β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi
30 Kasım 2018
Burada sunulan tek tek veya birlikte fibrin pıhtısı yapısı üzerinde beta-amiloid etkisini analiz için kullanılan iki yöntem vardır. Vitro fibrin pıhtısı oluşturma takip için pıhtı bulanıklık ve Tarama elektron mikroskobu ile yöntemleri dahil bir protokoldür.
Bu plaka tabanlı bulanıklık testinin en büyük avantajı hızlı olması ve birkaç amiloid-beta fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin gelişmiş kurulum veya gereksinimler olmadan aynı anda taranmasını sağlamasıdır. Fibrin türbiditesi testinde bulunan kafa bileşikleri, elektron mikroskobu taranarak analiz edilen fibrin pıhtılarında A-beta kaynaklı yapısal anormalliği geri getirme yetenekleri açısından daha fazla değerlendirilebilir. Taramalı elektron mikroskobu analizi için pıhtı hazırlığının görsel gösterimi, hazırlıktaki herhangi bir varyasyonun deneysel sonuçlardaki varyasyonlara katkıda bulunabileceğinden kritik öneme yöneliktir.
Bu gösterinin odak noktası A-beta fibrinojen etkileşimleridir. Bu protokol kolayca fibrin pıhtısı ile diğer proteinler ve bileşikler ile diğer etkileşimleri analiz etmek için değiştirilebilir. Her A-beta negatif 42 içeren ve kontrol kuyuları içeren ve kontrol kuyuları ve oda sıcaklığında dönen bir platform üzerinde plaka kuluçka ya da pıhtı oluşumu tampon 200 mikrolitre taze hazırlanmış fibrinojen 1.5 mikromolar ekleyerek başlayın.
30 dakika sonra aynı anda pıhtı oluşumunu başlatmak için doğrudan fibrinojen içeren kuyunun merkezine taze hazırlanmış trombin çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin ve hemen 350 nanometre de in vitro pıhtıların emici okuyun, 10 dakika boyunca her 30 ila 60 saniyede bir ölçüm tekrarlayın. A-beta fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin fibrin pıhtı yapısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için, ilk olarak temiz, 12 milimetre silikonlu cam daire kapağını 12 kuyunun ayrı kuyularına yerleştirmek için forseps kullanın ve her kapak kapağına 80 mikrolitre fibrinojen ekleyerek çözeltiyi eşit olarak dağıtılır. Pıhtı oluşumunu başlatmak için her kuyuya 20 mikrolitre trombin çözeltisi ekleyin.
Oda sıcaklığında 30 ila 60 dakikalık bir kuluçka için plakayı kapatın, sonra her pıhtıyı iki mililitre buz gibi sodyum kacodylate tamponuna iki dakika batırın, oda sıcaklığında iki kez, her yıkamadan sonra tamponu dikkatlice çıkarmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, kapak kayma pıhtı oluşumudurumunu kontrol edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde buz üzerinde buz üzerinde 2-3 mililitre buz pıhtıları düzeltmek. Kuluçka sonunda, yavaşça her kuyudan glutaraldehit kaldırmak ve taze sodyum kacodylate tampon ile pıhtıyı yıkayın buz üzerinde gösterildiği gibi.
Beş dakikalık buz gibi etanol bir dereceli serisi sabit pıhtıları nemlendirmek için tamamen pıhtıları hava maruz kalma dan korumak için yıkayımı arasında etanol çıkarmadan buz üzerinde yıkarsın. Son %100 etanol yıkama sırasında, kapak kaydığı kritik bir nokta kurutucu numune tutucuya aktarın, her kapak fişi arasına en az 1 yıkayacak makinesi yerleştirin ve tutucuyu etanol dolu kritik bir nokta kurutucu haznesine yerleştirin. 30 dakikalık bir kurutma döngüsünden sonra, tek tek taramalı elektron mikroskobu koçanları üzerine kapak fişleri monte etmek için karbon bandı kullanın ve örnekleri vakum püskürtücü kaplama odasına aktarın.
Daha sonra 20 nanometreden daha az altın paladyum veya diğer iletken malzemelerin numuneler üzerine saniyede dört angstrom'da 25 saniye boyunca fışkırtMası ve numuneleri dört kilovoltta tip iki ikincil elektron dedektörü ile donatılmış bir tarama elektron mikroskobu üzerinde görüntüle. Fibrin pıhtı oluşumu çözeltiden geçen ışığın saçılmasına neden olur ve okuma döneminin sonunda yaylaların bulanıklıkta artışa yol açar. Fibrinojen A-beta 42 varlığında inkübe edildiğinde çözeltinin bulanıklığı eğrinin sadece fibrinojenin yaklaşık yarısı kadar maksimum yüksekliğe ulaşmasıyla azalır.
Bir A-beta 42 etkileşim blokeri varlığında beta-amiloid etkisi iyilenir ve bulanıklık sadece A-beta ile daha yüksektir. A-beta olmadığında bileşiği fibrin pıhtı bulanıklığını değiştirmediği için blokerin etkisi arka plan bulanıklığı ndan dolayı görünmez. Ayrıca, GPRP varlığında pıhtı oluşumu, fibrin polimerizasyonu ile müdahale bilinen bir peptid, inhibitörü yokluğunda fibrin pıhtı oluşumuna göre önemli ölçüde azaltılmış bulanıklık göstermektedir.
Trombin ve kalsiyum klorür varlığında üretilen fibrinojen sadece fibrin uzun ve intercalated iplikleri yanı sıra daha büyük demetleri ile bir fibrin mesh oluşturur. A-beta mevcut olduğunda, fibrin iplikleri agregalarda birkaç yapışkan kümeler ile ince oldu, A-beta indüklenen yapısal anormallikleri gösteren. Bulanıklık tahsin sonuçları ile tutarlı olarak, Bir A-beta fibrinojen etkileşim bloker varlığında pıhtı oluşumu kısmen daha az kümeleri bu tedavi ile gözlenen olarak A-beta kaynaklı değişikliklerden fibrin pıhtı yapısını geri.
Pıhtı bulanıklığı testi ve taramalı elektron mikroskobu analiz protokolleri, birkaç A-beta fibrinojen etkileşim inhibitörünü hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmek için optimize edilmiştir. Ve yakında veriler hem in vitro hem de in vivo ileri çalışmalara uygulanabilecek fibrin pıhtı oluşumu hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, in vitro fibrin pıhtısı protokolü ile pıhtı bulanıklığı ve taramalı elektron mikroskobu yöntemlerini içeren, beta-amyloidin fibrin pıhtı yapısı üzerindeki etkisini analiz etmeye yönelik yöntemleri sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Beta-amiloid, nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır.
- Fibrin pıhtıları çeşitli biyolojik süreçlerde yer alır.
- Fibrin pıhtı yapısının anlaşılması, hastalık mekanizmalarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Önceki çalışmalar, A-beta nedeniyle fibrin pıhtılarında yapısal anomaliler olduğunu göstermiştir.
Çalışmanın Amacı
- Beta-amiloidin fibrin pıhtı yapısı üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Amiloid-beta fibrinojen etkileşimlerinin inhibitörlerini taramak.
- Taramalı elektron mikroskobu analizi için pıhtı hazırlama sürecini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Hızlı tarama için plaka tabanlı bulanıklık deneyi.
- Fibrinojen kullanılarak in vitro fibrin pıhtılarının hazırlanması.
- Pıhtı yapısını analiz etmek için taramalı elektron mikroskobu.
- Diğer protein etkileşimlerini incelemek için protokollerin modifikasyonu.
Ana Sonuçlar
- Yapısal bütünlüğü geri kazandıran öncü bileşiklerin belirlenmesi.
- Pıhtı hazırlığının görsel olarak gösterilmesi, tutarlılık açısından kritik öneme sahiptir.
- Hazırlamadaki farklılıklar deneysel sonuçları etkileyebilir.
- Protein etkileşimlerinin incelenmesinde daha geniş uygulama potansiyeli.
Sonuçlar
- Sunulan yöntemler, fibrin pıhtı yapısının analizi için etkilidir.
- İnhibitörlerin taranması, terapötik stratejilere dair öngörüler sağlayabilir.
- İleri araştırmalar, diğer proteinlerin etkileşimleri konusunda kapsamı genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu protokol, plaka tabanlı bir türbidite analizi kullanarak amiloid-beta fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin hızlı ve tekrarlanabilir şekilde taranmasını sağlayarak, Alzheimer hastalığı terapötik geliştirme sürecindeki erken aşama hedef doğrulamasını destekler. Yöntem, kantitatif pıhtı oluşumu verileri ve taramalı elektron mikroskobu aracılığıyla yapısal doğrulama sağlayarak, A-beta kaynaklı fibrini pıhtı anormalitelerini iyileştiren bileşiklerin hit-to-lead sürecine geçişini kolaylaştırır. Türbidite okumalarını SEM görüntüleme ile entegre eden bu yaklaşım, nörovasküler hedefli keşif programları için mekanistik risk azaltma ve öngörü güvenilirliği sunar.
Biyofarmasötik Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: A-beta-fibrinogen etkileşiminin Alzheimer hastalığında patolojik pıhtı oluşumunu tetiklediği yönündeki terapötik hipotezi sorgular.
- Operasyonel Değer: A-beta-fibrinogen bağlanma inhibisyonunun doğrudan bir çıktısı olarak pıhtı bulanıklığını ölçerek fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Normal fibrin pıhtı yapısını geri kazandıran bileşiklerin belirlenmesi yoluyla hedef etkileşimini ve biyolojik risk azaltmayı göstererek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Optimize edilmiş bulanıklık analizi hızlıdır, yüksek düzeyde tekrarlanabilirliğe sahiptir ve geniş bileşik kütüphanelerinin taranması için çok kuyucuklu plaka formatlarıyla uyumludur.
- Kantitatif Çıktı: Zamanla 350 nm'de absorbansı ölçerek, inhibitör etkinliğini arka plan etkilerinden ayıran kinetik pıhtı oluşum verileri sağlar.
- Yapısal Doğrulama: Bulanıklık taramasından elde edilen hit bileşikler, fibrin pıhtı mimarisinin restorasyonunu görselleştirmek için SEM kullanılarak doğrulanır ve böylece hitlerin analiz artefaktı olmadığı garanti edilir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık İlgisi: A-beta'yı mikroinfarktlar ve serebral amiloid anjiyopati ile ilişkili fibrin pıhtı anomalilerine bağlayarak, Alzheimer patolojisinin serebrovasküler bir mekanizmasını modeller.
- Translasyonel Süreklilik: İn vitro hedef etkileşimini (bulanıklık) fenotipik pıhtı yapısıyla (SEM) ilişlendirerek, in vivo doğrulama öncesinde mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Pıhtı oluşum gecikmesinin inhibisyonu ve yapısal anomalilerin geri döndürülmesi şeklindeki ikili kriterlere dayalı go/no-go (devam/tamam) kararlarına olanak tanır.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu yöntem, A-beta-fibrinojen etkileşiminin ilaçla hedeflenebilir bir hedef olarak hipotez testine olanak tanıyarak erken keşif sürekliliğine uyum sağlar ve elde edilen çıktılar öncü bileşik belirleme ile preklinik doğrulama iş akışlarına aktarılır.
- Keşif Biyolojisi: A-beta'nın fibrin pıhtı bulanıklığını ve yapısını nasıl değiştirdiğini nicelleştirerek hipotez testlerini destekler ve nörovasküler disfonksiyondaki yolak katılımını netleştirir.
- Tarama: 96 kuyucuklu plaka formatında A-beta-fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin yüksek kapasiteli değerlendirmesi için analiz hazırlığı ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Analitikler: Bileşiklerin pıhtı oluşumu ve mimarisi üzerindeki etkilerinin karşılaştırmalı analizine olanak tanıyan bulanıklık kinetiği ve SEM tabanlı yapısal metrikler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hedef inhibisyonunu fenotipik pıhtı restorasyonu ile ilişkilendirerek, nörovasküler Alzheimer modelleri için preklinik süreklilikle uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Bulanıklık-SEM iş akışı, A-beta'nın ötesindeki diğer protein-fibrinojen etkileşimlerine uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir platformdur ve geniş hedef doğrulama çalışmalarını destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Biyokimyasal inhibisyonu yapısal pıhtı geri kazanımı ile ilişkilendirerek, hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltır ve öngörüsel güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Optimize edilmiş pıhtı hazırlama, yıkama, fiksasyon ve görüntüleme protokolleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Hem fonksiyonel (bulanıklık) hem de yapısal (SEM) doğrulama gerektirerek go/no-go karar kalitesini artırır ve geç aşamadaki biyolojik riski azaltır.
- Portföy Etkisi: Pıhtı oluşum gecikmesi ve yapısal patolojinin çift yönlü düzeltmesini gösteren inhibitörlerin riskle uyumlu önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Protein hazırlama, pıhtı oluşum analizleri ve taramalı elektron mikroskobu örnek hazırlama konularında uzmanlık gerektirir.
- 350 nm'de kinetik absorbans ölçümleri yapabilen bir plaka okuyucuya ve SEM görüntüleme kapasitesine sahip bir vakum püskürtme kaplama cihazına erişime bağlıdır.
- SEM yorumlamasını bozabilecek yapısal artefaktları önlemek için pıhtı fiksasyonu,dehidratasyon ve kurutma adımlarının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Protokolün diğer protein-fibrinojen etkileşimlerine genişletilmesi durumunda, özellikle tampon bileşimi ve inkübasyon süreleri konusunda adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Taze reaktif hazırlama gereksinimi ile havaya maruz kalma veya tutarsız yıkama nedeniyle oluşabilecek pıhtı değişkenliğini önlemek için dikkatli taşıma gibi pratik kısıtlamaları kapsar.
