Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için
January 7th, 2019
Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.
Bu yöntem, hem yüksek iş artışı hem de yüksek hassasiyette hücre dışı proteinler için yeni bağlayıcı ortakların saptanmasını sağlayarak protein etkileşimleri alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, protein sadece birkaç mikrogram ile, mikro dizi yazıcı kullanarak slaytlar yüzlerce oluşturabilirsiniz. Slayt yazdırma için standart bir mikro arrayer kullanın.
Bu cihaz, çalışma başına 57 slayt kapasitesine sahiptir, 48 tespit pimi tutan bir yazdırma kafası kullanır ve slayt başına 8.000 noktaya kadar sığdırılabilir. Stok plakalarından kuyu başına 10 mikrolitre numunede 384 kuyu plakası kullanarak çalışma plakaları oluşturun. Mikro arrayer kullanarak slayt yazdırma dan önce bu adımı el ile gerçekleştirin.
Daha sonra protein lekelerinin susuzluklarını önlemek için %60 nemde epoksi silane slaytlara quill tipi tespit pimleri ile proteinleri noktalayın. Cy3 etiketli sığır serum albumin maske uydurma için dizi görselleştirmek için her protein örneği arasında yinelenen tespit edilebilir. Yazdırmanın ardından, protein mikro dizi slaytlarını nemli ortamdan çıkarın.
Daha sonra, slayt yüzeyine yerleşir engelleme çözümü ince bir sis oluşturmak için bir ultrasonik fogger kullanın. Daha sonra, yüzeyi etkinleştirmek için PBST%5 süt ile slaytları bir gecede engelleyin. Donmayı önlemek için slaytları %50 gliserolda eksi 20 derecede saklayın.
Hücre dışı proteinler arasındaki etkileşimler genellikle düşük yakınlıkları ile karakterizedir. Bu etkileşimlerin saptanmasını sağlamak için, bağlayıcı aviditeyi artırarak, FC olarak ifade edilen sorgulanmış proteinin yakalanmasına dayalı çok yaygın bir yaklaşım geliştirdik. Metin protokolünde açıklandığı gibi Cy5 mono reaktif boya ile etiketlenmiş olan taşıyıcı IgG'yi döndürün.
Sorgu proteini ve Cy5 IgG'nin molar oranını hesaplamak için, sorgu proteininin moleküler ağırlığını IgG'nin moleküler ağırlığına bölün ve gerekli Cy5 IgG konsantrasyonunu belirlemek için mililitre başına 40 mikrogram ile çarpın. Tüm oranlar belirlendikten sonra FC etiketli sorgu ve Cy5 IgG proteini A mikro boncukları birleştirerek mikro boncuk protein kompleksini oluşturur. PBS'deki süspansiyonu oda sıcaklığında ışıktan korunan bir tüp rotatöründe 30 dakika karıştırın.
Gösterime başlamak için, hibridizasyon istasyonuna yüklemeden önce hazırlanan slaytları oda sıcaklığında ısıtın. Tarama gerçekleştirmek için, ilk kalıntı gliserol kaldırmak için bir dakika pbst ile mikro dizi yıkayın. PBS%5 süt ve inkübat başına mililitre protein Başına 200 mikrolitre Yük PBS%5 süt ve inkübat 30 dakika boyunca karmaşık olmayan protein bir mikro boncuk FC etiketli proteinler için bağlanmasını önlemek için mikro dizi mevcut olabilir.
Hibridizasyon istasyonu PBST ile slaytlar yıkadı sonra, yük 200 mikrolitre sorgu mikro boncuk kompleksi, mililitre protein A başına bir miligram varlığında ve kuluçka 30 dakika. Hibritleştirme ve hibridizasyon istasyonu tarafından slaytların yıkanması sonrasında, su ile slaytlar durulayın ve bireysel 50 mililitrekonik tüpler yerleştirin. Tüpleri 900 kez G'de beş dakika boyunca döndürerek kurulayın.
Son olarak, cy3 ve Cy5 floresansını sırasıyla 532 ve 635 nanometrede heyecan verici bir şekilde algılamak için uygun bir mikro dizi tarayıcısı ile slaytları tarayın. Burada gösterilen yazdırılmış bir slayt temsili bir görüntüdür. Cy3 etiketli büyükbaş hayvan serum albümin lekeleri yeşil.
Noktalar, yazdırma işleminin kalite kontrolü olarak çoğaltılarak yazdırıldı. Hücre dışı protein mikro dizi teknolojisini kullanarak bağlayıcı ortakların tanımlanması için taranmış yetim proteininin temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Yinelenen kırmızı noktalar, ekranlı sorgu proteini için bir isabet olarak tanımlanır.
Açıklanan bu yöntem son derece çok yönlüdür ve protein kütüphaneleri bir gam baskı için kullanılabilir, onlar özel protein aileleri veya bizim ki gibi proteinlerin büyük derlemeler olabilir. İlgilenen herhangi bir protein değerlendirilebilir. Bu prosedürü denerken slaytları dikkatli bir şekilde işlemek ve basılan proteinlerin aktivite kaybını önlemek için kurumamasını sağlamak önemlidir.
İlgi çekici bir proteinin ekranını takip ederek, yüzey plazmon rezonansı gibi ortogonal teknolojiler kullanılarak gözlenen darbeleri daha da doğrulamak için son derece tavsiye edilir. Bu teknik, gelişiminden sonra araştırmacıların insanlardaki hücre dışı protein etkileşimlerini incelemelerinin önünü açmıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, yüksek verimli olarak yeni reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için hücre dışı protein mikro dizilerini taraması için bir protokol sunmaktadır. Ayrıca, protein-mikrobun kompleksleri kullanılarak geçici protein-protein etkileşimlerinin tespitinin arttırılması yöntemi de açıklanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Protein-protein etkileşimleri
- Hücre dışı proteinler
- Yüksek verimli tarama
Arka Plan
- Reseptör-ligand etkileşimlerinin anlaşılması biyolojide kritik öneme sahiptir.
- Geçici protein-protein etkileşimleri genellikle tespit edilmesi zordur.
- Mikro dizi levhalar, yüksek verimli analiz için bir platform sağlamaktadır.
- Protein-mikrobun kompleksleri, tespit hassasiyetini artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre dışı proteinler için yeni bağlanma ortaklarını tanımlamak.
- Geçici etkileşimlerin tespit hassasiyetini artırmak.
- Verimli tarama için mikro dizi teknolojisini kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kaydırma jenerasyonu için mikro dizi yazıcılarının kullanımı.
- 384 kuyu plakaları kullanılarak çalışma plakalarının hazırlanması.
- Kaydırma yazdırma öncesi manuel numune hazırlanması.
- Çoklu kaydırma ile yüksek kapasiteli yazdırma.
Ana Sonuçlar
- Yeni reseptör-ligand etkileşimlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Geçici etkileşimlerin tespitinde yüksek hassasiyetin gösterilmesi.
- Kapsamlı tarama için minimal protein miktarlarının verimli kullanımı.
- Yalnızca birkaç mikrogram proteinden yüzlerce kaydırmanın üretilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, protein etkileşimlerini inceleme yetisini artırır.
- Mikro dizi teknolojisi yüksek verimli analiz için etkilidir.
- Bu yöntem, protein biyolojisi araştırmalarını önemli ölçüde ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-throughput extracellular protein microarray technology addresses a critical bottleneck in mapping low-affinity receptor-ligand interactions, which are central to target validation and therapeutic discovery. By enabling robust detection of transient extracellular protein interactions with minimal sample requirements, this approach enhances predictive confidence at the earliest stages of biopharma R&D. Its scalability and sensitivity support portfolio-wide interrogation of novel targets and de-risking of biological hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of novel extracellular binding partners for target validation.
- Supports biological de-risking by revealing previously undetectable low-affinity interactions.
- Facilitates rapid triage of candidate targets based on interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein microarrays for downstream screening workflows.
- Standardizes detection of weak protein-protein interactions for reproducible assay development.
- Enables high-throughput, quantitative evaluation of extracellular protein libraries.
Translational & Preclinical Research
- Aligns discovery findings with disease-relevant extracellular signaling pathways.
- Provides continuity from target identification to preclinical validation of interaction networks.
- De-risks translational progression by confirming functional extracellular interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This technology integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis-driven screening and mechanistic de-risking of extracellular targets.
- Discovery Biology: Enables high-sensitivity mapping of receptor-ligand networks for hypothesis testing.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microarray outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts to support statistical evaluation of binding events.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by confirming extracellular protein interactions relevant to disease.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable platform for repeated interrogation of diverse protein libraries across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes high-throughput workflows with minimal protein consumption and robust reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by clarifying extracellular interaction landscapes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, labeling, and microarray handling.
- Needs access to microarray printers, hybridization stations, and fluorescence scanners.
- Demands rigorous cross-team standardization for slide preparation and data analysis.
- Adaptable to various protein families and library sizes with careful protocol adherence.
- Dependent on orthogonal validation (e.g., surface plasmon resonance) for hit confirmation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Extracellular Protein Microarray Printing
1:55
Preparation of Multivalent Bait Complexes
3:09
Extracellular Protein Microarray Screening
4:36
Results: Evaluation of Extracellular Protein Microarray Slide Printing and Screen of an Orphan Query Protein
5:11
Conclusion
