Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

Bu yöntem, mikrobiyoloji alanındaki sıvı akışının mantar biyofilm büyümesini ve gelişimini nasıl değiştirdiği gibi anahtar soruların yanıtlatmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, akışın biyofilm büyümesi ve gelişimi üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak nicel olarak değerlendirmemize olanak sağlamasıdır. Bu denemeyi, metin protokolünde açıklandığı gibi akış aygıtının montajıyla başlatın.

Deney günü, kabarcık tuzağı, sıcaklık sondası ve tüm tek kullanımlık bileşenleri takın. Filtreyi monte etmek için, bir mililitrelik şırıngadan pistonu çıkararak adaptör yapın. Bu uç içine filtre şişesinden boru kuvvet ve büyüme şişesi ne kadar boru 2 mikron filtre takın.

Bu sisteme hava sızıntılarını önlemeye yardımcı olur gibi, bağlanmadan önce slayt adaptörün barb etrafında silikon vakum gres uygulayın. Ek şişesini 100 mililitre YPD ile doldurun ve büyüme şişesini 200 mililitre YPD ile doldurun. Yeşil yan borunun her şişede ortama ulaştığından emin olun.

Tüm vanaların açık olduğundan emin olun. Bir vakum kabarcık tuzak takın ve kabarcık tuzak aşağı yeşil yan boru pompa bağlayın. Tamamen yeşil tarafı doldurmak için dakikada 3,3 mililitre lik bir akış hızında sıvı pompası.

Daha sonra, yaklaşık bir ila iki mililitre medya dağıtın ve atın, çünkü mililitreilk çift genellikle ölü hücreler veya rasgele enkaz içerir. Borunun yeşil tarafının medya yla dolu olduğundan ve devam etmeden önce kabarcık kapanının aşağısında kabarcıklar olmadığından emin olun. Kanal slaytını ve rezervuarı YPD ile doldurun, kabarcıkları tanıtmamaya özen gösteriyor.

Slaydın akış aygıtına bağlayın. Sonra turuncu tarafında yaklaşık 5 metre lik bir tampon oluşturmak için daha fazla sıvı pompası. Bu, geri akış durumunda yanlışlıkla slaytta hava yakalamaönlemek içindir.

Şimdi, ilk kabarcık kapanı giriş ve çıkış kapalı dikim tarafından mikroskop aparatı taşıma için hazırlayın. Sonra yeşil ve turuncu yan eki şişe vanaları kapalı kenetleyin. Nabız sönümleyici ve filtre şişesi için vida kapaklarının sıkı olduğundan emin olun, çünkü otokaplama sırasında gevşeyebilirler.

Taşımayı kolaylaştırmak için pompayı borudan çıkarın. Daha sonra sıcak tabak karıştırıcı da dahil olmak üzere tüm bileşenleri mikroskopa yakın ikincil bir kap içine taşıyın. Sıcaklık probusıcak karıştırıcı ya takın ve ek şişesini 37 dereceye Kadar ısıtmaya başlayın.

Ortamı 300 RPM'de karıştırın ve tüm deneme boyunca bunu koruyun. Slızı mikroskopa monte edin ve gerekirse sıkıntıya sıkıntıyı sıkıntıya güçl Sonra bir vakum kabarcık tuzak takın.

Şimdi, pompayı akış cihazına bağlayın. Pompayı dakikada 3,3 mililitre lik bir akış hızıyla çalıştırın ve yaklaşık 5 ila 10 saniye boyunca çalışmasını bekleyin. Sonra, let-out kapak klan kabarcık tuzak kaldırın.

Ek şişesi ısınırken pompanın çalışmaya devam etmesine izin verin. Bir kez ek şişe ve kuluçka odası hem de 37 santigrat derece, ek şişe mililitre başına bir milyon hücreulaşmak için yeterli gecede kültür ekleyin. Hücrelerin alışması için 15 dakika bekleyin.

Hücrelerin akışını başlatmak için her iki büyüme flask vanaları kapatırken hem yeşil hem de turuncu yan eki flask vanaları açın. Hücrelerin slayta ulaşmasını sağlamak için yaklaşık beş dakika bekleyin. Bu süre zarfında, mikroskobu odakla ve önceki deneylerde kullanılan aynı görüntüleme parametrelerine göre ayarlayın.

Ek aşaması için görüntü edinimi başlatın. Odak noktasının korundığından emin olmak için yaklaşık beş ve 10 dakika sonra tekrar kontrol edin. Değilse, bir sonraki görüntü alındıktan hemen sonra odağı ayarlamaya çalış.

Ek aşaması tamamlandıktan hemen sonra dosyayı kaydedin. Daha sonra her iki ek şişe vanaları kapatırken hem yeşil hem de turuncu yan büyüme flask vanaları açın. Kuluçka odasının içinde herhangi bir vana varsa, sahneyi çarpmamaya dikkat edin.

Termometre probunun fişini çekin ve ek şişeyi büyüme şişesiile değiştirin. Şimdi, yazılımı 22 saat içinde her 15 dakikada bir görüntü elde etmek için yapılandırın ve büyüme aşaması için görüntü edinimi başlar. Büyüme aşaması edinimi tamamlandıktan ve dosya kaydedildikten sonra, turuncu tarafta basınç serbest olarak bir gürültü yapabilir yeşil ve turuncu yan eki maadavan, açın.

Her iki medya şişesinden gelen yeşil yan boruları, medyanın en az birkaç santimetre yukarısından çıkana kadar yukarı çekin. Daha sonra, çok daha kolay temizlik yapar boru, tüm medya kaldırmak için yüksek bir hızda pompa çalıştırın. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi videoları ölçün.

Bu zaman atlamalı karanlık alan mikroskobu video ek aşamasında alt tabaka altında vahşi tip Candida albican hücrelerinin eki gösterir, biyofilm oluşumuna yol açan büyüme aşamasında sonraki büyüme ve gelişme izledi. Bu videolardan elde edilen veriler zaman içinde hücre eki ve kopma ve biyokütle oranları için analiz edilebilir, burada gösterilen densitometri analizi ile belirlenen görüntüleme bölgesi içinde toplam biyokütle. Hücre ekinin kümülatif oranı ve zaman içinde yüzde biyokütle kopması da gösterilir.

Bu yordamı denerken, tüm denemelerde aynı görüntüleme koşullarını kullanmayı unutmamak önemlidir, çünkü bu, aralarında nicel karşılaştırmalar yapılmasına olanak sağlar.