alınan örnekleri tek tek on santimetrelik kültür yemeklerine aktarın ve dört milimetrelik biyopsi zımbalayıcıyı ortogonal olarak hassas kesilmiş akciğer diliminin üst yüzeyine yerleştirin. Daha sonra, saat yönünde ve saat yönünün tersine dönmelerde zımba hareket, akciğer örneğindoku yumrukları elde. Her yumruğu taze hücre kültürü ortamına yerleştirerek 96 kuyuluk tabakta ayrı ayrı kuyular elde edilir.
Tüm doku yumrukları elde edildiğinde, beş güne kadar hücre kültürü kuluçka makinesinde plaka yerleştirin. İnsan 3-B akciğer dokusu kültürlerinde İmmünfluoresans kullanılarak hücre çekirdeğinde fibronektin immünetiketleme korunmuş alveoler yapı ex vivo görüntüleme sağlar. İnsan hassas kesilmiş akciğer dilimi punches tedavisi 48 saat boyunca bir profibrotik sitokin kokteyl ibret ile insan akciğer 3-D doku kültürlerinde fibrozis benzeri değişiklikler sonuçları, fibrozis ilgili ekstrasellüler matris bileşenlerinin önemli indüksiyon dahil, kollajen Tip Bir, ve fibronektin genleri.
Ayrıca, mezenkimal marker vimentin protein düzeyleri kadar 3-D akciğer dokusu kültürü yumruklar tedavisinden sonra dört hastadan üç düzenlenir. Bu prosedürü takiben, kantitatif gerçek zamanlı PCR ile RNA analizi veya batı blotting protein analizi gibi diğer yöntemler, doku içinde sırasıyla gen ve protein ekspresyonunu değerlendirmek için yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra deneysel pulmonoloji alanında araştırmaların, akciğer biyolojisinin eksektir ve insan doku örneklerinde toksikolojik ve farmakolojik çalışmalar yapmanın önünü açmıştır.
Canlı insan dokusunun potansiyel olarak enfektif olduğunu ve kişisel koruyucu ekipman ve uygun doku depolama, taşıma ve atık işleme gibi ihtiyati önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın
Genel Bakış
Bu makale, rezeke edilmiş hasta dokusundan agaroz dolgulu insan hassas kesim akciğer dilimleri hazırlamak için bir protokol sunmaktadır. Bu dilimler, biyolojik ve biyomedikal çalışmalarda insan akciğer hastalıklarını modellemek amacıyla 3B akciğer doku kültürleri oluşturmak için uygundur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyomedikal araştırma
- Akciğer hastalığı modellemesi
- 3B doku kültürü teknikleri
Arka Plan
- İnsan akciğer dokusu, hastalıkların doğal bir 3D yapıda incelenmesi için kullanılabilir.
- Bu yöntem, tekil hasta akciğer örneklerinin görselleştirilmesine olanak tanır.
- Yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle erken patomekanizmaların analiz edilmesini sağlar.
- Canlı insan dokusunun enfeksiyöz doğası nedeniyle önleyici tedbirlerin alınması gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- 3B akciğer doku kültürleri oluşturmak için bir protokol geliştirmek.
- Pulmoner hastalıkların ex vivo çalışmalarını kolaylaştırmak.
- İnsan akciğer dokusundaki gen ve protein ekspresyonunun analiz edilmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Düşük erime noktalı agaroz kullanarak akciğer doku örneklerinin hazırlanması.
- Agarozla doldurulmuş akciğer kesitlerinin hassas şekilde kesilmesi.
- Doku yapısını görselleştirmek için immünlekeleme teknikleri.
- PCR ve western blotting kullanarak gen ve protein ekspresyonunun analizi.
Temel Sonuçlar
- Sitokin tedavisi sonrası akciğer doku kültürlerinde fibrozis benzeri değişikliklerin indüklenmesi.
- Tip Bir kolajen ve fibronektin genlerinin yukarı regülasyonu.
- Tedavi edilen örneklerde mezenkimal markör vimentin protein seviyelerinin artışı.
- Deneysel pulmonoloji ve farmakoloji alanlarında daha ileri araştırmalar için potansiyel.
Sonuçlar
- Bu teknik, akciğer biyolojisine dair anlayışı geliştirmektedir.
- Toksikolojik ve farmakolojik çalışmalar için bir platform sağlamaktadır.
- Gelecekteki araştırmalar, daha iyi hastalık modellemesi için bu yöntem üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Hassas kesim akciğer dilimlerinden türetilen insan 3D akciğer doku kültürleri, doğal insan doku mimarisinde hastalık mekanizmalarını ve ilaç yanıtlarını incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir ex vivo model sunar. Bu yaklaşım, bireysel hastalardan alınan hastalıklı veya peritumoral akciğer örneklerinde bileşik etkilerinin doğrudan değerlendirilmesine olanak tanıyarak hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Model; hücresel çeşitliliği, hücre dışı matris bileşimini ve translasyonel uygunluk için kritik olan biyomekanik özellikleri koruyarak preklinik değerlendirmedeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: 3B yapısı ve hücre tipi çeşitliliği korunmuş, sağlam insan akciğer dokusunda terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Tip I kolajen ve fibronektin gibi fibrozis ile ilişkili biyobelirteçlerdeki ilaç kaynaklı değişiklikleri ölçerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilgili insan dokusundaki erken patomekanizmaların spasyotemporal analizi yoluyla yolakların açıklığa kavuşturulmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Çok kuyucuklu plak tabanlı bileşik taramaları için uygun, standardize edilmiş ve tekrarlanabilir doku punchları oluşturur.
- Operasyonel Değer: Doz-yanıt ve zaman seyri analizleri için immünofloresan, qPCR ve western blotting yoluyla kantitatif okumalar sağlar.
- Bilimsel Değer: Biyopsi punchlama yöntemiyle sınırlı hasta örneklerinden elde edilen doku verimini artırarak assay ölçeklenebilirliğini ve replikasyon kapasitesini geliştirir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hassas kesitli akciğer dilimlerinde sitokinle indüklenen fibroz benzeri değişiklikleri kullanarak, insan spesifik fibrotik süreçleri hücresel alt seviyelerde modeller.
- Operasyonel Değer: In vivo çalışmalar öncesinde, insan dokusunda hedef etkileşimini ve etki mekanizmasını değerlendirmek için hastalıkla ilgili bir sistem sağlar.
- Bilimsel Değer: Moleküler okumaların doku seviyesindeki fonksiyonel sonuçlarla korelasyonuna izin vererek translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, erken hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, insan doku yanıtlarına dayalı iteratif iyileştirmelere olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Bozulmamış insan akciğer eksplantlarında alveoler yapının ve hücresel yanıtların görselleştirilmesine olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: 96 kuyucuklu formatlarda bileşik kütüphanesi taraması için tutarlı boyut ve canlılığa sahip, analize hazır doku örnekleri sağlar.
- Analitikler: Tedavi koşullarını karşılaştırmak için gen ekspresyonu (qPCR), protein seviyeleri (western blot) ve yapısal görüntüleme (immünofloresan) dahil olmak üzere çoklu okumalara imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: İnsan doku karmaşıklığını koruyarak ve hastaya özel tabakalı yanıt analizini mümkün kılarak keşif ve preklinik çalışmalar arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla projeye ve terapötik alana uygulanabilen, akciğer hastalığı modellemesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İnsan akciğer dokusunun doğrudan kullanımıyla türler arası translasyon boşluklarını azaltarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Agaroz gömme ve hassas dilimleme yoluyla doku hazırlama sürecini standartlaştırarak farklı kullanıcılar ve merkezler arasındaki tekrarlanabilirliği iyileştirir.
- Stratejik Değer: İnsan dokusuna dayalı erken etkinlik ve toksisite sinyalleri sağlayarak devam/durdur kararlarına veri sağlar.
- Portföy Etkisi: Hastalıklı veya peritümöral insan akciğer örneklerindeki mekanistik etkilere dayanarak bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- İnsan doku işleme, steril teknik ve vibratom tabanlı kesitleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Cerrahi olarak rezeke edilmiş akciğer dokusuna ve yapısal koruma için düşük erime noktalı agaroza erişime bağlıdır.
- Canlı insan dokusunun enfeksiyöz potansiyeli nedeniyle standart kültür koşulları ve kontaminasyon kontrolleri gereklidir.
- Tekrarlar arasında örnek tekdüzeliğini sağlamak için biyopsi punch boyutunun ve rotasyon tekniğinin optimizasyonunu içerir.
- Doku canlılık penceresi ile sınırlıdır; rezeksiyon sonrası zamanında işlem yapılması ve kültürün başlatılması gerekir.
