Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için
18 Ocak 2019
Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.
Bu yöntem, duyusal iletim, nosiseptif regülasyon ve kronik ağrı veya ağrı gelişimi altında yatan spinal mekanizmaları nnetilmesine yardımcı olabilir Bu tekniğin ana avantajı ideal nöronal korunmasına izin verebilir ve belirli bir ölçüde in-vivo koşulları taklit edebilirsiniz. Bir kılcal puller kullanarak borosilikat cam mikrokapiller kayıt elektrotları çekerek başlayın. Daha sonra, 2,0 santimetre agar blok tarafından 1,5 santimetre 1,2 santimetre hazırlamak için erimiş agar ile bir kalıp doldurun.
Enine bölümler planlıyorsanız, bloğu merkezi bir kanala sahip olacak şekilde kırpın. Ya da parasagittal kesitler için bloğun kenarı ile bir kanal eti. Transkardiyal profüzyon ve omurilik ekstraksiyonundan önce 500 mililitre sakaroz bazlı ACSF hazırlayın.
Çözeltiyi buz soğuğuna soğutun ve %95 O2 ve %5 CO2 ile dengeleyin. Buz üzerindeki tüm diseksiyon araçlarını soğutun. Kaudal'dan rostral'a kadar arka deride beş santimetrelik uzunlamasına bir kesi yapın.
Sonra, her iki tarafta omurga ve kaburga arasında göğüs kafesi ile kesti. Omurganın kaudal ucunda bir kesim yapmak için makas kullanın. Sonra çevreleyen dokuları kesip hızlı bir şekilde omurganın lumbosacral segmenti izole.
Lumbosakral segmenti buz gibi sakaroz bazlı ACSF içeren cam bir tabağa aktarın. Ventral tarafı yukarı doğru ile, vertebral pedikül ile iki taraflı kesmek ve dikkatle omurilik maruz ince makas kullanın. Lumbosakral genişleme ile omuriliğin iki santimetre uzunluğundaki bölümünü izole edin ve omurilik bölümünü soğuk sakaroz ACSF ile dolu başka bir cam tabağa aktarın.
Menenjler ve pia araknoid membran kaldırmak için bir diseksiyon mikroskop altında çalışın. Mümkün olduğunca çabuk uzak tüm ventral ve dorsal kökleri kesin. Menenjler ve omurilik kökleri çıkarırken omurilik, özellikle dorsal boynuz yaralanmasını önlemek için özen gösterin.
Daha önce kesilmiş agar blok üzerinde omurilik yerleştirin. Enine dilimler hazırlamak için, omuriliğin ventral tarafını sırt tarafı ile agar'a saplayın. Parasagittal dilimler hazırlamak için, ventral tarafı süper yapıştırıcı ile agar'a dikey yönde takın.
Sonra, superglue ile bir vibratom bir platforma agar blok monte. Ve saniyede 0,025 milimetre ve titreşim frekansı 80 Hertz gelişmiş bir hız ile 300 ila 500 mikron enine veya parasagittal dilimler hazırlayın. Omurilik dorso-ventrally dilimlenmiş olmalıdır.
En iyi sonuçlar için dilim 15-20 dakika içinde hazırlanmalıdır. Omurilik kalınlığı hücre görünürlüğünü karşılamak için en fazla 600 mikron olmalıdır. Dilimleri 32 santigrat derecede sürekli oksijenli ACSF içeren bir depolama odasında naylon kafesüzerine aktarmak için plastik kesilmiş pipet kullanın.
Substantia jelatinosa veya SG nöronlardan tam hücre yama kıskaç kayıtları yapmak için, sadece inhibitör post-sinaptik akımların kaydı için sezyum katyon bazlı çözelti uygularken kayıt için potasyum iyon bazlı hücre içi solüsyonlar kullanın. Omurilik dilimini yavaşça kayıt odasına taşıyın. Ve sonra optimum dilim stabilitesi için naylon iplikleri ile U şeklinde platin tel ile sıkıca stabilize.
Oda sıcaklığında kabarcıklı ACSF ile sürekli bol dilim ve yeterli oksijenasyon elde etmek için dakikada 2-4 mililitre profüzyon oranı ayarlayın. Daha sonra, düşük çözünürlüklü mikroskop lens kullanarak, yarı saydam bir bant olarak SG nöronların bölge belirlemek. Yüksek çözünürlüklü hedefi kullanarak hedef hücre olarak parlak ve pürüzsüz bir membran ile üç boyutlu bir şekil ile karakterize sağlıklı bir nöron seçin ve video monitör ekranın ortasına ayarlayın.
Bir mikro pipeti uygun miktarda potasyum iyon bazlı veya sezyum iyon bazlı hücre içi solüsyonile doldurun. Daha sonra mikro pipeti elektrot tutucuya takın ve hücre içi çözeltinin tutucunun içindeki gümüş telle temas ettiğinden emin olun. Mikro pipeti odak haline getirin ve mikromanipülörü kullanarak ACSF'ye daldırın.
Herhangi bir kir ve enkaz uzak zorlamak için hafif bir pozitif basınç uygulayın. Yavaş yavaş hedeflenen nörona doğru mikro pipet hareket ettirin. Pipet nörona yaklaştıktan sonra nöronal membranda çok küçük bir gamze oluşur, bir gigaseal oluşturmak için pozitif basınç bırakın.
Bir hücrenin fizyolojik istirahat membran potansiyeline yakın eksi 70 milivolt, tutma potansiyelini değiştirin. Daha sonra, membran yırtmak ve iyi bir bütün hücre yapılandırmaoluşturmak için mikro pipet geçici ve nazik emme uygulayın. Her bir nöronun ateşleme paternini, istirahat membran potansiyelinde 25 pikoamp artışlı 25 ila 150 pikoamptan oluşan bir dizi ikinci bir depolarize akım darbeserisiyle mevcut kıskaçta test ederek atış özelliklerini kaydedin.
Somatik alt eşik akımlarını kaydetmek için membran potansiyelini voltaj kelepçesi modunda eksi 50 milivolt olarak tutun ve ardından eksi 60 milivolttan eksi 120 milivolta kadar bir saniyelik hiperpolarize voltaj darbeleri uygulayın. Eksi 70 milivolt tutma potansiyelinde voltaj kelepçesi modunda potasyum iyon bazlı hücre içi çözeltiile uyarıcı post-sinaptik akımları kaydedin. IPSC'nin sezyum iyon bazlı hücre içi solüsyonu kullanarak IPSC'leri kaydedin.
Membran potansiyelini eksi 70 milivoltta yaklaşık beş dakika tuttuktan sonra, yavaş yavaş tutma potansiyelini sıfır milivolta çevirin. Sabitleme için birkaç dakika bekleyin ve ardından IPSC olaylarını kaydetmeye başlayın. Dinlenme membran potansiyelinde bir SG nörona bir dizi saniyelik depolarize akım darbeleri enjekte edilerek belirlenen ateşleme desenleri tonik ateşleme, gecikmeli-ateşleme, boşluk atışı, ilk patlama, phasik patlama, tek ani ve isteksiz-ateş olarak sınıflandırılabilir.
Bu resim, voltaj kıskacındaki eşik altı akımlar için çağrıştıran protokolü gösterir. Bu temsili izler, IH, IA ve BT olarak sınıflandırılan hiperpolarize akım enjeksiyonuna verilen yanıtı göstermektedir. Bu SEPSC'nin SG nöronlarından eksi 70 milivoltluk 50 mikromolar APV ve 20 mikromolar CNQX varlığında kaydedilmiş temsilcisi bir izdir. Bu izleme, genişletilmiş bir zaman ölçeğinde APV ve CNQX eklenmesinden önce kaydedilen SEPC'leri gösterir.
Bu prosedürü takiben eşleştirilmiş yama kıskaç kayıtları veya optogenetik gibi yöntemler substantia jelatinosa belirli nöronal mikrodevreler karakterize gibi ek sorulara cevap olarak yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, in vitro omurilik kesitlerindeki substantia gelatinosa (SG) nöronlarından tüm hücre patch-clamp kayıtlarının gerçekleştirilmesine yönelik prosedürleri özetlemektedir. Bu yöntemi kullanan araştırmacılar; SG nöronlarının intrinsik membran özelliklerini, sinaptik iletimini ve morfolojik karakteristiklerini inceleyebilmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Substantia gelatinosa, duyusal işlemenin ve ağrı düzenlemesinin anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir.
- Tüm hücre yama kenetleme (whole-cell patch-clamp), bu nöronların elektrofizyolojik özelliklerini aydınlatabilir.
- Bu yöntem, nöronal korunmayı artırır ve in vivo koşulları simüle eder.
- SG nöronlarının anlaşılması, kronik ağrı mekanizmalarına dair içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Omurilik kesitlerinde patch-clamp kayıtları için metodolojiyi tanımlamak.
- SG nöronlarının doğal özelliklerini incelemek.
- Ağrı mekanizmalarıyla ilişkili sinaptik iletimi araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- In vitro spinal kord dilimleri üzerinde gerçekleştirilen tüm hücre yama kenetleme (whole-cell patch-clamp) kayıtları.
- Biyolojik model, substantia gelatinosa nöronlarına odaklanmaktadır.
- Metinde herhangi bir multiomik iş akışından bahsedilmemektedir.
- Kritik adımlar; sükroz bazlı bir ACSF hazırlama, spinal kord segmentini izole etme ve dokuyu belirli zaman kısıtlamaları dahilinde dilimlemeyi içerir.
- Kayıt teknikleri, tutma potansiyellerinin ayarlanmasını ve mikroskop altında nöronal özelliklerin tanımlanmasını içerir.
Temel Sonuçlar
- Çalışma, SG nöronlarının tanımlanması ve bunlardan kayıt alınması için bir protokol sunarak, bu nöronların elektrofizyolojik özelliklerinin ayrıntılı karakterizasyonuna olanak tanımaktadır.
- Nöronal eksitabilite ve sinaptik dinamikler hakkında bilgi edinmek amacıyla elektrofizyolojik değişiklikler ve ateşleme paternleri analiz edilebilir.
- Temel biyolojik yanıtlar, deneysel koşullara bağlı olarak tonik ateşleme ve diğer ateşleme paternlerinin karakterizasyonlarını içermektedir.
- Yöntem, sinaptik aktivitelere dayalı ağrı modülasyon mekanizmalarının araştırılmasını kolaylaştırmaktadır.
Sonuçlar
- Tanımlanan metodoloji, SG nöron fonksiyonelliğinin araştırılmasına olanak tanır ve ağrı yollarının anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Yöntemin hassasiyeti ve nöronları koruma özelliği, nörobilim araştırmalarındaki uygulanabilirliğini artırmaktadır.
- Bulgular, kronik ağrının ve duyusal iletimin altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu protokol, substantia gelatinosa nöronlarının ayrıntılı elektrofizyolojik karakterizasyonunu sağlayarak ağrı yolu araştırmalarında hedef doğrulamasını destekler. Nöronal bütünlüğü koruyup in vivo koşulları taklit ederek, nosiseptif iletim ve kronik ağrı gelişiminin mekanistik çalışmalarındaki öngörü güvenini artırır. Yöntem, nörobilim odaklı ilaç keşfinin erken aşamaları için kritik olan hipotez testlerini ve yol netleştirmelerini kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Duyusal iletim ve ağrı düzenleme mekanizmalarıyla ilgili terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili devrelerde nöronal eksitabilite ve sinaptik özelliklerini karakterize ederek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Bilimsel Değer: İntrinsik membran özellikleri ve ateşleme modellerinin kantitatif değerlendirmesi yoluyla mekanistik risk azaltımına katkıda bulunur.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşik taramaları için standardize edilmiş analiz sistemlerine olanak tanıyan, spinal kord dilimleri için tekrarlanabilir bir hazırlama yöntemi sağlar.
- Operasyonel Değer: Belirlenmiş zaman ve sıcaklık kısıtlamaları dahilinde dilim canlılığını ve stabilitesini sağlayarak tutarlı elektrofizyolojik okumaları destekler.
- Operasyonel Değer: Analiz son noktaları olarak post-sinaptik akımların ve nöronal ateşleme paternlerinin kantitatif ölçümünü kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Kronik ağrı ve kaşıntı gelişiminin altında yatan spinal mekanizmaları incelemek için hastalıkla ilişkili sistem modellemesi sunar.
- Bilimsel Değer: Elektrofyizyolojik fenotipleri nosiseptif düzenleme yollarıyla ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Operasyonel Değer: Kararlı akım ve voltaj kenetleme kayıtları aracılığıyla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak ağrı araştırmalarında erken dönem bileşik değerlendirmesine temel teşkil eden elektrofizyolojik veriler sunar.
- Keşif Biyolojisi: Doğrudan nöronal kayıt yoluyla omurilik nosiseptif devrelerinde hipotez testini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Bileşik etkisinin değerlendirilmesi için eksitatuar ve inhibitör post-sinaptik akımlar gibi kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Deneysel koşulları karşılaştırmak için ateşleme modellerinin ve eşik altı akımların istatistiksel analizine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Ağrı sinyallerinin insanla ilgili omurilik işlemesini modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tutarlı dilim hazırlama kullanarak ağrı yolağı içindeki birden fazla hedefi incelemek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöronal özelliklerin ve sinaptik iletimin ayrıntılı karakterizasyonu yoluyla hedef etkileşiminde öngörüsel güven.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış dilimleme parametreleri, oksijenasyon protokolleri ve sıcaklık kontrolleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Ağrı yolu modülasyonundaki mekanistik belirsizliği azaltarak devam/dur kararlarına veri sağlar.
- Portföy Etkisi: Bileşiklerin substantia gelatinosa nöronal fonksiyonu üzerindeki etkilerine dayanarak risk ayarlı önceliklendirme imkanı tanır.
Uygulama Hususları
- Başarılı dilim hazırlama ve kayıt işlemleri için elektrofizyoloji, doku diseksiyonu ve mikroskobik görselleştirme konularında uzmanlık gerektirir.
- Vibratom, mikromanipülatör, patch-clamp amplifikatörü ve ACSF oksijenasyon sistemleri dahil olmak üzere enstrümantasyona bağımlıdır.
- Laboratuvarlar arasında dilimleme oryantasyonu, solüsyon kompozisyonu ve zamanlama protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Yöntemin farklı spinal kord segmentlerine veya kemirgen modelleri dışındaki türlere uygulanmasında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Dilim hazırlama için 15–20 dakikalık zaman penceresi ve optimal hücre görünürlüğü için 600-mikron kalınlık kısıtlaması gibi pratik sınırlamalar içerir.
