Name: Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Öğrenin yetişkin fare kalbinden kardiyak kök hücre izolasyonu, karakterizasyonu ve farklılaşması için standart protokolü. Bu maliyet etkin yöntem kardiyovasküler hastalık ve kalp yetmezliği araştırmalarında yenilikçi tedavilere katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser, parçalar, HL-113281 ve HL116205 Paras Kumar Mishra için Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından desteklenir.

Konut, anestezi ve kurban farelerin Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi onaylı IACUC protokolüne yapıldı.
1. malzeme
<ol><li>Kullanım 10 - için 12-hafta-yaşlı C57BL/6J siyah erkek fare, kurumsal hayvan tesis, CSCs. CSCs yalıtım için şirket içinde muhafaza-ebilmek da gebe olmayan dişi fareler izole edilmesi.</li>
	<li>Cerrahi makas, iyi cerrahi makas, eğri şaftlı forseps ve cerrahi bir bıçak, ısıyla tarafından da dahil olmak üzere tüm gerekli cerrahi aletler, sterilize fare ötenazi önce.</li>
	<li>CSC yalıtım arabellekleri sterilize koşuldaki hazırlamak ve onları buz üzerinde 4 ° C'de depolayın. Polysucrose ve 1.077 g/mL bir yoğunluk için ayarlanmış bir sodyum diatrizoate çözüm bu arabellekleri içerir, kartal'ın orta eksik Dulbecco'nın değiştirilmiş, 1 x Ham'ın dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve kültür-grade 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücre. (Filtre uygulanmış ve sterilize) bir % 1 collagenase II stok çözüm ve HBSS içinde % 0,2 çalışan bir çözüm hazırlamak.</li>
	<li>Biyogüvenlik steril durumda doku kültürü malzeme dolabı, bir 10 mm Petri, 6-şey plaka, bir 24-şey plaka, T-25 ve T-75 kültür şişeler, 15 mL ve 50 mL konik tüpler ve tek kullanımlık serolojik Pipetler ile 40-µm ve 100 gibi tutmak -µm hücre süzgeçler 0,22-µm filtreleri ile.</li>
	<li>10 µL, 200-µL ve 1.000-µL pipet ipuçları otoklav tarafından sterilize.</li>
	<li>Pudrasız nitril eldiven ve % 70 etanol steril bir koşulu deneme boyunca korumak için kullanın.</li>
	<li>% 10 çamaşır suyu bir dezenfektan olarak kullanın.</li>
	<li>Piyasada bulunan CSC bakım orta ve cardiomyocytes farklılaşma orta kültür ve CSCs, farklılaşma için sırasıyla kullanın.</li>
</ol>2. izolasyon yöntemi kardiyak kök hücre
<ol><li>4-5 Yetişkin erkek (veya gebe olmayan kadın) ötenazi CO2 odası kullanarak fare. Her fare silah ayrı diseksiyon karton üzerinde bağlantıları veya yapışkan bantlar ile düzeltmek.</li>
	<li>% 70 etanol dış mikrop kurtulmak ve kalbinde hasat sırasında steril durumu korumak için fareyi sprey. Karın ortasında makasla bir kesi yapmak ve düz bir çizgide kadar toraks karın derisini kesti. Cilt cilt ve saçlar karın bölgesi temizlemek için orta kesim her iki taraftan kaldırın. Makas ve cımbız kullanarak, göğüs kafesi altındaki diyafram kesti.</li>
	<li>Göğüs boşluğuna fare kafesi başlık içinde keserek açın. Kalp maruz ve kanın kalp yanına kaldırmak. Çevresi kalp kalp çevresinde hiç kan kurtulmak için buz gibi PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Cerrahi makas ve cımbız kullanarak kalp incelemek. Buz gibi PBS 10 mL içeren 100-mm Petri kabına kalbinde bir yer.</li>
	<li>Eğri şaftlı forseps kullanarak kalp palpitate ve kalan kan kalbin içindeki kaldırın.</li>
	<li>Bütün kalp CSCs yalıtımı için kullanma.</li>
	<li>Tüm dört ya da beş tüm kalpleri bir 50 mL konik tüp buz gibi HBSS 10 mL içeren aktarın. Tüp buz üzerinde daha fazla işleme kadar tutun.</li>
	<li>İçinde ve dışında bir Biyogüvenlik steril bir ortam oluşturmak için % 70 etanol ile kabine silin. Kalp içeren tüp ve diğer gerekli malzemeler % 70 etanol ile sterilize. Kalp içeren tüp Biyogüvenlik kabine için daha fazla alay yerleştirin.</li>
	<li>Kalplerini buz gibi HBSS 10 mL içeren bir 100-mm Petri kabına aktarın. Kalbini tekrar kalbin içindeki herhangi bir kalıntı kan kaldırmak için palpating yıkayın. HBSS çözüm kan tümüyle kaldırılmasını sağlamak için her yıkama sonra değiştirin.</li>
	<li>Kalpleri bir 100-mm 5-7 mL HBSS çözeltisi içeren kabında iyi cerrahi makas veya cerrahi bir bıçak kullanarak küçük parçalar halinde kes. Forseps ile per: her kalp ve kalp 2 - 4 mm parçalar halinde kesmek için bir çift cerrahi iyi makas veya cerrahi bir bıçak kullanın. Sık sık kan-Alerjik HBSS emin olmak için HBSS çözüm değiştirin. HBSS çözüm kalbimizde kıyma.</li>
	<li>500 x g 5 dk. atma için 4 ° C'de, kıyılmış doku süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet tutun.</li>
	<li>Pelet 5-6 mL % 0,2 collagenase II çözeltisi 50 mL konik tüp içinde resuspend. Collagenase çözüm hacmi neredeyse 1.5 - için 2 - kat Pelet hacmi olmalıdır. Not: doku, ben ve 2.5 U/mL dispase çözüm % 0,2 collagenase II değiştirebilirsiniz % 0,2 collagenase sindirim için. Dispase çözüm collagenase için neredeyse eşit bir hacmi kullanın ben çözüm.</li>
	<li>Tüp Tantanacı veya 45-60 dk 37 ° C'de bir shaker-75 x g de televizyonda sallanan Pelet % 0,2 collagenase II çözüm ile iyice karıştırın Tüp el ile lizis geliştirmek için her 20-30 dakika sonra şiddetle çalkalanır.</li>
	<li>5 mL serolojik pipet ve 1 mL pipet ucu doku yumru tek hücre süspansiyon ayırmak için lysed doku karışımının triturate. Not: CSCs en fazla iyileşme elde etmek için en az 5 min için lizis karışımı triturate. Doku topaklar nispeten büyük iseniz, 1 mL pipet ucu ucu makas veya cerrahi bir bıçak ile kesmek ve toz için kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Doku enzimatik lizis ticari olarak temin CSC bakım orta ekleyerek durdurmak. Neredeyse 2-3 x kadar bakım orta adım 2,14 lysed doku hacmi olarak ekleyin.</li>
	<li>Sindirilir hücre süspansiyon herhangi bir sindirilmemiş doku parçaları kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.</li>
	<li>40-µm hücre süzgeç kullanarak 2,16 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Yoğunluk gradient Santrifüjü ile hücreleri ayırın. Hücreleri ayırma için hafifçe polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm üzerinde filtrate eşit bir hacmi yerleşimi. Örneğin, ilk olarak, bir 50 mL konik tüp içinde 20 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate çözeltisi ekleyin ve sonra filtrate 20 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm 2.17 adımından ekleyin. Not: Prewarm polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm daha önce 37 ° C'de hücreler ile kullanın. Filtrate çok dikkatli ve yavaş adım 2.17 polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm üzerine eklemek herhangi bir iki çözümleri karıştırma önlemek için. Bu çok önemli bir adım olarak kabul edilir.</li>
	<li>Her iki çözüm de 500 x g bir salıncak kova santrifüj kullanarak oda sıcaklığında 20 dakika için de içeren tüp santrifüj kapasitesi. Santrifüj iki çözüm karıştırma önlemek için daha düşük bir yavaşlama hızlanma ve hız ve uygun CSCs ayrılması için ayarlayın. CSC izolasyon önemli bir adımdır. Çok yavaş santrifüj içinde karışıklık olmadan degrade karışımı içeren tüpü yerleştirmek ve Santrifüjü için ayarlayın.</li>
	<li>Buffy kat ilave bir 15 mL steril tüpe 1 mL pipet ya da plastik bir Pasteur pipet kullanarak üst katmanı çözümden birlikte dışarı çıkar. Buffy bu katman CSCs içerir. Not: CSCs için toksik olduğu için polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm katmanı almaya buffy kat pipetting sırasında ilave tedbirleri almak.</li>
	<li>CSC bakım orta eşit bir birim hücre süspansiyon 2.20 adımından ve düzgün kalan polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm, etkisiz hale getirmek için varsa karıştırın.</li>
	<li>500 x g 4 ° C'de 5 min için de yukarıdaki hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Pelet 7-10 mL eksik DMEM orta resuspend ve 500 x g 4 ° C'de herhangi bir kalıntı polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm kurtulmak için 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Arıtılmış CSCs içerir Pelet toplamak.</li>
	<li>Pelet CSC bakım orta 1 mL resuspend, CSC saymak ve Pelet kültür için kullanın. CSC saymak için Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanın. Dört erkek fareler kalpleri ile ~1.8 milyon CSCs verimidir.</li>
	<li>Tohum bir 6-şey kültür plaka CSCs bir %0.02 jelatin çözüm içeren % 0.5 fibronektin kaplı. Tam bakım Orta 2 mL tohum için kullanın. Kültür plaka bir kuluçka %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Kültür CSCs orta ile tam CSC bakım orta üçüncü güne kadar her gün değiştirin. Bundan sonra diğer günlerde orta değiştirin.</li>
	<li>CSCs büyüme mikroskop altında gözlemleyerek belirlemek.</li>
</ol>3. kültür bakım ve kardiyak kök hücre geçirilmesi
<ol><li>Kültür bir piyasada bulunan bakım orta izole CSCs. Kültür orta diğer günlerde taze bakım orta ile değiştirin. CSC kültür confluency ulaştığında CSCs jelatin ve fibronektin, ile kaplı bir yeni plaka adım 2.26 belirtildiği gibi aktarın. Kültürlü CSCs enzimatik hücre ayrılma arabellek ayırmak. Hücre ayrılma standart protokol kültür plaka izleyin. Bu aşamada, CSCs geçiş 0 (P0) sahne olarak kabul edilir.</li>
	<li>Kültür P0 CSCs içinde yeni bir jelatin ve fibronektin kaplı plaka tam CSC bakım orta % 5 CO2 kuluçka, 37 ° C'de bunları konfluent izin ve adım geçiş 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs sıvı azot almak veya deney için kullanmak için 3.1 izleyin ments.</li>
	<li>6-şey plaka veya onun ilk aşamada CSC kültürü korumak için T-25 hücrelerde 1 milyon tohum 0.5 milyon hücreler.</li>
	<li>Geçit onlar % 85-%90 birleşmesi olunca CSCs. CSCs bakım orta dört ila altı hafta kadar kültürlü. Not: daha düşük bir tohumlama yoğunluğu CSCs onların morfolojisi düz ve uzun değiştirmek için CSCs nispeten yüksek (% 40-%50) ilk tohumlama yoğunluğu tutun.</li>
</ol>4. kardiyak kök hücrelerin karakterizasyonu
<ol><li>Kültürlü CSCs karakterize etmek için onları fajının kontrast veya alan parlak mikroskop altında gözlemlemek. CSC içeren plaka floresan mikroskop amaçta yerleştirin. Hücreleri odaklanmak için büyütme oranını oldukça düşük (10 X) ayarlayın. Faz kontrast diyafram hücreleri gözlemlemek için kullanın. 20 X büyütme objektif lensi değiştirerek artırmak ve CSCs. artış hedefi 40 X görüntü ve CSCs görüntü. İki gün, CSCs neredeyse yuvarlak şekil, ama zamanla ve yedi gün içinde hücre artar boyutu görünür, CSCs şekli (Şekil 1A - 1 C) neredeyse silindirik görünür.</li>
	<li>CSCs immunostaining işaretli pluripotency/stemness (OCT4, SOX2 veya MicroRNAs) yayılması (Ki-67) (Şekil 2A - 2B) ve kardiyak kökenli/progenitor hücreler (Sca-1, NKX2-5 veya GATA4) gerçekleştirmek (Şekil 3A - 3 C).<ol>
<li>CSCs immunostaining için bir 24-şey kültür plaka 10.000 CSCs tohum.</li>
		<li>(18-24 h) sonra ertesi gün CSCs 300 µL % 4 paraformaldehyde 10 dk için fix.</li>
		<li>Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.</li>
		<li>CSCs 0,2 Triton X-100 10 dakikadır PBS içinde seyreltilmiş % 300 µL ile permeabilize.</li>
		<li>Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.</li>
		<li>CSCs PBST içinde seyreltilmiş % 1 BSA 300 µL ile engelleme gerçekleştirmek (PBS + %0,1 ara 20) veya 1 h için PBST içinde seyreltilmiş % 10 normal tavuk serum 300 µL.</li>
		<li>Birincil antikor çözüm gecede 4 ° C'de engelleme seyreltilmiş 200 µL CSCs kuluçkaya Birincil antikor antikor veya standardizasyon göre veri sayfası tarafından tavsiye edilen şekilde sulandırmak.</li>
		<li>Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.</li>
		<li>İkincil antikor çözüm engelleme seyreltilmiş 200 µL CSCs kuluçkaya (bkz. Adım 4.2.6) Oda sıcaklığında 1 h için. İkincil antikor antikor veya standardizasyon göre veri sayfası tarafından tavsiye edilen şekilde sulandırmak.</li>
		<li>Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.</li>
		<li>CSCs DAPI 200 µL ile counterstain (1 µg/mL) seyreltilmiş PBS için 5 dak.</li>
		<li>CSCs 1 yıkama x 500 µL buz gibi PBS ile. Daha sonra buz gibi PBS 300 µL her kuyuya ekleyin.</li>
		<li>Bir floresan mikroskop kullanarak görüntüleme gerçekleştirmek. Imaging, plaka üzerinde doğrudan güneş ışığı önlemek gibi floresan yönergeleri izleyin. Kültür plaka mikroskop altında tutun. Hücreleri farklı büyüklüklerde, odaklan. Faz kontrast ve/veya farklı uyarma filtreleri altında hücreler gözlemlemek ve görüntüleri kaydetmek.</li>
		<li>Plaka karanlıkta 4 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Cardiomyocyte içine kalp kök hücre farklılaşma
<ol><li>CSCs farklılaşma için bir 6-şey plaka 2 mL prewarm (37 ° C) ticari olarak temin CSC bakım orta ile 500.000 CSCs tohum.</li>
	<li>CO2 kuluçka 37 ° C'de CSCs içeren plaka kuluçkaya CSCs kadar alt konfluent büyüme çoğalırlar ve takmak izin verir. Orta sarı dönüşürse, kültür orta ile taze bakım orta yerine.</li>
	<li>% 85-%90 confluency prewarm (37 ° C) cardiomyocytes 2 mL ile bakım orta yerine farklılaşma orta. Plaka CO2 kuluçka 37 ° C'de 2-3 haftaya kadar kuluçkaya.</li>
	<li>Her 2-3 ö gözlemlemek CSCs morfoloji iyi kültür koşulları sağlamak için değiştirmek her zaman orta sırasında mikroskopla farklılaşma orta değiştirin.</li>
	<li>CSC kültür farklılaşma orta 12 d sonra görüntü CSCs standart bir immunostaining takip ayırt etme belirteçleri için protokol (adımlara 4.2.1 - 4.2.14 bakın). Cardiomyocytes işaretleri (Şekil 4A - 4B) bir ifade için floresan görüntüleri kaydetmek.</li>
</ol>

<ol><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146(2017).</li>
<li>Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Stem+Cell+Therapy+and+Heart+Failure%2C+2000+to+2016%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review.</a> The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).</li>
<li>Emmert, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+cardiopoietic+stem+cells+in+the+treatment+of+post-infarction+left-ventricular+dysfunction+-+From+cardioprotection+to+functional+repair+in+a+translational+pig+infarction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model.</a> Biomaterials. 122, 48-62 (2017).</li>
<li>Silvestre, J. S., Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Evolution+of+the+Stem+Cell+Theory+for+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure.</a> EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).</li>
<li>Terzic, A., Behfar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+heart+failure%3A+Ensuring+regenerative+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).</li>
<li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+therapy+of+heart+failure+in+genetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy.</a> Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).</li>
<li>Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow-derived+side+population+cells+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).</li>
<li>Vrtovec, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracoronary+CD34%2B+stem+cell+transplantation+in+nonischemic+dilated+cardiomyopathy+patients%3A+5-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up.</a> Circulation Research. 112, 165-173 (2013).</li>
<li>Hare, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+allogeneic+vs+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+delivered+by+transendocardial+injection+in+patients+with+ischemic+cardiomyopathy%3A+the+POSEIDON+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial.</a> The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).</li>
<li>Guijarro, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167527316302285">Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial.</a> International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).</li>
<li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+Administration+of+Allogeneic+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Improves+Myocardial+Perfusion+But+Not+Left+Ventricle+Function%2C+in+a+Translational+Model+of+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 6, (2017).</li>
<li>Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+stem+cells+as+a+therapeutic+tool+for+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease.</a> World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).</li>
<li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+Wharton%27s+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+in+acute+myocardial+infarction%3A+double-blind%2C+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial.</a> BMC Medicine. 13, 162(2015).</li>
<li>Simpson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strong+regenerative+ability+of+cardiac+stem+cells+derived+from+neonatal+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts.</a> Circulation. , S46-S53 (2012).</li>
<li>Kazakov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-kit%28%2B%29+resident+cardiac+stem+cells+improve+left+ventricular+fibrosis+in+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload.</a> Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).</li>
<li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+of+combined+gene+and+cell+therapy+in+ischemic+heart+disease%3A+role+of+exosomal+microRNA+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer.</a> Circulation. 130, S60-S69 (2014).</li>
<li>Sahoo, S., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cardiac+repair+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114, 333-344 (2014).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+Cardiac+Stem+Cells+With+Exosomes+Derived+From+Mesenchymal+Stem+Cells+Enhances+Myocardial+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair.</a> Journal of the American Heart Association. 5, (2016).</li>
<li>Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+critical+agents+of+cardiac+regeneration+triggered+by+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy.</a> Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).</li>
<li>Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+exosomal+miRNAs+in+cardiovascular+protection+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair.</a> Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).</li>
<li>Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+cell+therapy%3A+lessons+from+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).</li>
<li>Trounson, A., McDonald, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapies+in+Clinical+Trials%3A+Progress+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges.</a> Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).</li>
<li>Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+multipotent+sub-population+of+Sca-1%28%2B%29+cardiac+progenitor+cells+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration.</a> PLoS One. 6, e25265(2011).</li>
<li>Cambria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+cardiac+stem+cell+therapy%3A+advancing+from+first-generation+to+next-generation+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 17(2017).</li>
<li>Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+for+the+Heart%3A+Blind+Alley+or+Magic+Bullet%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).</li>
<li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).</li>
<li>Oh, H., Ito, H., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+success+in+heart+failure%3A+Cardiac+cell+therapies+in+patients+with+heart+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases.</a> Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit%2B+cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).</li>
<li>Rutering, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Method+for+Isolation+of+Neonatal+Rat+Cardiomyocytes+with+Increased+Yield+of+C-Kit%2B+Cardiac+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).</li>
<li>Saravanakumar, M., Devaraj, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+homing+pattern+of+c-kit%2B+Sca-1%2B+CXCR4%2B+resident+cardiac+stem+cells+in+neonatal%2C+postnatal%2C+and+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart.</a> Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).</li>
<li>Monsanto, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+Isolation+of+3+Distinct+Cardiac+Stem+Cell+Populations+From+a+Single+Human+Heart+Biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy.</a> Circulation Research. 121, 113-124 (2017).</li>
<li>Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+cardiomyocytes+and+progenitor+cells+from+neonatal+mouse+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles.</a> European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).</li>
<li>Dergilev, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cardiac+stem+cell+sheets+detached+by+Versene+solution+and+from+thermoresponsive+dishes+reveals+similar+properties+of+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs.</a> Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).</li>
<li>Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyogenic+potential+of+C-kit%28%2B%29-expressing+cells+derived+from+neonatal+and+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts.</a> Circulation. 121, 1992-2000 (1992).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+Sca-1%2B%2FCD31-+progenitor+cell+lineage+derived+from+mouse+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue.</a> BMC Biotechnology. 14, 75(2014).</li>
<li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes%3A+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu CSC yalıtım protokol kritik adımları aşağıdaki gibidir. 1) steril bir koşul fareler kalplerin çıkarılması için muhafaza edilmelidir. Kalp ayıklama sırasında herhangi bir kirlenme CSCs. 2 kalitesini bozabilir) kan tamamen birkaç yıkar bütün kalp ve kalp tarafından HBSS çözüm taşlarla yapılır kalp kıyma önce kaldırılmalıdır. 3) kalp parçaları tamamen içine bir tek hücre süspansiyon collagenase çözüm ile lysed gerekir. 4) polysucrose ve sodyum diatrizoate degrade çözüm hücreleri ayrılması için prewarmed gerekir. 5) orta ...

İskemik kalp hastalığı, akut miyokard infarktüsü (mı), dahil olmak üzere ölüm1dünya çapında önemli bir nedenidir. Ölü Miyokardiyum Yenileyici için kök hücre tedavisi bir mı kalp2,3,4,5kardiyak fonksiyon geliştirmek için önemli bir yaklaşım kalır. Kök hücrelerin farklı türleri ölü Miyokardiyum doldurmak için ve bir MI kalp kardiyak fonksiyon geliştirmek için kullanılmıştır. Embriyonik kök hücre6 ve yetişkin kök hücre genel olarak sınıflandırılabilir. Yetişkin kök hücre, kök hücre türleri, mononükleer hücreler kemik iliği elde edilen7,8, kemik iliği9dan,10, yağ dokusu elde edilen mezenkimal kök hücre gibi kullanılmıştır 11,12ve göbek kordonu13ve CSCs14,15. Kök hücre den endokrin ve/veya parakrin eylemler16,17,18,19,20kardiyak rejenerasyon yükseltebilirsiniz. Ancak, kök hücre tedavisi büyük bir sınırlama çoğalırlar ve/veya doğru belirli kardiyak lineage21,22ayırt kök hücreleri yeterli sayıda almaktır. Otolog ve allojenik kök hücre nakli kök hücre tedavisi9önemli bir sorundur. CSCs onlar yürekten türetilmiştir ve onlar daha kolay kalp soy kalp kök hücreler farklı çünkü kardiyak rejenerasyon için daha iyi bir yaklaşım olabilir. Böylece, teratoma riskini azaltır. Buna ek olarak, CSCs, endokrin ve parakrin etkileri exosomes ve CSCs türetilmiş miRNAs gibi daha kök hücreler diğer tür daha etkili olabilir. Böylece, CSCs kardiyak rejenerasyon23,24için daha iyi bir seçenek kalır.
CSCs MI kalp kalp kökenlerine nedeniyle kardiyak rejenerasyon için daha iyi bir aday olmakla birlikte, önemli bir sınırlama CSCs ile daha az verimli yalıtım yöntemini eksikliği nedeniyle verimidir. Başka bir sınırlama CSCs Engelli farklılaşma cardiomyocytes lineage2,25,26,27doğru olabilir. Bu sınırlamaları aşmak için CSC yalıtım, karakterizasyonu ve farklılaşma kardiyak lineage doğru için verimli bir iletişim kuralı geliştirmek önemlidir. CSCs yok tek kabul edilebilir işaretçisi ve bir belirli hücre yüzeyine marker tabanlı yalıtım CSCs, daha az CSCs verim. Burada, düşük maliyetli ve CSCs artan bir verim içinde sonuç fare kalp CSCs yalıtmak için bir basit degrade Santrifüjü yaklaşım standartlaştırmak. Bu izole CSCs floresans aktif hücre kısa devre tarafından belirli hücre yüzeyine işaretler için seçilebilir. CSCs yalıtım ek olarak, biz CSC kültür, karakterizasyonu ve farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage için bir protokol sağladı. Böylece, biz izole, karakterize, kültür ve CSCs yetişkin fare kalpler (Şekil 5) ayırt etmek için zarif bir yöntem mevcut.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Fareler< / güçlü ></td> <td>Jackson laboratuvarı, ABD</td><td>Stok no. 000664</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Antikorlar: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>OCT4-Abcam</td><td></td> <td>ab18976 (tavşan poliklonal)</td> <td>OCT4-Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözelti</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959 (tavşan poliklonal)</td><td>SOX2-Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözeltide</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892 (tavşan poliklonal)</td><td>Nanog-Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözeltide</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667 (tavşan poliklonal)</td><td>Ki67-Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözelti</td></tr><tr><td>Sca I'de</td><td>Millipore</td><td>AB4336 (tavşan poliklonal)</td> <td>Sca I Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözelti</td></tr><tr><td>içinde NKX2-5</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8697 (keçi poliklonal)</td><td>NKX2-5-Birincil antikor- 1:50 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözelti</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Abcam</td><td>ab84593 (tavşan poliklonal)</td><td>GATA4-Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözelti</td></tr><tr><td>içinde MEF2C</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13268 (keçi poliklonali)</td><td>MEF2C-Birincil antikor- 1:50 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözeltide</td></tr><tr><td>Troponin I</td><td>Millipore</td><td>MAB1691 (fare monoklonal)</td><td>Troponin I-Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözeltide</td></tr><tr><td>Aktinin</td><td>Millipore</td><td>MAB1682 (fare monoklonal)</td><td>Aktin-Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözeltide</td></tr><tr><td>ANP</td><td>Millipore</td><td>AB5490 (fare poliklonal)</td><td>ANP-Birincil antikor- 1:100 seyreltme, İkincil antikor- 1:200 seyreltme, bloke edici çözeltide</td></tr><tr><td>Alex Fluor-488 checken anti-tavşan</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>Referans no. A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 keçi anti-tavşan</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>Referans no. A11012</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 tavşan anti-keçi</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>Referans no. A11078</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-488 checken anti-mouse</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>Referans no. A21200</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 checken anti-keçi</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>Referans no. A21468</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Kültür ortamı: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSC bakım ortamı</td><td>Millipore</td><td>SCM101</td> Not: CSC kültürü için, hücrelerin kardiyomiyosit farklılaşma ortamı Millipore SCM102'yi <td>yıkamak için PBS veya eksik DMEM ortamı kullanıldı</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Hücre İzolasyon tamponu: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>polisuçroz ve sodyum diatrizoat çözeltisi (Histopaque1077)</td> <td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>2018-03</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Dispase solüsyonu</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>LONZA</td><td>S1226</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Hücre Ayrışma Reaktifi</td><td>Termobilimsel</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Diğer reaktifler: </güçlü> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Normal checken serum</td><td>Vektör laboratuvarı</td><td>S3000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI çözeltisi</td><td>Applichem</td><td>A100,0010</td><td>Dapi, çalışma konsantrasyonu-1 ve mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Biorad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Hücre Ayrışma Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS</td><td>Cas No. 900-293-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Sceintific</td><td>Lot No. 160170</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</strong</td><td>>Katalog Numarası</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Doku kültürü malzemeleri:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm petri kabı</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 şişesi</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-75 şişesi</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüp</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 ve mikro; m hücreli boyayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro; m hücreli boyayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & mikro; m filtre</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>BD</td><td>Ref. 309604</td><td></td></tr><tr><td>10 & L, 200 ve mikro; L, 1000 ve mikro; L pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL, 10 mL, 25 mL tek kullanımlık plastik pipet</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj makinesi</td><td>Thermo Scientific</td><td>LEGEND X1R santrifüj</td><td></td></tr><tr><td>EVOS mikroskobu</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayma slaydı</td><td>Biorad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Pippte aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>S1 pipet dolgusu</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>< güçlü > Şirket< / güçlü > <</td> <td>güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Cerrahi Aletler: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cerrahi makas</td><td>İnce Bilimsel Alet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce cerrahi makas</td><td>İnce Bilimsel Araç</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eğri şaft forseps</td><td>İnce Bilimsel Alet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi bıçak</td><td>İnce Bilimsel Alet</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Akut miyokard infarktüsü (mı) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen nedenidir. Rejeneratif tıp ana amacı ölü Miyokardiyum MI sonra doldurmak etmektir. Her ne kadar çeşitli stratejiler Miyokardiyum yeniden oluşturmak için kullanılan, kök hücre tedavisi MI kalp ölü Miyokardiyum doldurmak için büyük bir yaklaşım kalır. Kanıt biriken yetişkin kalp ve kalp rejenerasyon endokrin ve/veya parakrin etkileri ikamet kardiyak kök hücreleri (CSCs) varlığını göstermektedir. Ancak, CSC yalıtım ve karakterizasyonu ve farklılaşma miyokard hücreleri, özellikle cardiomyocytes, doğru bir teknik sorun kalır. Bu da çalışmanın, yalıtım, karakterizasyonu ve CSCs farklılaşma yetişkin fare kalp için basit bir yöntem sağladı. Burada, CSCs nerede kalp % 0,2 collagenase II çözüm tarafından sindirilmiş, yalıtım için bir yoğunluk degrade yöntemi açıklanmaktadır. İzole CSCs ayırdetmek için CSCs/kalp işaretleri Sca-1, NKX2-5 ve GATA4 ve pluripotency/stemness işaretleri OCT4, SOX2 ve MicroRNAs ifadesi değerlendirilir. Biz de onları bir kabında kültür ve nükleer silahların yayılmasına karşı işaret Ki-67 ifade değerlendirirken izole CSCs yayılması potansiyelini belirledi. CSCs farklılaşma potansiyeli değerlendirmek için biz yedi - on - gün kültürlü CSCs seçildi. Biz onları cardiomyocyte farklılaşma orta ile yeni bir tabak transfer. Farklılaşma Orta üç günde değişti iken onlar 12 gün boyunca bir hücre kültür kuluçka makinesine inkübe. Cardiomyocyte özel işaretleri farklılaştırılmış CSCs hızlı: Aktinin ve troponin ı. Böylece, stemness ve kardiyak Marker CSCs bu iletişim kuralı ile izole var ve onlar için yayılma ve farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage bir potansiyele sahip.

Bu da çalışmanın, CSCs 10 - için 12-hafta-yaşlı C57BL/6J erkek fareler kalpler izole. Burada, biz CSC yalıtım ve pluripotency işaretçileri kullanarak karakterizasyonu için basit bir yöntem sundu. Biz de CSC farklılaşma için zarif bir yöntemi ve cardiomyocytes lineage doğru Ayrıştırılan CSCs karakterizasyonu sundu. Biz 2 için 3-gün-kültürlü CSCs (Şekil 1A ve 1B) faz kontrast mikroskop altında bir Milli şekil morfolojisi gözlenen. CSCs morfoloj...

Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Bu makalenin genel amacı, kalp kök hücrelerinin, CSC'lerin Yetişkin Fare Kalbi'nden izolasyon, karakterizasyon ve farklılaşması için protokolü standartlaştırmaktır. Bu yöntem, kardiyovasküler hastalık ve bölgesel tedavi alanında, kardiyak kök hücre tedavisi ve kalp yetmezliği gibi önemli soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, küçük bir süre içinde yüksek yardım ile, maliyet etkin olmasıdır.Protokolde açıklandığı gibi gerekli tüm malzemeleri, aletleri ve izolasyon tamponlarını sterilize edilmiş bir durumda hazırlayarak bu deneye başlayın. Ötenazi li bir farenin karnından deri çıkardıktan sonra, göğüs boşluğu açmak için steril başlık içinde göğüs kafesi kesti. Kalbi açığa çıkarın ve sonra bir mililitreşon şırınga kullanarak kalbin yakınındaki kanı çıkarın.Kalp yakınındaki herhangi bir kan kaldırmak için, buz gibi PBS ile çevredeki alanı yıkayın. Kalbi incelemek için cerrahi makas ve cımbız kullanarak, 10 mililitre buz gibi PBS içeren 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Kalbi palpitate için kavisli sap forseps kullanın, ve kalp içinde kalan kan kaldırmak.10 mililitre buz gibi soğuk Ham'ın Dengeli Tuz Çözeltisi içeren 100 mililitrelik Petri kabına 4-5 izole kalp aktarın. Onları yıkamak ve kalp içinde kalan kan kaldırmak için tekrar kalpleri palpate. Kanın tamamen çıkarılmasını sağlamak için, her yıkamadan sonra HBSS çözeltisini değiştirin.Her kalbi bir çift forceps ile tutun ve her kalbi 100 milimetrelik Petri kabında iki ila dört milimetrelik parçalara kesmek için bir cerrahi bıçak kullanın, beş ila yedi mililitre HBSS içeren. Sık sık tam kan alma sağlamak için çözüm değiştirin. Son olarak, HBSS çözümünde kalpleri kıyma.500 kez G'de 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilen kıyılmış kalpleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin ve sonra süpernatantı atın. Doku sindirmek için pelet beş ila altı mililitre, 0.2% Kollajenaz II çözeltisi ekleyin. 45 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derece, 75 kez G bir shaker üzerinde tüp sallayarak iyice pelet yeniden askıya.Her 20-30 dakikada bir, lysis geliştirmek için elle şiddetle tüp sallayın. Beş mililitre serolojik pipet ve tek hücreli süspansiyon içine doku yumru ayırmak için bir mililitre pipet ucu kullanarak lysed doku karışımı triturate. Dokunun enzimatik lysis durdurmak için, iki ila üç kat daha fazla ticari csc bakım ortamı lysed doku hacmi olarak ekleyin.Sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilen 100 mikrometrelik hücresüzden sindirilmiş hücre süspansiyonu geçirin. Yoğunluk gradyan santrifüj hücreleri ayırmak için, 50 mililitrekonik tüp için 37 derece santigrat, önceden ısıtılmış, poliskopoz ve sodyum diarizoat çözeltisi ekleyin. Daha sonra yavaşça ve yavaşça çözelti üzerinde eşit hacimli filtrat ekleyin, iki çözeltinin herhangi bir karışımını önleyerek.Bu 45 derece ve tüp duvarına doğru tüp tilting tarafından karıştırma olmadan yavaş yavaş poliskroz ve sodyum diatrizoat çözeltisi üzerinde filtrat eklemek için önemlidir. Filtrat üzerine polikroz ve sodyum diarizoat çözeltisi eklemeyin. Tüpü çok yavaş bir salıncak kovasantrisine yerleştirin ve çözeltileri rahatsız etmemeye özen gösteriyor.İki çözeltinin karıştırılmasını önlemek ve kardiyak kök hücrelerin düzgün bir şekilde ayrılmasını önlemek için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj edin. Degrade çözeltisini santrifüjde rahatsızlık olmadan çok dikkatli bir şekilde koymak çok önemlidir. Santrifüjün ivmeve yavaşlamasını bir veya sıfır gibi en düşük hızda koyun.CSC'leri içeren buffy coat'u üst tabakadan 15 mililitrelik sterilize edilmiş bir tüpe ekstra solüsyonla birlikte aktarmak için bir milimetrelik pipet kullanın. Eşit hacimli CSC bakım ortamı ekleyin ve artık polisukroz ve sodyum diarizoat çözeltisini nötralize etmek için düzgün bir şekilde karıştırın. Bu süspansiyonu 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın. CSC'lerin eksik DMEM Solüsyonu ile yıkanması en az iki kez tekrarlayın. Herhangi bir kalıntı polisukroz ve sodyum diarizoat çözeltisi kurtulmak için dört santigrat derece beş dakika için 500 kez G santrifüj.Supernatant çıkardıktan sonra, bir mililitre CSC bakım ortamı saflaştırılmış CSCiçeren pelet resuspend ve sonra hücreleri saymak. Tohum CSCs altı iyi kültür plaka 0.02% 0.5 fibronektin içeren jelatin çözeltisi ile kaplı ve tam bakım ortamı iki mililitre ekleyin. Hücreleri %5 CO2'de 37 derecede büyütün.CSC kültürü biraraya geldiğinde, metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri yeni bir jelatin ve fibronektin kaplı plakaya aktarın. Kültür bu konfluent kadar% 5 CO2 inkübatör 37 santigrat derece tam CSC bakım ortamı P0 CSCs transfer. Daha fazla deney için kullanılabilecek P1 CSC'leri yapmak için hücre transferini yeni bir plakaya tekrarlayın.CSC kültürünü ilk aşamasında korumak için, hücreleri metin protokolünde açıklandığı şekilde daha fazla tohumlayın. Kültürlü hücreleri karakterize etmek için, bir floresan mikroskop amacı plaka içeren CSC yerleştirin. Hücreleri odaklamak için on kat büyütme kullanın.Hücreleri gözlemlemek için faz kontrastlı diyafram açıklığını kullanın ve objektif lensi değiştirerek büyütmeyi 20 katına yükseltin ve csc'leri görüntüleyin. İmmünoboyama yapıldıktan sonra, floresan mikroskobun altına kültür plakasını yerleştirin. Hücreleri farklı büyütmelere odakla ve faz kontrastı ve farklı uyarma filtreleri altındaki hücreleri gözlemleyin ve görüntüleri kaydedin.Hücre farklılaşması için, CSC'leri 37 santigrat derece, önceden ısıtılmış CSC bakım ortamı na sahip altı kuyulu bir tabakta büyütün. Hücreler %80 ila %95 biraraya geldiğinde, bakım ortamını iki mililitre, 37 santigrat derece, önceden ısıtılmış kardiyomiyosit farklılaşma ortamıyla değiştirin. 37 santigrat derecede kuluçka, 2-3 hafta kadar %5 CO2 ile.Her 2-3 günde bir farklılaşma ortamını değiştirin. Orta değişim sırasında, iyi kültür koşulları sağlamak için bir mikroskop altında hücre morfolojisi gözlemleyin. 12 gün sonra, standart bir immünboyama protokolü ne göre farklılaşma belirteçleri için hücreleri görüntüleyin.İki ila üç gün kültürlü CSCs bir faz kontrast mikroskop altında gözlendiğinde bir mil şeklinde morfoloji seve. Yedi günlük kültürden sonra morfolojide bir değişimin uzamış olduğunu gösteriyorlar. Pluripotency belirteçleri için immünboyama sonra, CSCs OCT4 ifadeleri gösterir, SOX2, ve Nanog.Ayrıca, CSC'ler kültür ortamında çoğalır ve ki67'de çoğalma işaretini ifade eder. KSK'ların kardiyak kökenini karakterize etmek için kardiyak belirteçlerin ekspresyonu incelendi ve sca-1, NKX2.5 ve GATA4 kardiyak belirteçleri için pozitif olduğu görüldü. Kardiyomiyosit farklılaşma ortamında 12 gün kalım sağlanmadan sonra, diferansiyel CSC'ler kardiyomiyosit belirteçlerinin ACTINin ve TROPONIN-I'nin ekspresyonunu göstermektedir.Bu yordamı çalışırken, degrade çözeltisi ve filtrat karıştırma izin vermemek önemlidir. Hızlanma ve yavaşlamayı en düşük hızda ayarlamak da önemlidir. Onları kim kirletir, bir biyogüvenlik kabiniçinde tüm hücre izolasyon işlemi gerçekleştirmek için tavsiye edilir.Bu prosedürü takiben, kardiyak kök hücrelerin homojen popülasyonu ne kadar açık olduğu gibi ek soruları cevaplamak için manyetik boncuk bazlı ayırma veya akış sitometik hücre ayrıştırma yöntemleri gibi diğer yöntemler de yapılabilir? Kardiyak kök hücredeki çatlak yarıçapı büyük belirteçlerdir ve kardiyomiyositlere karşı farklılıklar vardır. Bu teknik gelişiminden sonra, bu teknik, iskemik kalp yetmezliğirejeneratif tedavi için önemli olabilir fare kalp kalp kök hücrelerinin genellikle yüksek verim kardiyovasküler hastalık alanında araştırmacılar için önünü açacaktır.Cerrahi bıçak, çamaşır suyu ve DMSO ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken Personel Koruyucu Ekipman, PPE gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

isolation-characterization-differentiation-cardiac-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Bu protokol, bir öbek sindirim yaklaşımı kullanarak yetişkin fare kalbi tek atriyal kardiyomiyositler izole etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, yama kelepçe çalışmalarında atriyal miyosit elektrofizyolojisini karakterize etmek için kullanılabilecek sağ veya sol atriyal miyositleri izole etmek için kullanılır.

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Öğrenin yetişkin fare kalbinden kardiyak kök hücre izolasyonu, karakterizasyonu ve farklılaşması için standart protokolü. Bu maliyet etkin yöntem kardiyovasküler hastalık ve kalp yetmezliği araştırmalarında yenilikçi tedavilere katkı sağlar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Daha fazla video keşfet