β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Burada sunulan tek tek veya birlikte fibrin pıhtısı yapısı üzerinde beta-amiloid etkisini analiz için kullanılan iki yöntem vardır. Vitro fibrin pıhtısı oluşturma takip için pıhtı bulanıklık ve Tarama elektron mikroskobu ile yöntemleri dahil bir protokoldür.

Bu plaka tabanlı bulanıklık testinin en büyük avantajı hızlı olması ve birkaç amiloid-beta fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin gelişmiş kurulum veya gereksinimler olmadan aynı anda taranmasını sağlamasıdır. Fibrin türbiditesi testinde bulunan kafa bileşikleri, elektron mikroskobu taranarak analiz edilen fibrin pıhtılarında A-beta kaynaklı yapısal anormalliği geri getirme yetenekleri açısından daha fazla değerlendirilebilir. Taramalı elektron mikroskobu analizi için pıhtı hazırlığının görsel gösterimi, hazırlıktaki herhangi bir varyasyonun deneysel sonuçlardaki varyasyonlara katkıda bulunabileceğinden kritik öneme yöneliktir.

Bu gösterinin odak noktası A-beta fibrinojen etkileşimleridir. Bu protokol kolayca fibrin pıhtısı ile diğer proteinler ve bileşikler ile diğer etkileşimleri analiz etmek için değiştirilebilir. Her A-beta negatif 42 içeren ve kontrol kuyuları içeren ve kontrol kuyuları ve oda sıcaklığında dönen bir platform üzerinde plaka kuluçka ya da pıhtı oluşumu tampon 200 mikrolitre taze hazırlanmış fibrinojen 1.5 mikromolar ekleyerek başlayın.

30 dakika sonra aynı anda pıhtı oluşumunu başlatmak için doğrudan fibrinojen içeren kuyunun merkezine taze hazırlanmış trombin çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin ve hemen 350 nanometre de in vitro pıhtıların emici okuyun, 10 dakika boyunca her 30 ila 60 saniyede bir ölçüm tekrarlayın. A-beta fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin fibrin pıhtı yapısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için, ilk olarak temiz, 12 milimetre silikonlu cam daire kapağını 12 kuyunun ayrı kuyularına yerleştirmek için forseps kullanın ve her kapak kapağına 80 mikrolitre fibrinojen ekleyerek çözeltiyi eşit olarak dağıtılır. Pıhtı oluşumunu başlatmak için her kuyuya 20 mikrolitre trombin çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 ila 60 dakikalık bir kuluçka için plakayı kapatın, sonra her pıhtıyı iki mililitre buz gibi sodyum kacodylate tamponuna iki dakika batırın, oda sıcaklığında iki kez, her yıkamadan sonra tamponu dikkatlice çıkarmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, kapak kayma pıhtı oluşumudurumunu kontrol edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde buz üzerinde buz üzerinde 2-3 mililitre buz pıhtıları düzeltmek. Kuluçka sonunda, yavaşça her kuyudan glutaraldehit kaldırmak ve taze sodyum kacodylate tampon ile pıhtıyı yıkayın buz üzerinde gösterildiği gibi.

Beş dakikalık buz gibi etanol bir dereceli serisi sabit pıhtıları nemlendirmek için tamamen pıhtıları hava maruz kalma dan korumak için yıkayımı arasında etanol çıkarmadan buz üzerinde yıkarsın. Son %100 etanol yıkama sırasında, kapak kaydığı kritik bir nokta kurutucu numune tutucuya aktarın, her kapak fişi arasına en az 1 yıkayacak makinesi yerleştirin ve tutucuyu etanol dolu kritik bir nokta kurutucu haznesine yerleştirin. 30 dakikalık bir kurutma döngüsünden sonra, tek tek taramalı elektron mikroskobu koçanları üzerine kapak fişleri monte etmek için karbon bandı kullanın ve örnekleri vakum püskürtücü kaplama odasına aktarın.

Daha sonra 20 nanometreden daha az altın paladyum veya diğer iletken malzemelerin numuneler üzerine saniyede dört angstrom'da 25 saniye boyunca fışkırtMası ve numuneleri dört kilovoltta tip iki ikincil elektron dedektörü ile donatılmış bir tarama elektron mikroskobu üzerinde görüntüle. Fibrin pıhtı oluşumu çözeltiden geçen ışığın saçılmasına neden olur ve okuma döneminin sonunda yaylaların bulanıklıkta artışa yol açar. Fibrinojen A-beta 42 varlığında inkübe edildiğinde çözeltinin bulanıklığı eğrinin sadece fibrinojenin yaklaşık yarısı kadar maksimum yüksekliğe ulaşmasıyla azalır.

Bir A-beta 42 etkileşim blokeri varlığında beta-amiloid etkisi iyilenir ve bulanıklık sadece A-beta ile daha yüksektir. A-beta olmadığında bileşiği fibrin pıhtı bulanıklığını değiştirmediği için blokerin etkisi arka plan bulanıklığı ndan dolayı görünmez. Ayrıca, GPRP varlığında pıhtı oluşumu, fibrin polimerizasyonu ile müdahale bilinen bir peptid, inhibitörü yokluğunda fibrin pıhtı oluşumuna göre önemli ölçüde azaltılmış bulanıklık göstermektedir.

Trombin ve kalsiyum klorür varlığında üretilen fibrinojen sadece fibrin uzun ve intercalated iplikleri yanı sıra daha büyük demetleri ile bir fibrin mesh oluşturur. A-beta mevcut olduğunda, fibrin iplikleri agregalarda birkaç yapışkan kümeler ile ince oldu, A-beta indüklenen yapısal anormallikleri gösteren. Bulanıklık tahsin sonuçları ile tutarlı olarak, Bir A-beta fibrinojen etkileşim bloker varlığında pıhtı oluşumu kısmen daha az kümeleri bu tedavi ile gözlenen olarak A-beta kaynaklı değişikliklerden fibrin pıhtı yapısını geri.

Pıhtı bulanıklığı testi ve taramalı elektron mikroskobu analiz protokolleri, birkaç A-beta fibrinojen etkileşim inhibitörünü hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmek için optimize edilmiştir. Ve yakında veriler hem in vitro hem de in vivo ileri çalışmalara uygulanabilecek fibrin pıhtı oluşumu hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır.