Name: β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Öğrenin beta-amiloidin fibrin pıhtı yapısına etkisini türbidite ölçümü ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etme yöntemlerini. Bu protokoller nörodejeneratif hastalık mekanizmalarını anlamak için hızlı tarama ve yapısal değerlendirme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso ve Michael Foley Tri-Kurumsal Therapeutics Discovery Enstitüsü (TDI), New York Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri sentezi için ve onların değerli öneriler teşekkür. Yazarlar ayrıca Üyeler Strickland laboratuarının yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser NIH grant NS104386, Alzheimer ilaç keşif Vakfı ve Robertson terapötik Geliştirme Fonu tarafından H.A. için NIH NS50537, Tri-Kurumsal Therapeutics Discovery Enstitüsü, Alzheimer'ın uyuşturucu keşif Vakfı Hibe desteklenmiştir, Rudin Aile Vakfı ve John A. Herrmann S.S. için

1. hazırlanması Aβ42 ve fibrinojen analizi için
<ol><li>Liyofilize toz üzerinden monomeric Aβ42 hazırlamak<ol>
<li>1500 x g 30 için de aşağı Aβ42 toz oda sıcaklığında ve spin sıcak s.</li>
		<li>Buz gibi hexafluoroisopropanol (HFIP) 100 µL 0.5 mg Aβ42 tozu ekleyin ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya. Dikkat: HFIP ele alırken dikkatli olun ve kimyasal bir mahallede tüm adımları gerçekleştirin.</li>
		<li>20 µL aliquots ve kuru kimyasal başlıklı 2-3 h. filmleri filmleri hava-ebilmek var olmak stok-20 ° C'de izin hazırlamak</li>
		<li>Monomeric Aβ42 filmde 10 µL taze dimetil sülfoksit (DMSO) Oda sıcaklığında 10 dakika içinde bir banyo sonicator ajitasyon tarafından yeniden oluşturma.</li>
		<li>50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) arabelleği (pH 7,4) 190 µL ekleyin ve yukarı ve aşağı yavaşça pipet.</li>
		<li>Santrifüjü 20 dk için 4 ° C'de 20,817 x g de protein toplamları kaldırın.</li>
		<li>Süpernatant 20 dk için gece ve sonraki gün santrifüj 20,817 x g 4 ° c de çözüm için 4 ° C'de daha fazla protein toplamları atmak için kuluçkaya.</li>
		<li>Aβ42 konsantrasyonu bicinchoninic asit (BCA) tahlil tarafından ölçmek. Seri seyreltik Sığır serum albumin (BSA) 1 mg/mL den bir protein standart üretmek, çok iyi bir tabak içinde nüsha kuyu her standart 10 µL eklemek için 0.0625 mg/ml saf. Aβ örnekleri 1:4 sulandırmak ve 10 µL nüsha wells ekleyin. BCA çözümleri A ve B mix ve her şey için 200 µL ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya ve 562 bir plaka okuyucu okumak nm. Buz üstünde kalan Aβ çözüm almak ve bu hazırlık bulanıklık tahlil ve SEM için kullanma</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fibrinojen çözüm hazırlamak<ol>
<li>Fibrinojen liyofilize toz 20 mg 15 mL tüp içine ölçmek ve önceden ısıtılmış 2 mL ile 20 mM hydroxyethylpiperazine etan sülfonik asit (HEPES) arabellek (pH 7,4) yeniden askıya alma.</li>
		<li>10 dk 37 ° C su banyosunda kuluçkaya.</li>
		<li>Çözüm 0.2 µm şırınga filtre ile filtre ve 30 dk için 4 ° C'de depolayın. 4 ° C ve filtre çözümden daha 0,1 µm şırınga filtreden fibrinojen toplamları kaldırmak için çıkarmak veya fibrin önceden var olan.</li>
		<li>Fibrinojen konsantrasyonu BCA tahlil tarafından ölçmek. 1.1.8 adımından yönergelere bakın. Kalan fibrinojen çözüm 4 ° C'de almak ve bu hazırlık bulanıklık tahlil ve SEM için kullanma</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kan pıhtısı bulanıklık tahlil
<ol><li>96-şey plaka deneysel her şey için onun son arabellek 200 µL 3.0 µM bölgedir 1.1.8 adımından 20 µL 30 µM Aβ42 çözüm ekleyin. %5 DMSO aynı hacmi 96-şey plaka kontrol wells arabellek için 50 mM Tris tampon (pH 7,4) ekleyin. Not: Aβ42 tam birim bu aşamada önemli değil. Düşük konsantrasyon hazırlıklar için daha fazla kullanılabilir ve pıhtı oluşumu arabellek ses seviyesi ayarlanabilir. Son hacim 200 µL kalmalıdır.</li>
	<li>İnhibitör bileşikler sınama olumlu sonuçlanırsa, bileşik olarak DMSO çalışma konsantrasyonu oranında seyreltin. Bileşik eklemek veya DMSO yalnız bir denetimi Aβ42 ve mix iyi kuyuları için. Not: Ayrı bir damlacık bahçedeki kuyu dibinde Aβ42 çözüm oluşturması gerektiğini veya DMSO damlacığı merkezine doğrudan pipetted.</li>
	<li>Pıhtı oluşumu arabellek 1.2.4 adımda hisse senedi fibrinojen çözümden seyreltik (20 mM HEPES tampon (pH 7,4), 5 mM CaCl2ve 137 mM NaCl) ve Aβ42 içeren ve denetim kuyuları 96-şey plaka için ekleyin. Böylece onun son konsantrasyonu 1,5 µM toplam 200 µL tepki birim içinde olur fibrinojen çözüm ses düzeyini ayarlayın. Çözüm yavaş yavaş pipette ve kabarcıklar oluşturan kaçının. Plaka, oda sıcaklığında 30 dk dönen bir platform üzerinde sallayarak için kuluçkaya. Not: Fibrinojen çözüm hacmi, hisse senedi toplama bağlı olarak değişebilir, ama her toplam hacim de 170 µL kuluçka sırasında olmalıdır.</li>
	<li>Trombin çözüm ticari olarak saflaştırılmış Trombin toz yapmak 50 U/mL stok a eriyik için GKD2O çözülerek hazırlayın. 5 U/mL çalışma çözüm içinde 20 mM HEPES tampon (pH 7,4) kullanmadan doğrudan oranında seyreltin.</li>
	<li>Kuluçka 30 dk sonra aynı anda 30 µL Trombin çözüm (5 U/mL) 96-şey plaka fibrinojen çözümlerinde içine adım 2.3 çok kanallı pipet kullanarak ekleyin. Trombin eklenmesi hemen pıhtı oluşumu başlatacaktır. Bu nedenle, Trombin kabarcıklar oluşturan önlemek için itina ile fibrinojen çözüm merkezi doğrudan içine ekleyin. Not: Trombin aktivitesi Trombin çok yanı sıra deneysel koşullar arasında değişebilir. Sağlam pıhtıları üretmek için gereken doğru konsantrasyon ampirik olarak belirlenecek olabilir.</li>
	<li>Vitro pıhtı hemen ardından Trombin ek bir plaka okuyucu üzerinde absorbans okuyun. 350 absorbans ölçmek nm 10 dk, her 30-60 s. Perform tüm tahlil oda sıcaklığında boyunca. Not: Bazı önleyici bileşikler 350 çözüm absorbans değiştirebilir nm, hangi durumda bulanıklık ölçülebilir 405 nm.</li>
</ol>3. Tarama elektron mikroskobu
<ol><li>Pıhtı, fiksasyon ve çamaşır hazırlanması<ol>
<li>Yer temiz cam daire kapak slaytlara (12 mm) 12-şey ya da 24-şey plaka forseps kullanarak silikonlu.</li>
		<li>Fibrinojen içinde pıhtı oluşumu tampon hazırlayın. Ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı adıma 1.2 bakın.</li>
		<li>Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri fibrin pıhtısı yapısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için (adım 2) bulanıklık tahlil için anlatılan kuluçka için talimatları izleyin. Her zaman yokluğunda Aβ ve inhibitörleri, fibrinojen içeren denetim wells içerir.</li>
		<li>Adım 3.1.3 kapak slaytlara fibrinojen karışımı 80 µL pipet. Böylece kapak slayt üzerinde eşit olarak dağıtılır çözüm yavaşça yayıldı.</li>
		<li>Trombin stok (50 U/mL) 20 mM HEPES tamponlu tuz 2.5 U/mL nihai bir konsantrasyon için içine sulandırmak ve 20 µL doğrudan fibrinojen çözüm merkezine olmadan ekleyin. Not: gerekirse, Trombin çalışma yoğun (5 U/mL) kullanılabilir.</li>
		<li>12-şey plaka plastik bir kapak ile kapak ve 30-60 dakika oda sıcaklığında bekletin.</li>
		<li>Reaksiyon pıhtılaşma çalışırken, dehidratasyon ve fiksasyon çözümleri hazırlayın. Sodyum cacodylate arabellek (0.1 M, pH 7,4) hazırlayın. % 10 oxazolidin hisse senedi çözüm içinde sodyum cacodylate tampon (%0.1 2 oxazolidin çözüm çalışma yapmak için M, pH 7,4) oranında seyreltin. Bu çözümler buz üzerinde tutun. Taze seyreltilmiş oxazolidin (% 2) 1 hafta içinde kullanılması gereken düzgün bir buzdolabı 4 ° C'de saklandığında</li>
		<li>Mutlak etanol (% 100) Çift Kişilik distile su (etanol %80, % 50 ve % 20) oranında seyreltin. Bu etanol çözümleri ve mutlak etanol (% 100) buz üzerinde tutun. Dikkat: Sodyum cacodylate ve oxazolidin ele alırken dikkatli olun, kimyasal bir mahallede aşağıdaki adımları gerçekleştirin.</li>
		<li>30 dakika sonra yavaşça pıhtıları buz gibi sodyum cacodylate arabellek (0,1 M) ile iki kez yıkayın. Öyle ki pıhtı tamamen sular altında her şey için arabellek 2 mL ekleyin. Bir kapak ile iyi plaka kapak ve 2 dakika oda sıcaklığında bekletin. 2 dakika sonra yavaşça 1 mL pipet veya dar kök transfer pipet kullanarak çıkarın. Bir kez yinelenir.</li>
		<li>Pıhtı buz gibi oxazolidin (% 2) ile düzeltmek. İyi plaka buz üzerinde tutarak, yaklaşık 2-3 mL % 2 oxazolidin, her şey için ekleyin. Pıhtı tamamen sular altında emin olun. Kapak ve plaka buz 30 dk bekletin.</li>
		<li>30 dk sonra yavaşça oxazolidin her kuyudan çıkarın ve sodyum cacodylate tampon (0,1 M) (2 dk, iki kez) açıklandığı gibi kullanarak pıhtıları yıkayın. İyi plaka buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seri susuzluktan pıhtı ve kritik nokta kurutma<ol>
<li>Buz gibi soğuk etanol yıkar adım 3.1.8 (% 20, % 50, % 80'i, % 100 ve again100%) 5 min için hazırlanan dereceli bir dizi pıhtıları kurutmak. Her etanol dizi için 2-3 mL, pıhtı batık emin ekleyin. Kapak ve buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Her etanol adımdan sonra 1 mL pipet veya tek kullanımlık pipet damlalık kullanarak etanol çözüm kaldırın. Etanol tam olarak kaldırmaz. Pıhtı yüzey havaya maruz değil emin olun. Not: Dehydration içinde mutlak etanol (% 100) iki kez yapılmalıdır.</li>
		<li>Son %100 etanol sular altında örnek tutarken, bir kritik nokta için kurutma makinesi (GBM) aktarın. CPD örnek sahibi veya bir kapak fişi tutucu bir çamaşır makinesi ile slaytlar CPD odanın içine aktarmak için kullanın. Her slayt arasında en az bir çamaşır makinesi yerleştirin.</li>
		<li>CPD odasından kapak kaymak dışarı almak ve karbon bant kullanarak bir SEM saplama üzerinde monte edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaplama ve görüntüleme şaplatın<ol>
<li>SEM saplama ile tüm örneklerini sputter kaplama odasına aktar.</li>
		<li>Sputter kat az 20 nm altın/Paladyum veya karbon, bir vakum sputter coater kullanarak gibi diğer iletken malzemeler. Not: Biz-si olmak kullanılmış 18 altın/Paladyum kaplama nm. Sputter kaplama için 45 gerçekleştirildi ve kaplama hızı s yapıldı 4 Å / s. kaplı Sputter örnekleri düzgün oda sıcaklığında kuru bir ortamda birkaç hafta boyunca tutulur kararlı. SEM analiz her zaman yapılabilir.</li>
		<li>Saat 4'te SE2 bulmak ile donatılmış bir taramalı elektron mikroskobu görüntüleri elde kV. Not: Bu görüntü görüntü piksel boyutunu 13 nm-31 nm aralığı ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li>
<li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li>
<li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer%27s+disease%3A+an+emperor+in+need+of+clothes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li>
<li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li>
<li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR%2C+American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li>
<li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+will+out%3A+vascular+contributions+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li>
<li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li>
<li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li>
<li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis%3A+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li>
<li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer%27s+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li>
<li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li>
<li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li>
<li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li>
<li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li>
<li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li>
<li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li>
<li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations%3A+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li>
<li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879(2012).</li>
<li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+amyloid+beta-peptide+%28Abeta%29+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+%28CR-abeta%29+spectrophotometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li>
<li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia%2C+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+%28LPS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li>
<li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-binding+protein+%28LBP%29+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121(2018).</li>
<li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation%3A+lessons+from+and+for+blood+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li>
<li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation%2C+fibrin+clot+formation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li>
<li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob%3Ahole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan yöntemleri fibrin pıhtısı oluşumu vitrodeğerlendirilmesi için tekrarlanabilir ve hızlı bir yol sağlar. Ayrıca, sistem sadeliği Aβ fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı nispeten düz ileri etkilemesi yorumu yapar. Bu laboratuar önceki yayında, bu deneyleri bileşikler Aβ-fibrinojen etkileşim13,14etkisizleştirmek yeteneklerini için test etmek için kullanılabilir gösterildi. Bu iki deneyleri kullanılarak, bir dizi sentezlenen bileşiklerin analiz A...

Alzheimer hastalığı (Ah), yaşlı hastalarda bilişsel gerileme önde gelen bir nörodejeneratif hastalık çoğunlukla anormal beta-amiloid (Aβ) ifade, toplama ve engelli izni nörotoksisite1', kaynaklanan kaynaklanmaktadır 2. Aβ toplamları ve reklam3arasında iyi karakterize derneğin rağmen altta yatan hastalık patoloji kesin mekanizmaları iyi anlaşılan4değildir. Aβ doğrudan6dolaşım sistemi bileşenleriyle etkileşimli çalışır gibi öneriyor kanıt artan nörovasküler açıkları ilerleme ve reklam5, şiddeti bir rol oynamaktadır. Aβ da reklam hastalar ve fare modelleri9,10,11Aβ yataklarında yerelleştirir fibrinojen7,8, yüksek-benzeşme etkileşim vardır. Ayrıca, Aβ-fibrinojen etkileşim anormal fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı, aynı zamanda direnç fibrinolitik9,12neden olmaktadır. Reklam, tedavisinde bir tedavi imkanı hafifletilmesi dolaşım açıkları Aβ ve fibrinojen13,14arasındaki etkileşimi engelleyerek. Biz, bu nedenle, birkaç küçük bileşikler yüksek aktarım tarama ve tıbbi Kimya yaklaşımlar13,14kullanarak Aβ-fibrinojen etkileşim inhibe tespit. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri etkinliğini test etmek için biz iki yöntem vitro fibrin pıhtısı oluşumu analizi için en iyi duruma getirilmiş: pıhtısı bulanıklık tahlil ve Tarama elektron mikroskobu (SEM)14.
Pıhtı bulanıklık tahlil fibrin pıhtısı oluşumu UV-görünür spektroskopi kullanarak izlemek için düz ileri ve hızlı bir yöntemdir. Fibrin pıhtısı formlar, ışık giderek dağınık ve çözüm bulanıklık artar. Diğer taraftan, Aβ olmadığı durumlarda, fibrin pıhtısı yapısı değişmiş ve karışım bulanıklık azalır (Şekil 1). İnhibitör bileşiklerin etkisi pıhtı bulanıklık Aβ kaynaklı anormallikler geri yüklemek için potansiyel için tespit edilebilir. Bulanıklık tahlil birden çok koşul hızlı analiz için izin verirken, pıhtı şekli ve yapısı üzerinde sınırlı bilgi sağlar. SEM, katı cisimlerin topografya elektron sonda tarafından kendiliğinden ortaya sağlar pıhtı15,16,17,18 3D Mimarlık ve nasıl bir değerlendirme analizi için Aβ varlığı ve / veya inhibitör bileşikler o yapısı9,14değiştirir. Her iki spektrometresi ve SEM çeşitli amaçlar için kullanılan klasik laboratuvar teknikleri vardır, mesela spectrophotometry amiloid toplama19,20izlenmesi için kullanılır. Benzer şekilde, SEM Ayrıca Parkinson ve tromboembolik inme hastalarında21,22,23Alzheimer, plazma oluşan fibrin pıhtısı analiz etmek için kullanılır. Burada sunulan protokolleri fibrin pıhtısı oluşumu tekrarlanabilir ve hızlı bir şekilde değerlendirmek için optimize edilmiştir.
Aşağıdaki iletişim kuralı bir vitro fibrin-pıhtı ile ve ezelî Aβ hazırlanması için yönergeler sağlar. Ayrıca fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı üzerinde Aβ etkisini analiz yöntemleri ayrıntıları. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibisyonu ölçmek için bu iki yöntem etkinliğini TDI-2760, küçük bir inhibitör bileşik14kullanarak gösterilmiştir. Bu yöntemler, ayrı ayrı ve birlikte, hızlı ve basit bir analiz vitro fibrin pıhtısı oluşumu için olanak sağlar.

<table><tbody><tr><td>Fibriojen, Plazminojen Tükenmiş, Plazma</td><td>EMD Millipore</td><td>341578</td>, <td>neme maruz kalmayı önlemek için kapak parafilmini sarılı tutar</td></tr><tr><td>Beta-Amiloid (1-42), İnsan</td><td>Anaspec</td><td>AS-20276</td><td></td></tr><tr><td>İnsan plazmasından trombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Heksafloro-2-propanol,% 99'a eşit veya daha büyük</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>105228</td><td></td></tr><tr><td>DİMETİL SÜLFOKSİT (DMSO), STERİL FİLTRELİ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fischer Scientific</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fischer Scientific</td><td>C70</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Şırıngası, 0.2 & M, 25mm</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Millex Steril Şırınga Filtreleri, 0,1 um, PVDF, 33 mm çap.</td><td>Kırlangıç</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Katı 96 Kuyulu Plakalar Yüksek Bağlayıcı Sertifikalı Düz Tabanlı</td><td>Fischer Scientific</td><td>21377203</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax Plus384</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>89212-396</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj, 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Branson 200 Ultrasonik Temizleyici</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-337-22</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar Döndürücü</td><td>Thermo Scientific</td><td>2314-1CEQ</td><td></td></tr><tr><td>Kapak kayma tutucu için yedek pullar</td><td>Tousimis</td><td>8766-01</td><td></td></tr><tr><td>Dar Saplı Pipetler - Sedi-Pet</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td><td>70967-13</td><td></td></tr><tr><td>CPD için numune tutucu (Kapak kayma tutucusu)</td><td>Tousimis</td><td>8766</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Tutucu Kutusu, Pin Tipi Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td><td>76610</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak cam kapaklı kızaklar (12 mm)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-277</td><td></td></tr><tr><td>%10 Gluteraldehit Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>Na Kakodilat Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>SEM Saplamaları, Konik uç iğne.</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td><td>75192</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Sekmeleri, Karbon İletken Sekmeler, 12mm OD</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td></td></tr><tr><td>Autosamdri-815 Kritik Nokta Kurutucu</td><td>Tousimis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denton Desk IV Altın/Paladyum hedefli</td><td>Kaplayıcı Denton Vakum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leo 1550 FE-SEM</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akıllı SEM Yazılımı</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> ·

β-amiloid-indüklenen anormallikler fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama analizi

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Bu makale in vitro fibrin pıhtısı oluşturma ve beta-amiloid (Aβ) protein pıhtı oluşumu ve yapısı üzerinde etkisi spektrometresi tarafından analiz ve elektron mikroskobu (SEM) tarama yöntemleri sunar. Aβ nörotoksik amiloid toplamları Alzheimer hastalığı içinde (Ah) formları, fibrinojen ile etkileşim göstermiştir. Bu Aβ-fibrinojen etkileşim fibrin pıhtısı yapısal anormal ve fibrinolitik dayanıklı yapar. Fibrin pıhtılaşma bozuklukları Aβ kaynaklı Ayrıca serebrovasküler yönleri gibi microinfarcts, reklam patoloji ile katkıda inflamasyonu yanı sıra, serebral amiloid angiopathy (CAA). Nörovasküler açıkları potansiyel olarak kritik rolü AD patolojisi göz önüne alındığında, inhibe veya Aβ-fibrinojen etkileşimi azaltmak bileşikleri gelişmekte umut verici tedavi değeri vardır. Kolayca ve sistematik olarak tarafından hangi fibrin pıhtısı oluşumu tespit edilebilir vitro terapötik bileşiklerin geliştirmek için potansiyel olarak yararlı araçlar yöntemlerdir. Burada sunulan bir en iyi duruma getirilmiş Aβ ve Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri etkisini analiz yanı sıra fibrin pıhtısı vitro nesil için iletişim kuralıdır. Pıhtı bulanıklık tahlil hızlı, son derece tekrarlanabilir ve aynı anda birden çok koşul sınamak için Aβ-fibrinojen inhibitörleri çok sayıda tarama için izin kullanılabilir. Bu tarama hit bileşikleri yeteneklerini Aβ kaynaklı yapısal anormallikler SEM kullanarak fibrin pıhtısı mimarisinin iyileştirmek için daha fazla değerlendirilebilir Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları etkinliği burada TDI-2760, yakın zamanda belirlenen Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörü kullanarak gösterilmiştir.

(Bulanıklık) tahlil pıhtılaşma vitro , fibrinojen, fibrin ağı24oluşumunda kaynaklanan enzim Trombin cleaves. Bu fibrin pıhtısı oluşumu artan bulanıklık (Şekil 1), (Şekil 2, yeşil) okuma süreniz bitmeden karıştırmadan sonuçlanan çözüm, buradan geçen ışık saçılma neden olur. Fibrinojen Aβ42 huzurunda inkübe zaman çözüm bulanıklık azalmıştır, kabaca yarısı maksimum yüksekliğe ulaşan eğrisi ile fibrin...

Burada sunulan tek tek veya birlikte fibrin pıhtısı yapısı üzerinde beta-amiloid etkisini analiz için kullanılan iki yöntem vardır. Vitro fibrin pıhtısı oluşturma takip için pıhtı bulanıklık ve Tarama elektron mikroskobu ile yöntemleri dahil bir protokoldür.

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Bu plaka tabanlı bulanıklık testinin en büyük avantajı hızlı olması ve birkaç amiloid-beta fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin gelişmiş kurulum veya gereksinimler olmadan aynı anda taranmasını sağlamasıdır. Fibrin türbiditesi testinde bulunan kafa bileşikleri, elektron mikroskobu taranarak analiz edilen fibrin pıhtılarında A-beta kaynaklı yapısal anormalliği geri getirme yetenekleri açısından daha fazla değerlendirilebilir. Taramalı elektron mikroskobu analizi için pıhtı hazırlığının görsel gösterimi, hazırlıktaki herhangi bir varyasyonun deneysel sonuçlardaki varyasyonlara katkıda bulunabileceğinden kritik öneme yöneliktir.Bu gösterinin odak noktası A-beta fibrinojen etkileşimleridir. Bu protokol kolayca fibrin pıhtısı ile diğer proteinler ve bileşikler ile diğer etkileşimleri analiz etmek için değiştirilebilir. Her A-beta negatif 42 içeren ve kontrol kuyuları içeren ve kontrol kuyuları ve oda sıcaklığında dönen bir platform üzerinde plaka kuluçka ya da pıhtı oluşumu tampon 200 mikrolitre taze hazırlanmış fibrinojen 1.5 mikromolar ekleyerek başlayın.30 dakika sonra aynı anda pıhtı oluşumunu başlatmak için doğrudan fibrinojen içeren kuyunun merkezine taze hazırlanmış trombin çöze

analysis-amyloid-induced-abnormalities-on-fibrin-clot-structure

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kaynak: Balczon, R., ve diğerleri. Pulmoner Endotel Hücrelerinin Pseudomonas aeruginosa Tarafından Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidleri Saptama Yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, amiloid beta tabaka yapılarına bağlanan bir floresan boya olan tiyoflavin T kullanılarak, virülan bakterilerle enfekte olmuş pulmoner endotel hücrelerinden alınan kültür süpernatantlarındaki amiloidleri ölçmek için protokolü göstermektedir. Başlangıca kıyasla floresandaki bir artış, kültür süpernatanında...

Bakteriyel Enfeksiyona Bağlı Amiloidlerin Tiyoflavin T Floresansı Kullanılarak Ölçülmesi

Bu videoda, floresan görüntüleme için ışıldayan konjuge oligotiken boyası - heptamer-formil tiyofen asetik asit veya hFTAA - kullanarak doku bölümlerindeki amiloidleri boyama tekniği açıklanmaktadır. Amiloidler, β yaprak bakımından zengin anormal protein agregatlarıdır. Doku örneklerinde saptanmaları, amiloid ile ilişkili hastalıkların veya proteinopatilerin tanı ve tedavisinde yardımcıdır.

Amiloid Birikintilerinin hFTAA Boyaması: Doku Kesitlerinde Floresan Görüntüleme için Oligotikofen Bazlı Boya Kullanarak Amiloid Fibrilleri Görselleştirme Tekniği

Bu video, çözelti bulanıklığındaki değişimin bir fonksiyonu olarak çözünmeyen fibrin pıhtısı oluşumunu izlemek için UV görünür bir spektrofotometrenin kullanımını göstermektedir. UV görünür spektrofotometre, çözeltinin zaman içindeki absorbansını ölçer, bu da çözünmeyen fibrin pıhtısı oluşumundan kaynaklanan bulanıklık değişimini temsil eder.

Fibrin pıhtı oluşumunu izlemek için UV görünür spektroskopi

Kaynak: Nyström, S., et al., Hiperspektral Konfokal Mikroskopi ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme ile Lüminesan Konjuge Oligotikofenlerle Boyanmış Amiloid Dokularının Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017). Bu video, amiloid organizasyonunu yansıtan renk kodlu görüntülerde kompakt çekirdekleri mavi/yeşil ve kararsız çevre birimlerini kırmızı/sarı olarak ortaya çıkarmak için hFTAA boyası kullanarak floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu veya FLIM ile amiloid yapılarının analiz edilmesini...

Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanılarak Bir Doku Bölümündeki Amiloid Yapılarının Analiz Edilmesi

Bu yazıda, hastalıklı durumlara bağlı normal ve anormal pıhtı yapıları arasındaki morfolojik farklılıkları incelemek için kan hazırlama, konfokal mikroskopi ve lizis hızı analizi gibi deneysel teknikler sunulmaktadır.

Normal ve Hastalıklı Devletleri&#39;nde Fibrin pıhtısı Yapıları incelenmesi için deneysel ve Görüntüleme Teknikleri

Amiloid birikimi farklı hastalıklar özelliğidir ve birçok farklı organları afflicts. Bu kağıt Işıksaçan konjuge oligothiophene floresan Floresans mikroskobu teknikleri ile birlikte boyama uygulaması açıklanır. Bu boyama yöntemi algılama ve klinik ve bilimsel kurulumları protein toplamları keşfi için güçlü bir araç temsil eder.

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Basit yöntem pulmoner endotel enfeksiyonu takip sitotoksik amyloids üretimini gösteren için Pseudomonas aeruginosatarafından açıklanmıştır.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Moleküler görüntüleme matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma tabanlı görüntüleme kütle spektrometresi (maldı-IMS) ile birden çok analitler eş zamanlı haritalama biyolojik örnekleri sağlar. Burada, Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid angiopathy örnekleri maldı-IMS kullanarak beyin dokuları algılama ve görselleştirme amiloid β protein için bir iletişim kuralı mevcut.

Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme

Kütle spektrometrisine dayalı proteomik analiz ile bu biyokimyasal saflaştırma yöntemi, Alzheimer hastalığını önleme hedeflerinin belirlenmesini hızlandırabilecek amiloid fibril çekirdeklerinin sağlam karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Bu çalışma, pıhtı eritme, hücre boyama ve rutin kan muayenesi yoluyla serebral kan pıhtılarının hücre bileşen analizi için hızlı ve etkili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Serebral Kan Pıhtılarının Hücre Bileşenlerini Analiz Etmek İçin Kapsamlı Bir Yaklaşım

Amiloid fibriller çok sayıda proteinden oluşur ve ortaya çıkan fibriller "çapraz β tabaka" yapısını paylaşır. Burada, amiloid fibril örneklerin X-ışını lifi kırınımı için nasıl hazırlanabileceğini ve desenlerin nasıl analiz edilebileceğini açıklıyoruz.

Amiloid ve Çapraz Beta Mimarisi

Öğrenin beta-amiloidin fibrin pıhtı yapısına etkisini türbidite ölçümü ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etme yöntemlerini. Bu protokoller nörodejeneratif hastalık mekanizmalarını anlamak için hızlı tarama ve yapısal değerlendirme sağlar.

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Daha fazla video keşfet