Name: Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Öğrenin, iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden etiketsiz tek proteinleri gerçek zamanlı olarak nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, biyofizik ve hücre biyolojisi araştırmalarında moleküler düzeyde biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Max Planck toplum, Alexander von Humboldt profesörlük ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181) tarafından desteklenmiştir. Laz388 hücreler sağlamak için ve yararlı tartışmalar için Universitätsklinikum Erlangen Stefanie Schaffer teşekkür ederiz. Biz Simone Ihloff ve Maksim Schwab MPL teknik destek için teşekkür ederiz.

<ol><li>Hathout, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+the+study+of+the+cell+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Approaches to the study of the cell secretome.</a> Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).</li>
<li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).</li>
<li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12454649">Protein microarrays and proteomics.</a> Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).</li>
<li>Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+quality+in+memory+and+protection%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/10.1063/1.1589587">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18229952">Optical biosensors.</a> Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).</li>
<li>Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Single+Protein+Using+a+Nanoplasmonic-Photonic+Hybrid+Microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity.</a> Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).</li>
<li>Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+of+single+non-absorbing+molecules+using+the+surface+plasmon+resonance+of+a+gold+nanorod%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).</li>
<li>Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein+detection+in+crowded+molecular+environments+in+cryo-EM+images%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images.</a> eLife. 6, e25648(2017).</li>
<li>Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Spectroscopy+of+Gold+Nanoparticles+Using+Supercontinuum+White+Light+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy.</a> Physical Review Letters. 93 (3), 037401(2004).</li>
<li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405(2006).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495(2014).</li>
<li>Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+Structure+and+Function+as+Revealed+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).</li>
<li>McDonald, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Single-Cell+Secretion+Dynamics+with+Single-Protein+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity.</a> Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).</li>
<li>Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li>
<li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li>
<li>Spindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0022-3727/49/27/274002/meta">Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002(2016).</li>
<li>Lazarus, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+unique+cell+line+%28LAZ+221%29+from+human+acute+lymphocytic+%28%26%2334%3Bnull%26%2334%3B+cell%29+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic (&#34;null&#34; cell) leukemia.</a> Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).</li>
<li>Mackensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+situ+amplification+of+cytotoxic+T-lymphocytes+with+antitumor+activity+in+a+human+regressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma.</a> Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).</li>
<li>Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471747599.cac012">Primary Culture.</a> Culture of Animal Cells. , (2005).</li>
<li>Dahmardeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDahmardeh%2C+M+%22Unpublished+data%22">Unpublished data</a>. , (2018).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).</li>
<li>Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/biophysj/abstract/S0006-3495(13)04613-4">Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy.</a> Biophysical Journal. 106 (2), 606a(2014).</li>
<li>Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+Label-Free+Nanosensing+and+High-Speed+Tracking+of+Single+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins.</a> Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yararlı iSCAT veri alma için en önemli yönleri biridir yeteneği doğru odak konumuna coverslip yüzeyde ve, Ayrıca, için bulmak için uzun bir süre için bu konumu koruyun. Bunu yapmak başarısız genişletilerek PSFs, zayıf iSCAT sinyalleri ve drift ilişkilendirilmiş yapıların dynamics analizlerde neden olur. Yüzey özellikleri büyük referans ışını arka planı görünür değildir olarak odak düzlemi üzerinde temiz, çıplak coverslip bulma yüzey kolay bir iş olmadığını ortaya çıktı (bkz. Şekil 4 d).
Ham iSCAT görüntüleri kez wavefront kirleri uyarma kaynak kaynaklanan ve doğru görüntüleme uçak bulmak için bir yetenek engel olabilir arka plan sinyalleri tarafından kapatmamasını. Etkin wavefront çıkarma bu sorunu aşmak ve daha sonra sırasında bir ölçüm16iSCAT odak izlemek için kullanışlı bir yoldur. Bunu gerçekleştirmek için bir kayma örnek modülasyon yoludur. Kısacası, bir işlev üreteci bir kayma örnek modülasyon (290 nm genlik) uygulanan frekansta sonuçlanan piezo sahne alanı'nın dış denetim noktasına 50 Hz kare dalga geçerlidir. Zaman uyumlu kamera satın almalar aynı kaynaktan, kilit-in ilkeleri, sonuç wavefront telafi görüntü14,16ile bir araya geldiğinde tetiklenir. Ortaya çıkan görüntü genellikle coverslip (Şekil 4e) yüzey pürüzlülüğü gösterir. Cama temizlendikten sonra kalan küçük özellikler mikroskop odak haline getirmek için kullanılabilir. Bu etkin arka plan çıkarma adım için kullanılan parametreler kare hızı, pozlama süresi veya donanım göre değiştirilebilir.
Yukarıda belirtildiği gibi bir yüksek kaliteli ışın ayırıcı iSCAT kurulum (adım 1.2.1.) kullanılması önerilir, hayalet gibi eserler Imaging olarak veya ince düzlemsel ışın kırma kaynaklanan parazit görüntüyü etkileyecektir ve ölçüm rahatsız. Şekil 7 bir yüksek kaliteli ve düşük kaliteli ışın ayırıcı arasında bir karşılaştırma gösterir. Her iki ham iSCAT görüntüler aynı bölgede kalan bazı parçacıkları içeren coverslip göstermektedir. Aynı iSCAT Kur hem görüntüleri yakalamak için kullanıldı, sadece ışın bölücü değiş tokuş. Şekil 7a gösterir kamerayı bir daha kalın (5 mm), kullanımı ile oluşan görüntü AR kaplı ve kamalı ışını splitter. Kamalı tasarımı sayesinde ışın bölücü arka yüzeyinden yansıyan ışın ön yüzeyinden kaynaklanan yansıma için anti-paralel ve amacı giriyor değil. Hiçbir girişim eserler meydana gelir. Şekil 7b aynı görüş alanı örnek üzerinde gösterir ama bu sefer bir daha ince (1 mm) düzlemsel ışın ayırıcı kullanıldı. Kiriş kırık, ön ve arka yüzeylerden yansımaları iki paralel ve fotoğraf makinesine aktarabilirsiniz. Girişim eserler açıkça görülebilir.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Şekil 7: karşılaştırma iSCAT görüntülerin üretilen yüksek ve düşük kaliteli ışın ayırıcılar ile. 5 mm kalınlığında, AR kaplı ve kamalı ışın ayırıcı kullanımı tarafından (a) Resulting ham iSCAT görüntü. (b) Resulting ham iSCAT görüntü bir 1 mm kalınlığında düzlemsel ışın ayırıcı kullanılarak aynı bölgede. Her iki kiriş kırık aynı bölme oranı (% 50 yansıma, % 50 iletim) vardır. Fresnel Yansımalar gelen doğan girişim eserler açıkça 1 mm kalınlığında düzlemsel ışın splitter ile üretilen resimdeki gözlenir. Ölçek çubukları: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu protokol için o hızlı, kolay gerçekleştirmek ve paralel üzerinde geniş bir alan14algılama için sağlar gibi bir geniş-alan aydınlatma düzeni iSCAT için tarif. Başka bir ortak yaklaşım acousto-optik yansıtıcılar (AODs) kullanın ve örnek12,17confocal bir ışın tarama etmektir. Bu yaklaşım yüksek kaliteli wavefronts engeller ancak daha deneysel olarak geleneksel geniş alanlı görüntüleme daha karmaşıktır. Ayrıca, confocal aydınlatma hız bu AODs tarafından sınırlıdır. İstenen deneysel parametreleri bağlı olarak, ya confocal ya da geniş alanlı aydınlatma düzenleri prensip olarak, canlı hücrelerden salgılanan tek proteinler algılamak için yararlı olabilir.
Boyunca protokolünün anlatıldığı gibi bu örnek sahne yanal mekanik dalgalanmalar mikroskop en aza indirmek için zorunludur. Örnek konumunu bile sapmalar nanometre ardışık kamera çerçeveler farklılığı neden ve önemli yabancı gürültü fark resimdeki teşvik. Bu nedenle bir mekanik olarak istikrarlı mikroskop sahne ve damped optik tablo (adım 1.1.1.) kullanmak için ve optik perde veya paneller ile kurulum (adım 3.5.) bir deney sırasında karşılamak için önerilir.
Bir odağın istikrar düzeni de uzun vadeli ölçülerini düşünülebilir. Bu yaklaşım, ikinci bir lazer bir toplam iç yansıma (tır) düzenlemesi mikroskop dahil ve daha sonra bir çeyreği fotodiyot yansıması. Değişiklikler sistemin odak tır lazer sonra etkin bir geribesleme piezo sahne26z ekseni kontrol için kullanılan çeyrekte diyot, spot yanal talebiyle çevirmek. Uzun vadeli dikey drift etkileri böylece ortadan kalkar.
Birkaç değişiklik ve uzantılarını adresi ihtiyaçlarınıza deneysel sunulan tekniği uygulanır. Örneğin, ticari mikroskop sahne İnkübatörler kullanılabilir Bu kolayca dahil iSCAT mikroskop için uzun vadeli düşsel hücre içine. Diğer teknikleri de iSCAT gibi görüntüleme tamamlayacak uygulanabilir confocal veya tır floresan microscopies17. Lazer ışığı emme nedeniyle deneme rahatsız edemez altında eğitim, iSCAT salgılanması ölçümleri DMEM veya DPBS, gibi diğer hücre ortamlarda yürütülen olabilir sistemdeki adapte ancak, pH göstergesi fenol red kaçınılmalıdır. Ek olarak, fetal buzağı serum (FCS) veya insan trombosit lysate (hPL) gibi takviyeleri iSCAT algılama ile girişime neden olabilir proteinler bulunur. Deneme istenen duyarlılık bağlı olarak, bu takviyeleri mikroskobu ortamından dışlanmaları gerekir.
iSCAT dağılım ışık bir analit'ın yeteneğini kullanır — tüm proteinler için içsel bir özellik — ve bu nedenle doğal olarak belirsiz. Yine de, özgüllük bir dereceye iSCAT sinyalleri ölçek protein kitle14,27,28ile doğrusal olarak mümkündür. Bu standart protein örnekleri, Sığır serum albumin (BSA) ve fibrinojen14,27,28gibi kullanarak bir iSCAT sisteminin kalibrasyon için sağlar. Gerçek şu ki, çok yakın zamanda, Genç vd. 28 Piliarik &amp; Sandoghdar14 çalışmalarına genişletmiştir ve o iSCAT proteinler streptavidin (53 kDa) küçük molekül ağırlığı kitle çözünürlüğe sahip 19 kDa ve doğru olarak yaklaşık 5 kDa ile belirlemek için kullanılan göstermiştir. Birkaç geleneksel yaklaşım daha fazla özgüllük fazladan bir düzey sağlayarak iSCAT tamamlayıcı olabilir. Bir örnek, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) ve/veya diğer yüzey değişiklikleri kısıtlamak gibi olaylar böylece sadece hedef protein bağlayıcı protein16algıladı.
Bu protokol için nasıl iSCAT mikroskobu ile subsecond zamansal çözünürlük16tek protein düzeyinde hücresel salgıları araştırmak için kullanılabilir nitelendirdi. Teknik genel ve herhangi bir ticari veya ev yapımı mikroskobunun uygulanabilir. Tek molekül floresans yaklaşımlar, aksine yöntemi photobleaching acı değil veya etkiler, ancak bu yanıp sönen hala tek-protein hassasiyet elde eder. Bu özellikler iSCAT biosensing ve mikroskopi alanında güçlü bir araç olun. Gelecekteki uygulamalar uyarıcı veya hücresel iletişim immünolojik yanıt gibi karmaşık hücresel etkileşimlerin elucidating üzerinde durulacak.

Salgılanan proteinler çeşitli fizyolojik süreçleri1içinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, onlar düzenli olarak toplu ensemble (proteomik) veya tek bir varlık2,3olarak incelenmektedir. Proteomik geleneksel olarak proteinler Örneğin, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA), akış sitometresi veya kütle spektrometresi4,5yoluyla belirli bir biyolojik sistemi mevcut kümesinin tamamını inceler, 6. Tek proteinler, öte yandan, genellikle çeşitli floresan7,8, plasmonics9,10veya kriyojenik elektron11 temel teknikler kullanarak algılanır microscopies. Tüm bu tekniklerin karmaşık aletler, etiketleme veya her ikisini kullanmak ve onlar sadece altında eğitim sistemi hakkında uzun vadeli bilgi teslim gibi genellikle dynamics bilgi eksikliği.
Burada alt ikinci zamansal çözünürlük14ile iSCAT12,13 mikroskobu anlamda bireysel salgı proteinler için kullanırız. Önemlisi, bu teknik zayıf dağınık sinyal her protein12,14' e içsel algılar. Küçük bir bioparticle scatters ışık miktarını onun polarizability ile ölçekler. Bir proteinin şekil farklı bir etkili saçılma küre14,15,16ve bunu yaklaşık varsayarak proteinler çok benzer Kırılma endeksi var, ölçülen sinyali doğrudan olabilir Moleküler Ağırlık (MW) protein bağlı. İSCAT kontrast karşı moleküler ağırlığa göre başvuru ölçümleri ampirik kalibrasyonu bir proteinler farklı boyutlarda ayırt etmek izin verir. iSCAT deneyler kolayca floresans mikroskobu17,18, immunosorbent reaktifler yanı sıra herhangi bir protein faiz14 özel bir algılama için izin vermek için floresan veya saçılmasını etiketleri tarafından tamamlanmaktadır , 17 , 19.
Prensip olarak, protein zayıf dağınık ışık dalgaboyu ikincil başvuru dalga ile karıştırma yoluyla yükseltecek tarafından iSCAT çalışır. Algılanan yoğunluğu (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) bir iSCAT içinde mikroskop tarafından anlatılan
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
nerede <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> olay yoğunluğu, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> bir katsayısı referans dalga katkı için <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> nano nesnenin altında eğitim, saçılma gücünü belirtir ve <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> faz kayması arasında dağınık olduğunu ve başvuru dalgalar14. Ya iletilen veya geri yansıyan olay ışık genellikle her durumda nerede bir referans dalga kullanılan <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> transmissivity veya yansıtma örnek odası için sırasıyla hesapları. Dönem <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> protein çapraz bölüm saçılma için orantılıdır ve çapraz bir süre için karşılaştırıldığında ihmal. Böylece, ayarı <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> tam yıkıcı girişim için algılanan ışık tarafından verilen <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> nerede <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> başvuru yoğunluğu ve <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> parazit yoğunluğu.
iSCAT mikroskobu biyolojik süreçlerin tek molekül düzeyinde eğitim için mükemmel bir yöntem sunmaktadır. Örnek olarak, biz Laz388 hücreleri araştırmak — bir Epstein - Barr virüsü (EBV) B lenfosit hücre satır20,21 dönüştürülmüş — onlar IgG antikorlar16gibi proteinler salgılar gibi. Ancak, yöntem genel ve çeşitli diğer biyolojik sistemleri için uygulanabilir. iSCAT doğal olarak belirsiz ve herhangi bir protein-ebilmek bulmak veya nanopartikül veya bu belirli veya çoğaltılmış algılama için ortak yüzey functionalization yöntemleri ile genişletilebilir. Sadeliği ve floresan mikroskopisi gibi görme duyusuyla ilgili diğer teknikleri ile kombine edilebilir yeteneği iSCAT hücre biyolojisi içinde değerli bir tamamlayıcı araç olun.

<table><tbody><tr><td>Item/Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x / 1.46 NA objektif</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td>alpha Plan Apochromat yağa daldırma</td></tr><tr><td>20x / 0.4 NA objektif</td><td>Leica</td><td>566049</td><td>N Plan</td></tr><tr><td>Piezo Stage</td><td>PI</td><td>P-517k020</td><td>100x100x10 ile 3 eksenli tabla; m aralığı</td></tr><tr><td>Diyot lazer (445 nm)</td><td>Lasertack</td><td>PD-01236</td><td></td></tr><tr><td>Optik/Optomekanik</td><td>Thorlabs/Newport</td><td></td> <td>lensler, aynalar, direkler, bağlar</td></tr><tr><td>İğne deliği</td><td>Thorlabs</td><td>P30H</td><td></td></tr><tr><td>LED ışık kaynağı</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL5</td><td></td></tr><tr><td>Kısa geçiren filtre (580 nm)</td><td>Omega Optik</td><td>580SP</td><td>için LED'in spektrumunu değiştirmek için floresan uyarma</td></tr><tr><td>Uzun geçiren filtre (500 nm)</td><td></td><td>Floresan uyarma için LED'in spektrumunu değiştirmek için</td> <td>Thorlabs</td></tr><tr><td>FEL0500 70R/30T ışın ayırıcı</td><td>Newport</td><td>20Q20BS.1</td><td></td></tr><tr><td>Yan etkilerin karşılaştırılması için kullanılan</td><td>ekonomi ışın ayırıcı</td><td>Thorlabs</td><td>EBS1</td></tr><tr><td>Kamalı plaka kiriş ayırıcı</td><td>Thorlabs</td><td>BSW26</td> karşılaştırması <td>için kullanılır Yan etkiler</td></tr><tr><td>Kısa geçiren dikroik ayna (550 nm)</td><td>Edmund Optics</td><td>66249</td><td></td></tr><tr><td>8R/92T ışın ayırıcı</td><td>Thorlabs</td><td>BP108</td><td></td></tr><tr><td>CMOS kamera</td><td>iSCAT alımı için</td><td>Photonfocus</td><td>MV1-D1024E-160-CL</td></tr><tr><td>CMOS kameralar</td><td>Parlak alan / floresan alımı için</td><td>Mightex</td><td>SCE-B013-U</td></tr><tr><td>Uzun geçiren filtre (600 nm)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>FELH0600</tr><tr><td>Bilgisayar</td><td>Fujitsu Siemens&nbsp;</td><td>-</td><td>Core i7 İşlemci, 16 GB RAM, SSD</td></tr><tr><td>Edinme Yazılımı</td><td>LabVIEW-LabVIEW</td><td></td> <td>2016 Suite</td></tr><tr><td>Analiz Yazılımı</td><td>Matlab-Matlab</td><td></td> <td>2014 Suite</td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici</td><td>Diener</td><td>Diener pico</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Bağlayıcı</td><td>Modeli CB</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif/Malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta</td><td>Gibco</td><td>11835063</td><td>fenol kırmızısı HEPES</td></tr><tr><td>Tampon Çözeltisi içermez (1M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59205C</td><td></td></tr><tr><td>Kapak slaytları</td><td>Marienfeld</td><td>107052</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt kültür yemekleri</td><td>ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroküreler</td><td>Invitrogen</td><td>Kalibrasyon için kullanılan</td> <td>F8821</td></tr><tr><td>Immersol daldırma yağı</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür lekesi</td><td>Invitrogen</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>Küçük pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>30075005</td> Esnek pipet uçları Eppendorf 5242956003 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, %99,8</td> <td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit, peletler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>0.2M NaOH çözeltisi hazırlamak için</td></tr></tbody></table>

etiket içermeyen imaging, tek proteinler salgılanan iscat mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi, gerçek zamanlı olarak bireysel yaşayan hücrelerden salgılanan tek etiketlenmemiş proteinler algılama yeteneğine sahip bir yöntemi göstermektedir. Bu protokol için biz bir iSCAT mikroskobu gerçekleştirmek ve bir hücre altında eğitim canlılığı izlemek için ek görüntüleme kanalları ile tamamlayıcı için temel adımları kapsar. Onlar biz bir ölümsüzleştirdi B-hücre hattı (Laz388) ile göstermek bir canlı hücreden salgılanan gibi bu, biz tek proteinlerin gerçek zamanlı algılama yöntemini kullanın. Mikroskop ve örnek hazırlanması yanı sıra kaydedilen verilerin analizi ile ilgili gerekli adımları ele alınmıştır. Video iletişim kuralı o iSCAT mikroskobu salgı tek molekül düzeyinde eğitim için basit bir yöntem sunmaktadır gösterir.

Bir şematik bir iSCAT mikroskop Şekil 4aiçinde gösterilir. Temsilcisi parlak alan, floresan ve ham iSCAT görüntüleri Şekil 4b, 4 cve 4 d, sırasıyla16gösterilir. Şekil 4e ve 4f arka planı kaldırma ve diferansiyel posta işleme sonuçlarını göstermek; iki adsorbe protein Şekil 4fkırınım-sınırlı noktalar olarak görülebilir. Şekil 6 125 boyunca algılanan proteinler histogramını gösterir s. Bu veri bağlama olaylar ve onların kontrast16Katalog için çekilen resimlere bir tepe aramak algoritma uygulanarak elde edilmiştir. 503 proteinler toplam sayısı tespit edildi.
Sonraki, salgılanan türler başvuru ölçümleri saf protein çözümler üzerinde veya aracılığıyla ek ölçümleri functionalized cam yüzeyler14,16ile yürütülen yasland tanımlanır. İSCAT veri böylece, doğrudan hücresel salgı dynamics subsecond ölçek16gözünde canlandır. Örnek olarak, biz daha önce IgG antikorlar Laz388 secretome büyük bir kısmını vardır ve yaklaşık 100 molekülleri başına ikinci16oranında hücreden çıkış bulduk. Ayrıca, a sıra-in 100 kDa - 1000 kDa kapsayan diğer parçacıklar hücreleri16tarafından salgılanan. Açıklanan yöntemi istihdam Örneğin, hücresel lizis16zamansal dinamiği belirlemek için veya bir hücre16çevreleyen salgıları kayma konsantrasyon degrade araştırmak için daha fazla olabilir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Şekil 6: tek bir Laz388 hücre tarafından salgılanan proteinlerin Quantification. Histogram 125 s. kontrast değerleri 1 x 10-4 kontrast kutulara (mavi çubuklar) birikmiş olan dönemde saptanan proteinler gösterir. Toplam 503 bireysel proteinlerin Bu ölçüm sırasında sayılan. Deneme ile benzer sonuçlar 10 kez tekrarlandı. Bu rakam McDonald, M.P. vd adapte edilmiş 16. telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Onlar yaşayan hücrelerden salgılanan gibi biz tek etiketlenmemiş proteinler gerçek zamanlı Optik algılama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çeşitli farklı biyolojik sistemleri ve yapılandırmaları için uygulanabilir dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi dayanmaktadır.

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Biz ilk tespit ve altın nano tanecikleri spektroskopi bağlamında 2004 yılında iSCAT sundu. Takip eden 10 yıl içinde bu tekniği virüsler ve küçük proteinler gibi biyolojik nano partiküllerin tespiti ve takibi için daha da geliştirdik. Tekniğin özü, herhangi bir maddi nesne, ne kadar küçük olursa olsun, sonlu bir yok oluş kesiti olmasıdır.Bu tekniğin en büyük avantajı etiketsiz algılamadır. Bu, eğer yeterince hassassak, tek hücrelerden salgılanan proteinler veya ekzozomlar gibi hemen hemen her şeyi tespit edebileceğimiz anlamına gelir. Dikkat edilmesi gereken konu, saçılma arka planının nasıl ele alınılabildiğini.Bir iSCAT mikroskobun büyük bir avantajı tamamen ev inşa edilebilir ve mevcut bir ticari mikroskop eklenebilir. Bu kolayca floresan gibi diğer optik teknikler ile kombine edilebilir anlamına gelir, ve bu birçok grup da şimdi iSCAT ve ilgili teknikler istihdam nedenlerinden biridir. Burada luz hücrelerini bireysel ve salgılayıcı proteinlerin tespitini göstermek için bir model sistemi olarak kullanıyoruz.Ancak, bu yöntem moleküler düzeyde hemen hemen herhangi bir biyolojik süreci araştırmak için de uygulanabilir. Kararlı bir mikroskop elde etmek için, sönümlü optik tablo ve örnek aşaması için sert bir masif blok ile başlayın. Yüksek sayısal diyafram hedefi ve yanal numune çevirisinin yanı sıra hedef için odak konumunun değiştirilmesine olanak tanıyan bir çeviri birimi içeren bir mikroskop örnek aşaması oluşturun.45 derece dikey bağlantı aynası ve 50 santimetre odak uzaklığı tekli lens kullanarak bir diyot lazerin ışığını dalga boyunda 445 nanometreden hedefin arka odak düzlemine odaklayın. Bu geniş alan merceği, iSCAT aydınlatma kaynağı olacak objektif ileri odak, bir collimated Kiriş oluşturur. Hedefe bir daldırma yağı damlatın ve mikroskop aşamasının örnek düzlemine bir cam kapak kaydırın.Bu, görüntüleme hedefi ne kadar aşağı yansıyan bir ışınla sonuçlanır. Görüntüleme yolunu kurmak için, olay ışınına göre 45 derecelik açıyla ve geniş alan merceğinden yaklaşık 10 santimetre sonra bir anti-yansıma kaplı ışın bölücüse tanıtılıyorum. Yansıma önleyici kaplamanın lazer kaynağına doğru işaret ettiğinden emin olun.Kalın bir ışın bölücü lazer artık objektif düz giremeyebilir böylece önemli ışın deplasman tanıtacak olarak dikkat edin. Gerekirse, lazer ışını yolunu ışın bölücüden önce yeniden hizalayın ve amaç boyunca doğru yayılmayı sağlayın. Örnek düzlem ve kamera parfocal olduğundan emin olmak için, olay ışın yolu geniş alan lens beş santimetre sonra bir pozisyonda 45 santimetre negatif odak uzaklığı ile içbükey lens yerleştirerek başlayın.Bu, hedefin arka diyafram girişine harmanlanmış bir ışın la sonuçlanır. İnterferometrenin yansıtıcı koluna yerleştirilen ekranla, kaba odak pozisyonunu bulmak için hedefi dikey yönde hareket ettirin. Ekrana çarpan ışın harmanlandığında amaç odaktadır.Kaba odaklama tamamlandığında hem negatif odak uzaklığı merceği hem de ekranı çıkarın. Dağınık ışığı odaklamak ve yansıyan ışığı harmanlamak için ikinci bir 50 santimetre odak uzaklığı singlet lens ekleyin. Lensin, iletilen lazer ışınının tekrar harmanlanmış olması için hedefin arka odak düzleminden 50 santimetre uzaklıkta olduğundan emin olun.iSCAT kurulum tertibatını tamamlamak için CMOS kamerayı 50 santimetrelik odak uzaklığı merceğinden 50 santimetre uzağa yerleştirin ve ışını doğrudan çipin ortasına yerleştirin. Ek görüntüleme kanalları kurmak için, bir LED ışık kaynağının çıkışını uzun bir çalışma mesafesi hedefine çift olarak getirin. LED çıkışının numuneye odaklanmasına ve yanal olarak konumlandırılmasını sağlayan mekanik bileşenleri numune haznesinin üzerine yerleştirin.Üst hedefi yanal olarak hareket ettirin, böylece üst geniş alan hedefi ve alt iSCAT hedefi eşitsel dir. Bu, bir ekranın alt hedefe yerleştirilerek ve ekrana iletilen LED ışığının yoğunluğunun maksimize edilmesiyle belirlenir. Şimdi, iSCAT lazer yolundan iletilen LED ışığı bölmek için 550 nanometrelik kısalık dikroik ayna yerleştirin.Bu ışını %8 yansıtıcı, yüzde 92'si transmissive, ışın bölücü ile iki kanala bölün. Yüzde 92 yol floresan kanalıdır ve yüzde sekiz yol brightfield görüntüleme için kullanılır. Beş santimetre odak uzaklığı akromatik çift lens kullanarak brightfield kanalını CMOS kameraya yansıtın.Beş santimetre odak uzaklığı akromatik doublet lens kullanarak floresan kanalını ayrı bir CMOS kameraya görüntüleyin. Ayrıca, uyarma ışığını engellemek için 600 nanometrelik uzun pas filtresi kullanın. Bilgisayarı ve yazılımı kurmak için tüm kameraları bir bilgisayara bağlayın.Tam olarak monte edilmiş kurulumda, CMOS kameradaki iSCAT görüntüsünü gözlemleyin ve cam kapak üzerinde artık toz veya kir parçacığı bularak odakta olduğundan emin olun. Parçacığın görüntüsünün dairesel olarak simetrik bir nokta yayma fonksiyonu olduğunu doğrulayın. Lazer ışını mikroskop hedefine hafif bir açıyla girerse nokta yayma fonksiyonu dairesel bir şekle sahip olmayacaktır.Bu hedefe düz bağlantı sağlamak için 45 derece ayna hafif ayarı ile düzeltilebilir. Brightfield ve floresan kanallarının kamera görüntülerini karşılaştırın. Floresan boncuk veya hücre örneğini görüntüleyerek her ikisinin de odakta olduğundan emin olun ve aynı alanı görüntüleyin.iSCAT lazerin konumunun yaklaşık olarak görüntünün merkezinde olduğunu doğrulayın ve daha sonraki başvuru için konumunu not alın. Parlaklık alanının ve floresan kanalının konumunu ve görüş alanını değiştirmek için, kameraları odaklama lensleri ile ilgili olarak masaya taşıyın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi deneme için hazırlanın.Bu hücre ve mikroskopi orta hazırlanması yanı sıra mikroskop örnek cuvette içerir. Hücrelerin iSCAT lazer ışığına doğrudan maruz kalmasını önlemek için lazer ışınının tıkandığından emin olun. Hazırlanan hücre örneğinin yaklaşık üç mikrolitresini merkezden hafifçe numune nin içine enjekte edin.Pipet ucuna hafifçe dokunun ve hücre çözeltisini yavaşça enjekte edin. Hücrelerin kapak kaymasına yerleşmesine izin verin. iSCAT lazerine yakın hücre sayısını kontrol edin.Hücre sayısı çok düşükse, yeterli sayıda kullanılabilir olana kadar bu adımı yineleyin. Hücrelerin kapsamı çok yoğunsa, hücreleri kapak boyunca dağıtmak için yaklaşık 20 mikrolitre ek mikroskopi ortamı enjeksiyonu kullanın. Piezoelektrik çeviri aşamasını kullanarak, örneği yanal olarak bir hücreyi iSCAT görüş alanına yakın konumlandırmak için hareket ettirin.445 nanometre lazer ışığına doğrudan maruz kalma hücre için zararlı olabilir gibi hücre iSCAT görüş alanına girmez emin olun. iSCAT lazer ışınının engelini kaldırın ve kapak yüzeyinin hala odakta olduğundan emin olun. Ortam ortamından sürüklenme ve akustik bağlantıyı en aza indirmek için izolasyon tablosunu içine akıtın.iSCAT, brightfield ve floresan kameralarından görüntüler alarak ölçümü başlatın. Hücrenin canlılığını ve sistemin odak noktasını periyodik olarak kontrol edin. Burada, kamera görüntülerini görüntülemek için kendi kendine yazılmış mikroskop yazılımı kullanılır.Burada, protein bağlamalarını görünür kılmak için ardışık çerçevelerin çekilmesi ile diferansiyel görüntüleme gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilir. Bu, ham kamera görüntüsüyle birlikte ekranda görünen filtrelenmiş bir görüntüyle sonuçlanır. iSCAT ile yapılan hücresel salgı deneyinin temsili sonuçları burada gösterilmiştir.Video iki dakika boyunca bir LAZ hücre salgıları gösterir. Soldaki diferansiyel iSCAT görüntüleri, tek proteinlerin coverglass'a emilimini görselleştirir. Sağdaki brightfield görüntüleri ve floresan kanalı hücre canlılığını izlemek için kullanılır.Bu histogram, tespit edilen proteinleri ve kontrast aralığını iki dakikalık zaman dilimi içinde gösterir. Veriler, iSCAT video verilerinin her karesinde tek tek bağlama olayları analiz edilerek özel bir tepe arama algoritması kullanılarak toplanmıştır. ISCAT mikroskobu sadece biyosensing güçlü bir araç değil, aynı zamanda mikroskopi, gerçek zamanlı olarak nano nesnelerin etiketsiz algılama sağlar çünkü.Özellikle proteinlerin difüzyonu ve taşınması gibi çeşitli işlemlere uygulanabilir. ISCAT, ışık saçılımına karşı mükemmel hassasiyeti nedeniyle görüş alanındaki herhangi bir protein iveya varlığı algılayabilir. Tabii ki, bu aynı zamanda tekniğin floresan birlikte getirdiği özgüllük yoksun olduğu anlamına gelir, ama bu sorunu aşmak için, bir ilgi belirli proteinleri tespit etmek için yüzey işlevselleştirme gibi ek yöntemler uygulayabilirsiniz.Lazerlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve mikroskobu monte ederken ve ayarlarken her zaman uygun göz korumasının takılması gerektiğini unutmayın. Sekretlerin gerçek zamanlı tespiti çok heyecan verici dir ve tıbbi tanıda büyük bir sıçramadır, şu anda çok daha uzun zaman gerektirir ve tek protein duyarlılığından çok uzaktır. Yöntemin performansını artırmak ve uygulamalarını genişletmek için hala bol yer vardır.Bu yüzden bu video diğer gruplar bu heyecan verici çaba katılmak yardımcı umuyoruz.

label-free-imaging-single-proteins-secreted-from-living-cells-via

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Bu video, tek bir hücreden protein salgılarını tespit etmek için lokalize yüzey plazmon rezonans görüntülemeyi gösterir. Mikroakışkan bir kurulum ve peptit bağlı bir plazmonik nanoyapı çipi kullanarak, rezonans açısında yansıyan ışık yoğunluğundaki değişiklikler, tek bir hücreden salgılanan proteinlerle etkileşimleri ortaya çıkarır.

Tek Bir Hücreden Protein Salgılarını Tespit Etmek için Lokalize Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme

Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

Öğrenin, iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden etiketsiz tek proteinleri gerçek zamanlı olarak nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, biyofizik ve hücre biyolojisi araştırmalarında moleküler düzeyde biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabilir.

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

Daha fazla video keşfet