Name: Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Keşfedin bulaşıcı bursal hastalık virüsü patogenezini tavuk birincil bursal hücre kültürü kullanarak. Bu yöntem, B hücreleriyle etkileşimleri inceleyerek aşı geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar kuluçkalık, yetiştirme ve kuşlar ve Caroline Holt uzmanlık aseptik bursa of Fabricius giderilmesinde itlaf uzmanlıklarını Pirbright Enstitüsü'nde hayvan hizmetleri ekibi teşekkür etmek istiyorum. A.B. Biyoteknoloji finanse edilen ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) üzerinden vermek BBS/E/ı/00001845, cdlerini BBSRC yolu ile öğrencilik BBS/E/ı/00002115 finanse edilen ve A.A. için Ulusal Merkezi üzerinden finanse Değiştirme, arıtma ve azaltma hayvanlar araştırma (NC3Rs) yolu ile içinde NC/R001138/1 verin.

Hayvanlarla tüm yordamları etik önceden onaylanması gerekir. Kuruluşumuz, tüm yordamlar iç hayvan refahı ve etik İnceleme Kurulu (AWERB) onaylandıktan sonra İçişleri Bakanlığı kuruluş, kişisel ve proje lisansları, İngiltere'de hayvan (bilimsel yordamlar) Yasası 1986 uygun olarak gerçekleştirilir.
1. chCD40L hazırlanması
<ol><li>Stabil bir çözünür chCD40L hızlı kültür HEK 293-msCD8-CD40L hücreleri inşa 1 x %10 ile ısı inaktive takıma Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) Orta (Merhaba) fetal buzağı serum (FCS) ve % 5 içeren bir ortamda 37 ° C'de 1 µg/mL puromisindir CO 2. Not: Bu hücreler Pirbright uygun malzeme transfer anlaşması imzalanması sonrasında Enstitüsü'nden kullanılabilir.</li>
	<li>Konfluent ne zaman 1:5 yoğunluğu, hücreleri bölün. Toplamak (çözünür chCD40L yapı içeren) süpernatant her seferinde hücreleri bölme, 400 x g hücresel enkaz kaldırma ve 4 ° C'de depolamak 5 min için de santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Toplanan 500 mL süpernatant sıvı havuz ve filtre sterilize-bu 0.2 µm filtreden.</li>
	<li>10 k üretici yönergelerine göre bir molekül ağırlıklı kesim ile santrifüj protein yoğunlaştırıcıları kullanarak süpernatant konsantre. Konsantre süpernatant her sütundan ayıklamak, birlikte havuz ve filtre-bu bir 0,22 µm şırınga filtreden geçirilerek sterilize.</li>
	<li>Seri olarak 1 chCD40L çözümünde sulandrarak deneylerde kullanılacak son konsantrasyonu belirlemek x Iscove'nın modifiye Dulbecco'nın orta (IMDM) (açıklandığı adım 2,4) ve dilutions huzurunda kodlamayla birincil bursal hücreleri. Bir haftaya kadar her gün için hücrelerin sayısı ve yüzdesi canlılığı belirlemek. Not: hücre çoğalması ve canlılığı yeterli nerede en düşük konsantrasyon assay olarak kullanmak için bölgedir. Bu 1:20 ile 1:50 arasında olması muhtemeldir.</li>
</ol>2. tavuk birincil Bursal hücre izolasyon için çözümler hazırlanması
<ol><li>1 Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBBS) x 90 mL steril H2O ve 0,47 Ca ile 10 x HBBS 10 mL ekleyerek kalsiyum (Ca) ile hazırlamak µL % 7.5 NaHCO3.</li>
	<li>Collagenase D hisse senedi eriyik 8 mg/mL Ca. filtre sterilize etmek ile 1 x HBBS içinde vasıl belgili tanımlık eriyik 0.2 µM filtreden hazırlayın. Not: 5 mL aliquots hazırlamak ve bunları-20 ° C'de dondurmak için tavsiye edilir</li>
	<li>1 hazırlamak x RPMI orta takıma % 5 ile Merhaba FCS. Medya 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>Hazırlamak IMDM 1 x 500 mL takıma %8 ile Merhaba FCS, % 2 Merhaba tavuk serum, 50 mM β-mercaptoethanol, insülin transferrin Sodyum selenit ve % 1 penisilin/streptomisin 50 µL. Medya 4 ° C'de depolayın Not: yukarıda belirtilen çözümleri önceden hazırlayın.</li>
	<li>1 x HBBS Ca. Store ile çözüm buz üzerinde hazırlamak.</li>
	<li>1 x HBBS olmadan Ca Ca olmadan 10 x HBBS 10 mL steril H2O, 0,47 µL % 7.5 NaHCO3ve EDTA adlı 10 mM son bir konsantrasyon 90 mL ekleyerek hazırlayın. Çözüm buz üstünde depolar.</li>
	<li>1 x collagenase D çözüm HBBS 18 mL toplamda yapmak Ca ile 13 mL 5 mL collagenase D stok çözeltisi eklenerek hazırlayın. Çözüm buz üstünde depolar. Not: belirtilen adımları 2.5-2.7 denemenin gün çözümleri hazırlayın.</li>
</ol>3. Bursa of Fabricius (BF) kaldırılması
<ol><li>Kapak ve arka tavuk uygun, onaylanmış bir tesis ve insancıl onları itlaf 2-3 hafta-in yaş. Not: yüzey kaldırma için Enstitüsü onaylı yöntemleri kullanın.</li>
	<li>
BF aseptik teknikler kullanarak her tavuktan toplamak. Not: kurum yerde iletişim kurallarını kullanın.<ol>
<li>Karkas dorsal recumbency yerleştirin ve deri ve tüyler suda seyreltilmiş % 70 etanol çözeltisi ile karın ve göğüs overlaying sterilize.</li>
		<li>Ventral ensizyon alt karın bir steril neşter veya makas kullanılarak olun.</li>
		<li>İki nokta üst üste, lağım için kafatası kaudal bölümüne bağlı bursa of Fabricius bulun.</li>
		<li>Steril forseps ve bursa of Fabricius kolon ücretsiz kesme Makası kullanarak. Gut delinme önlemek için dikkat ediniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Org soğuk PBS yerleştirin ve buza laboratuvara aktar. Not: Primer hücre en kısa zamanda organ hasat sonrası yalıtılması gerekir.</li>
</ol>4. yalıtım tavuk birincil Bursal hücre
<ol><li>Mikrobiyolojik güvenlik kabini, çalışma yıkama BF en az 3 x 30 ml soğuk PBS.</li>
	<li>Petri kabına (92 mm çapında, 21 mm içinde yükseklik) doku aktarmak ve 5 mL 1 x collagenase D çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Steril makas ya da daha az 5 mm çapında parçalarını BF oyulmuş bir neşter bıçak kullanıyor.</li>
	<li>30 dk için periyodik nazik ajitasyon ile 37 ° C'de doku kuluçkaya. Not: Collagenase çözüm doku sindirmeye başlayacak.</li>
	<li>Steril bir Pasteur pipet kullanarak, art arda dokuya dağılması teşvik karışımı Aspire edin. Gerekirse, doku daha küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Başka bir 5 mL 1 x collagenase D çözeltisi için doku ekleyin ve başka bir 30 dk için periyodik nazik ajitasyon ile 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Doku tamamen sindirilmiş 4,6 ve 4,7 tamamlayana dek. Not: Daha fazla geçiyoruz değil küçük tanecikler olacak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla Ca olmadan 1 x HBBS 20 mL içine geçmek.</li>
	<li>400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atmak ve Pelet 10 mL 1 resuspend x RPMI % 5 FCS ile.</li>
	<li>10 mL 5 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate içeren yoğunluk gradient medya de üstüne hücre süspansiyon yerleşimi veya yoğunluk gradient medya 10 mL hücre süspansiyon altında 5 mL altına koymak. İkisi arasında bir açık arayüz olduğundan emin olun.</li>
	<li>Yerleşimi, 900 x g 4 ° C'de 20 dk için santrifüj kapasitesi Alt veya santrifüj sonunu kaldırmak. Not: Hücreleri bir grup hücre medya ve yoğunluk gradient medya arayüzü oluşturmalıdır.</li>
	<li>Steril bir Pasteur pipet kullanarak, hücre kaldırma ve soğuk PBS koyun. 3 hücreleri yıkama x 400 x g 5 min için de centrifuging ve onları soğuk PBS resuspending.</li>
</ol>5. kültür tavuk birincil Bursal hücre
<ol><li>400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve onları tam IMDM x 1 resuspend.</li>
	<li>Bir aliquot hücre süspansiyon al, Trypan mavi ekleyin ve mavi Trypan dışı hücrelerin sayısını saymak. Hücreleri ve yüzde canlılığı sayısını belirler.</li>
	<li>400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve bir 1:20 ile desteklenmiş tam IMDM içinde resuspend tavuk CD40L 1 x 107 hücre/mL yoğunluğu, seyreltme. 1:10 ile 1:50 aralığında yalan muhtemelen en iyi seyreltme belirlemek için chCD40L içeren konsantre süpernatant titre.</li>
	<li>48-72 h. U popolu 96-şey plakaları düz oturaklı tabakaları bana tercih edilir için ya 96 - veya 24-da tabak 37 ° C'de hücreler kültür. Not: Hücreleri de 40 ° C'de kültürlü</li>
</ol>6. IBDV tavuk birincil Bursal hücrelerle enfeksiyonun
<ol><li>48-72 h sonrası yalıtım, bir aliquot girdap örneği, virüsün çözülme ve buza saklayın.</li>
	<li>Birincil bursal hücreleri resuspend, 10 µL hücre süspansiyon aliquot al, bir Trypan mavi çözüm 10 µL için eklemek ve hücreleri ve yüzde canlılığı sayısını belirler.</li>
	<li>Virüs enfeksiyonu (virüs inoculum ve girdap yapmak için MOI) uygun çokluğu için tam IMDM x 1 oranında seyreltin.</li>
	<li>400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve virüs inoculum hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için periyodik ajitasyon ile 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi, virüs inoculum kaldırmak ve 1 x komple IMDM medya hücrelerde yıkayın.</li>
	<li>400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve tam IMDM medya ile tavuk CD40L mL başına 1 x 107 hücre yoğunluğu, takıma hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Ya 96 - veya 24-da tabak 37 ° C'de hücreler kültür Not: Hücreleri de 40 ° C'de kültürlü</li>
</ol>7. IBDV çoğaltma tavuk birincil Bursal hücrelerdeki miktar
<ol><li>İstediğiniz zaman noktası postinfection, hücreleri resuspend, onlara uygun bir tüp aktarmak, onları vasıl 400 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve plak tahlil veya TCID50 tahlil Reed Muench göre süpernatant virüs titrasyon için hasat yöntemi15.</li>
	<li>PBS 1 mL hücrelerde yıkama ve immunostaining ile IBDV için belirli bir antikor için onları hazırlamak veya RNA (üreticinin yönergeleri izleyerek) uygun bir seti kullanarak ayıklamak ve Ters transkripsiyon nicel polimeraz zincir gerçekleştirmek reaksiyon (RT-qPCR) kullanarak astar belirli bir IBDV gen (ileri, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Tersine, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Sahte enfekte hücre kültürlerinde bir denetim olarak kullanılmalıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Hoerr, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+aspects+of+immunosuppression+in+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Diseases%22%5BJournal%5D)">Clinical aspects of immunosuppression in poultry.</a> Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).</li>
<li>Schermuly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+for+lytic+replication%2C+latency%2C+and+transformation+of+an+oncogenic+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).</li>
<li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursal+immunopathology+responses+of+specific-pathogen-free+chickens+and+red+jungle+fowl+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. , (2018).</li>
<li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursal+transcriptome+profiling+of+different+inbred+chicken+lines+reveals+key+differentially+expressed+genes+at+3+days+post-infection+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+Toll-like+receptor+pathway+and+related+genes+of+chicken+bursa+after+experimental+infection+with+infectious+bursa+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus.</a> Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+chTLR3+by+Infectious+Bursal+Disease+Viruses+with+Different+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+and+In+Vivo.+Viral+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence.</a> In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).</li>
<li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+profiles+of+the+responses+of+chicken+bursae+of+Fabricius+to+IBDV+in+different+timing+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases.</a> Virology Journal. 14 (1), 93(2017).</li>
<li>Rasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+immune+response+and+cytokine+profiles+in+the+bursae+and+spleen+of+chickens+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> BMC Veterinary Research. 11, 75(2015).</li>
<li>Ruby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+reveals+a+possible+role+for+the+timing+of+the+inflammatory+response+in+determining+susceptibility+to+a+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection.</a> Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).</li>
<li>Smith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+early+immune+response+to+infection+by+infectious+bursal+disease+virus+in+chickens+differing+in+their+resistance+to+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease.</a> Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).</li>
<li>Tregaskes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+biological+properties+of+the+CD40+ligand%2C+CD154+in+a+non-mammalian+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate.</a> Developmental & Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).</li>
<li>Kothlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+supports+the+long-term+maintenance+and+differentiation+of+chicken+B+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture.</a> Developmental & Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).</li>
<li>Dulwich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+in+chicken+primary+B+cells+infected+ex+vivo+with+attenuated+and+very+virulent+strains+of+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV).</a> Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).</li>
<li>Soubies, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+titration+of+infectious+bursal+disease+virus%2C+including+non-cell-culture-adapted+strains%2C+using+ex+vivo-stimulated+chicken+bursal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Pathology%22%5BJournal%5D)">Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells.</a> Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).</li>
<li>Reed, L., Muench, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/aje/article-abstract/27/3/493/99616">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).</li>
<li>Hui, R. K., Leung, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+Profile+of+Chicken+Embryo+Fibroblast+DF-1+Cells+Infected+with+Cell-Adapted+Infectious+Bursal+Disease+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus.</a> PLoS One. 10 (6), e0111771(2015).</li>
<li>Li, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiles+of+chicken+embryo+cell+cultures+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+chicken+dendritic+cell+response+to+infectious+bursal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease.</a> BMC Genomics. 17 (1), 878(2016).</li>
<li>Quan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiles+in+bursal+B-lymphoid+DT40+cells+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Virology Journal. 14 (1), 7(2017).</li>
<li>Wong, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+differentially+expressed+transcripts+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptotic+chicken+embryonic+fibroblasts+by+using+cDNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays.</a> Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada biz tavuk birincil bursal hücreleri ex vivo çözünür chCD40L huzurunda başarılı kültürünü tanımlamak ve bu hücreler bir zayıflatılmış strain ve IBDV çok şiddetli bir tür çoğaltma destekleyebilir gösterilmektedir. Bu ex vivo model nasıl in vivo ve in vitro çalışmalar üzerinde farklı avantajları olan bir IBDV enfeksiyon13olarak hücreleri yanıt belirlemek için kullanılabilir.
BF hasat izole bursal hücre bakteriyel kontaminasyon böylece gut delmek değil önemlidir. Buna ek olarak, primer hücre hücre ölümü sınırlamak için en kısa zamanda organ hasat sonrası yalıtmak önemlidir. ChCD40L kullanmaya gerek teknik bir kısıtlamasıdır; Ancak, Soubies vd. tarafından yürütülen çalışma modeli daha fazla sayıda laboratuvarlar tarafından kabul edilmesi için phorbol 12-myristate 13-asetat (bursal hücre canlılığı chCD40L14 yerine uzatmak için PMA) kullanımını etkinleştirmek gösterir. Yukarıda belirtilen iletişim kuralı chCD40L en iyi konsantrasyon ampirik olarak, birincil B hücreleri molekül ve gözlem hücre çoğalması ve canlılığı seri olarak seyreltilmiş konsantrasyonlarda kültür tarafından belirler. İletişim kuralı için bir potansiyel değişiklik chCD40L molekül arındırmak için ve belirli bir konsantrasyon toplu iş toplu iş değişkenlik önlemek için hücre kültür ortamına Ekle için olabilir.
İn vivo çalışmalar o aşağıdaki IBDV enfeksiyon, pro-inflamatuar sitokin yanıtları, tip ı IFN yanıt ve apoptosis BF5,9,10 katılan genlerin ifadesinde bir artış olduğunu göstermiştir . Ancak, enfeksiyon, inflamatuar hücreler ve BF, virüslü B hücre nüfus9' a göre onlar hızlı genlerin farklı efektör T hücrelere bir akını var. Bu, bu nedenle, IBDV ye nasıl enfekte hücreleri cevap yorumlamak zordur. Bu sorunu çözmek için bazı araştırma grupları kültür16,17,18,19,20IBDV ile enfekte hücreleri transkripsiyon yanıt nitelendirmiştir. Bu vitro çalışmalar, iyi tanımlanmış MOIs ve zaman-puan postinfection avantajına sahip. Ancak, vitro çalışmalar genellikle fibroblast hücreleri16,17,20 ya da dendritik hücreler18nitelendirmiştir. Konak hücre-IBDV etkileşimleri içine bazı bilgiler, geçerli inanç B hücreleri enfeksiyon IBDV patogenezi ve alaka veri için bu nedenle, çok önemli olduğunu sağlanması overinterpreted iken. Önce bizim ex vivo bursal hücre kültür modeli, tek bir çalışma IBDV enfeksiyon19B hücre hücresel yanıt karakterize; Ancak, bu çalışmada ALV, yapılmış olabilir sonuçlar sınırlama ile enfeksiyon nedeniyle dönüştü bir ölümsüzleştirdi B hücre kültürünü kullanılmaktadır. Buna ek olarak, ex vivo modeli IBDV enfeksiyon burada açıklanan araştırmacılar vitro çalışmalar, tanımlanmış MOIs ve virüs etkileşimleri ile ilgili ana bilgisayar hücresini eğitim sırasında zaman-puan, gibi avantajları korumak için olanak sağlar. Birincil bursal hücreler kandan BF dokusundan elde edilen, hayır enflamatuar veya T hücreleri mevcut ve biz tarafından göstermiştir gibi akış sitometresi (Standart koşullar kullanarak), aşağıdaki chCD40L stimülasyon, hücre nüfus % 97'si için olumlu B hücre işaretçisi bü-1 (veri gösterilmez). Hücrelerin % 3 bü-1 olduğunu göz önüne alındığında eksi, bu hücreler IBDV ile enfekte olma ve kendi gen ekspresyonu ve katkı için Patogenez keşfetmek belirlemek ilginç olacak.
Biz ex vivo tavuk birincil bursal hücre kültür modeli da konak hücre-virüs etkileşimleri tavuk, ALV veya REV, gibi hastalık diğer B-hücre tropic virüslerin çalışmaya genişletti ve aynı zamanda genişletilmiş diğer kuş türleri (tahmin Örneğin, ördek veya hindi). Birincil bursal hücreleri ex vivo de kültür yeteneği patogenez ve immünosupresyon kuşlar bulaştırmak için gerek kalmadan bu virüslerin neden olduğu yönleri çalışma imkanı sağlar. Vivo çalışmalar önemli morbidite neden, bu araştırmada değişim, arıtma ve hayvanların kullanımı azaltma üzerinde önemli bir etkisi olacaktır.
Özetle, burada açıklanan ex vivo tavuk birincil bursal hücre kültür modeli nasıl kuş B-hücre içinde vivo içinde kullanılan kuşlar sayısını azaltırken tropic virüs onların konak hücreleri ile etkileşim anlayışı genişletmek için potansiyele sahiptir. enfeksiyon çalışmalar. Teknikleri için birden fazla lenfoid organlar, uygulanan birden çok virüs ve büyük olasılıkla, kuş, kuş Viroloji ve İmmünoloji alanları için katkıda bulunabilir çekici bir model yapmak birden çok tür.

Küresel Tavukçuluk sanayi genişleyen bir insan popülasyon için yeterli gıda güvenliğini sağlamak için önemlidir. Ancak, immünosupresyon gıda güvenliği için tehdit ve etkilenen kuşların refah ve sanayi için önemli bir ekonomik sorun temsil eder. Tavuklarda immünosupresyon vakalarının büyük çoğunluğu bu sonradan kazanılan bir tropism T ve B lenfositler1için sahip bağışıklık bozulması için en sorumlu olan immünsüpresif virüs enfeksiyonu nedeniyle. Kuşlar, B hücreleri çoğunluğu bursa of Fabricius (BF) bilinen bir organ içinde yer almaktadır. B hücre lizis, IBDV ve Marek'ın hastalığı virüsü (MDV), gibi neden ve dönüşümü, kuş lökozu virüs (ALV) ve reticuloendotheliosis virüs (gibi neden dahil olmak üzere birkaç immünsüpresif virüs enfeksiyonu yatkındır REV).
Bu enfeksiyonlar kontrol etmek için daha iyi stratejiler geliştirmek amacıyla, belgili tanımlık virüs etkileşim tavuk B hücreleri ile karakterize etmek için esastır. B hücreleri bir kuştan kaldırılır, ancak, IBDV etkileşimleri tavuk B hücreleri veya ALV veya REV enfeksiyonu takip erken olayları ile ayrıntılı bir analiz gerçekleştirmek üzere de ex vivo kültür2, hayatta değil. Sonuç olarak, birçok ana hücre-virüs etkileşimleri okudu vivo içinde3,4,5,6,7,8,9oldunuz. 10. Bu çalışmalar bilgilendirici olsa da, onlar ağır olabilir hastalıklardan muzdarip virüslü kuşlar kullanımını içerir.
CD40 ligand B hücre proliferasyonu11indükler bir moleküldür. Kimlik (chCD40L) gen kodlama tavuk CD40L, çözünür füzyon proteini mühendislik, kültür ortamına eklendiğinde, tavuk birincil B hücreleri ex vivo12yayılması indüklenen. 2015 yılında bu şekilde kültürlü B hücreleri çoğaltma MDV2 ve 2017 yılında, biz ve diğerleri desteklemek için birincil bursal hücre chCD40L ile uyarılan IBDV çoğaltma13,14çalışma için bir model olarak kullanılabilir bulundu bulundu. Burada, yalıtım ve kültür tavuk birincil bursal hücre, hücre IBDV ile enfeksiyon ve viral çoğaltma miktar açıklayın. Her ne kadar biz BF bağlamında yöntemi açıklamak, bu farklı lenfoid organ izole etmek ve kültür hücrelere uygulanan olabilir.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 Orta Merck</td><td></td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>56 ° C'de ısı inaktive eder; 1 saat için C</td></tr><tr><td>Puromycin Dihidroklorür</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene PES membranlı Hızlı Akışlı Steril Tek Kullanımlık Filtre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein Konsantratörü PES (10K MWCO, 20 mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88528</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mikro; m Millex-GP Şırınga</td><td>Filtresi Merck</td><td>F7648</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td><td>gibco Life Technologies tarafından</td><td>14060-040</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) - CaCl22 - MgCl2</td><td>gibco Life Technologies tarafından</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit çözeltisi (EDTA)</td><td>Merck</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk Serumu</td><td>Merck</td><td>C5405-100ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol 50 mM</td><td>gibco by Life</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Life tarafından insülin-transferrin-sodyum-selenit</td><td>gibco Teknolojiler</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Merck</td><td>10831-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözeltisi</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Nunc96 Kuyu Polistiren Yuvarlak Tabanlı Mikro Kuyu Plakaları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>163320</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı TC ile muamele edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Kapaklı, Steril</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353047</tr><tr><td>Rneasy Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr></tbody></table>

bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir ex vivo tavuk birincil bursal hücre kültürü modeli

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Bursal bulaşıcı hastalık virüstür (IBDV) kanatlı sektörüne ekonomik öneme sahip bir birnavirus. Virüs B hücreleri, morbidite, mortalite ve immünosupresyon virüslü kuşlar neden bozar. Bu çalışmada, tavuk birincil bursal hücrelerden bursa of Fabricius, kültür ve IBDV içeren hücrelerin enfeksiyon ve viral çoğaltma miktar yalıtım açıklar. Tavuk CD40 ligand eklenmesi önemli ölçüde hücre çoğalması kat altı gün kültür ve önemli ölçüde gelişmiş hücre canlılığı arttı. IBDV iki soyu, hücre kültürü zorlanma, D78 ve çok şiddetli bir zorlanma, UK661, de ex vivo hücre kültürde çoğaltılan uyarlanmış. Bu model nasıl hücreleri ve IBDV enfeksiyon için cevap virüslü kuşlar IBDV patogenezinde çalışmalarda kullanılan sayısında bir azalma verecektir belirlenmesinde kullanımı olacaktır. Modeli de diğer virüsler kapsayacak şekilde genişletildi ve kuşlar farklı türler için uygulanabilir.

Tavuk birincil Bursal hücreleri tavuk CD40L huzurunda kültürlü
Ne zaman tavuk birincil bursal hücreleri huzurunda çözünür chCD40L kültürlü, hücre sayısı arttı kat 9.02 x 105 3.63 x 10 mL 6 gün ne zaman yoktu aksine, bir süre içinde6 (p &lt; 0,05) ( Şekil 1A). Hücre canlılığı de önemli ölçüde geliştirilmiş, örneğin %, 3. gün sonrası kültürüne chCD40L H chCD40L varlığında yokluğunda (p &lt; 0,05) (Şekil 1B)13.
Tavuk birincil Bursal hücreleri çoğaltma adapte her iki hücre kültür ve IBDV çok şiddetli suşları destekleyebilir
Sahte enfekte ve enfekte hücre kültürleri 18 h sabit postinfection, IBDV VP2 ve ikincil bir antikor Alexa Fluor 488 için Birleşik ve DAPI ile counterstained karşı monoklonal antikor ile etiketlenmiş. Enfekte hücreleri yeşil floresan çevresinde çekirdeği (Şekil 2A), IBDV varlığı sitoplazmada ile tutarlı kanıt vardı. Bu IBDV iki soyu için açıktı, hücre kültürü zorlanma, D78 ve çok şiddetli bir zorlanma, UK661 adapte (Şekil 2A). 5, 18, 24 ve 48 h postinfection RNA virüslü kültürler çıkarılan ve RT-qPCR için astar IBDV VP4 gen korunmuş bir bölge için belirli ile tabi. VP4 ifade ilk ev tutma gen TBP normalleştirilmiş ve sahte bir ΔΔCt analiz örneklerinde göreli kat değişiklik olarak dile getirdi. 48 h postinfection D78 ile 16,603 kopya ve 48 h postinfection UK661 ile 38,632 kopya IBDV VP4 ifade arttı. Birlikte ele alındığında, bu veriler tavuk birincil bursal hücreleri hücre kültür uyarlanmış ve çok şiddetli IBDV suşları13çoğaltma destek olabilir göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> Şekil 1: tavuk birincil bursal hücreler kültürlü tavuk CD40L huzurunda. Tavuk birincil bursal hücreleri kültürlü chCD40L içinde (siyah ve beyaz çubuklarından, sırasıyla). (A) canlı hücreleri ve (B) hücrelerin yüzdesi belirtilen zaman-puan postinfection tespit. Gösterilen veriler en az üç Çoğalt deneyler temsilcisi vardır, ortalama standart sapması hata çubukları temsil ve istatistiksel anlamlılık bir öğrenci tkullanımı belirlendi-test, her zaman-bir noktada, * p &lt; 0,05. bu rakam Dulwich vd izniyle değiştirildi 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> Şekil 2: tavuk birincil bursal hücreleri-ebilmek çekmek hem hücre-kültür adapte çoğaltılması ve çok öldürücü soy-in IBDV. (A)tavuk birincil bursal hücreleri sahte enfekte veya D78 ya da UK661 ile enfekte ve her kültürden bir örnek sabit, etiketli ve yansıma: IBDV VP2, yeşil; çekirdekleri, mavi. Ölçek çubuğu = 7 µm. (B) RNA belirtilen zaman-puan postinfection, ters-transkripsiyonu, çıkarılan ve korunmuş bölge IBDV VP4 gen kantitatif PCR ile güçlendirilmiş. Günlük10 kat kopya numarası TBP temizlik gen için normalleştirilmiş ve sahte enfekte örnekleri 2-ΔΔCT yöntemi göre göreli olarak ifade edilen VP4 değiştirin. Gösterilen veriler en az üç Çoğalt deneyler temsilcisi, ve hata çubukları ortalama standart sapması temsil. Bu rakam Dulwich vd izniyle değiştirildi 13.

Burada tavuk birincil bursal hücrelerden bursa of Fabricius, kültür ve bulaşıcı bursal hastalık virüs içeren hücrelerin enfeksiyon ve viral çoğaltma miktar yalıtım açıklayın.

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Bu yöntem, immünsupresif virüslerin B hücreleriile nasıl etkileşime girdiği gibi kuş virolojialanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin şu anda laboratuvarda kullanılan ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarından daha alakalı olmasıdır. Bu yöntem tavuk hücrelerinin IBDV'ye nasıl tepki verdiğine dair içgörü sağlasa da, ALV ve REV'ye de uygulanabilir.Bu yöntem, araştırmamızdaki kuş sayısını azaltır ve araştırmada hayvan kullanımının değiştirilmesi, azaltılması ve iyileştirilmesi anlamına gelen üç Rs için yararlıdır. Mikrobiyolojik güvenlik kabininde BF'yi en az üç kez 30 mililitre soğuk PBS ile yıkayın. Yıkanmış dokuyu Petri kabına aktarın ve beş mililitre 1X kollajenaz D çözeltisi ekleyin.BF'yi çapı beş milimetreden daha az olan parçalara dönüştürmek için steril makas veya neşter bıçağı kullanın. 30 dakika boyunca periyodik nazik ajitasyon ile 37 santigrat derecede kuluçka. Bundan sonra, doku parçalanmasını teşvik etmek için tekrar tekrar karışımı aspire steril bir Pasteur pipet kullanın.Dokuya 1X kollajenaz D çözeltisi başka bir beş mililitre ekleyin ve başka bir 30 dakika boyunca periyodik nazik ajitasyon ile 37 santigrat derece kuluçka. Bu işlemi tekrarlayın, karışımı aspire, taze kollajenaz D çözeltisi ekleyerek, ve doku tamamen sindirilir kadar kuluçka. Daha fazla çözünmeyecek küçük granüller olacağını unutmayın.Sindirilmiş hücre süspansiyonundan 100 mikronluk bir hücre süzgecinden kalsiyumsuz 1X HBBS'nin 20 mililitresine geçirin. Santrifüj 400 kez g beş dakika için. Supernatant atın, 5% FBS ile 1X RPMI 10 mililitre pelet resuspend.Daha sonra, polisökroz ve sodyum diatrizoat içeren yoğunluk gradyan medya beş mililitre üstüne hücre süspansiyon 10 mililitre bindirme. İki katman arasında açık bir arabirim olduğundan emin olun. Santrifüj 900 kez g ve 4 santigrat derece 20 dakika.Hücreler hücre ortamı ve yoğunluk gradyan ortam arasındaki arabirimde bir bant oluşturmalıdır. Daha sonra, hücreleri kaldırmak ve soğuk PBS içeren bir tüp e nakletmek için steril bir Pasteur pipet kullanın. Hücreleri 400 kez g'de beş dakika santrifüj ederek yıkayın ve soğuk PBS'de yeniden sulandırın.Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. İlk olarak, hücre süspansiyonuna 400 kez g'de beş dakika santrifüj edin. 1X tam IMDM 30 mililitre hücreleri resuspend.Hücre süspansiyonundan bir aliquot alın ve trypan mavisi bir solüsyona ekleyin. Trypan mavisini dışlayan canlı hücrelerin sayısını sayın ve hücre sayısını ve yüzde canlılığını belirleyin. Bundan sonra, hücre süspansiyonuna 400 kez g'de beş dakika santrifüj edin.Mililitre başına 10 milyon hücre yoğunluğunda tavuk CD40 ligand bir-20 seyreltme ile desteklenen tam IMDM hücreleri resuspend. Kültür 48 ila 72 saat boyunca 96 veya 24-iyi plakalar hücreleri. 48 ila 72 saat sonra izolasyon, virüsün bir aliquot çözülme.Örneği girdap ve buzda saklayın. IMDM ortamındaki birincil bursal hücrelerini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitrelik aliquot'unu alın ve 10 mikrolitrelik Trypan mavisi çözeltisine ekleyin.Daha sonra, hücre sayısını ve yüzde canlılığını belirleyin. Virüsü 1X tam IMDM içinde virüs inoculum yapmak için enfeksiyon uygun çokluğu seyreltin. Girdap ile bu seyreltme karıştırın.Hücre süspansiyonuna 400 kez g.'yi beş dakika lığına santrifüj edin. Sonra, supernatant çıkarın ve virüs inoculum hücreleri resuspend. 37 derecede periyodik ajitasyonla bir saat kuluçkaya yat.Bundan sonra, hücre süspansiyonuna 400 kez g'de beş dakika santrifüj edin. Virüs inoculum kaldırın ve 1X tam IMDM ortamda hücreleri yıkayın. Kültür ya 96-veya 24-iyi plakalar hücreleri.Bu çalışmada, tavuk birincil bursal hücreleri çözünür tavuk CD40 ligand varlığında art arda kültürlü ex vivo vardır. Çözünür tavuk CD40 ligand varlığında kültürhücreleri altı günlük bir süre içinde 902, 000 000 milyon mililitre başına dört kat artış görülmektedir. Hücre canlılığı da önemli ölçüde tavuk CD40 ligand varlığında geliştirilmiştir.Temsili konfokal mikroskopi görüntülerinde, enfekte hücrelerin çekirdeğin etrafında yeşil floresan olduğu görülmektedir, bu da sitoplazmada IBDV varlığı ile tutarlıdır. Bu IBDV iki suşları için açıktır, bir hücre kültürü uyarlanmış suşu, D78, ve çok öldürücü bir gerginlik, UK661. RNA daha sonra beş, 18, 24 ve 48 saat sonra enfeksiyon sonrası çıkarılır ve IBDV VP4 geninin korunmuş bölgesine özgü astarlarla RT-qPCR'ye tabi tutulur.IBDV VP4 ekspresyonu, D78 ile enfeksiyon sonrası 48 saat, UK661 ile 48 saat postenfeksiyon da 632 kopya da 16, 603 kopyaya yükselmektedir. Bu veriler tavuk birincil bursal hücrelerinin hücre kültürü-uyarlanmış ve çok öldürücü IBDV suşlarının replikasyon destekleyebilir göstermektedir. Bu yordamı takiben, rt-qPCR, mikrodizi veya RNA-Seq gibi diğer yöntemler hücrelerin enfeksiyona nasıl tepki gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.Biz hücrelerin zayıflatılmış bir suşu ve IBDV çok öldürücü bir suş ile enfeksiyona nasıl tepki ve şimdi diğer viral enfeksiyonlara nasıl tepki araştırdıklarını karşılaştırdık. Bu hücreleri kültüre yeteneği bize kuşlara bulaştırmak gerek kalmadan virüs patogenezi ve immünsupresyon yönlerini çalışma sağlar. Bu üç Rs üzerinde önemli bir etkisi olacak, değiştirme, arıtma, ve araştırma hayvanların kullanımının azaltılması.

an-ex-vivo-chicken-primary-bursal-cell-culture-model-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Bu video, tümör taşıyan koryoallantoik membranın tavuk embriyosundan izolasyonunu göstermektedir. Hasat edilen CAM, daha sonraki sonraki uygulamalar için kullanılabilir.

Civciv Korioallantoik Membran Hasadı: Tavuk Yumurtasından Tümör Grefti Taşıyan Korioallantoik Membranı İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bereketli tavuk yumurtaları, yüksek miktarda insan influenza A virüsü üretmek için yaygın olarak kullanılır, çünkü yüksek virüs verimini kanıtlamak için uygun ve uygun maliyetli bir sistem sağlarlar.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Kuş embriyonik gelişiminin geç aşamalarında yolk kesesi zarlarında lipid kullanım mekanizmasını incelemek için, birincil bir Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültürü sistemi kurduk.

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak &gt; 6 × 109 plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Bu makale, tavuk GSDME (chGSDME-NT) ve propidyum iyodürün (PI) N-terminal fragmanına karşı antikorlarla ikili boyamadan sonra akış sitometrisi kullanılarak piroptotik hücrelerin tanımlanmasını açıklamaktadır.

Piroptozun Flow Sitometri ile İncelenmesi

Protokol, enfekte ördeklerden bellek T hücrelerini izole ederek kuş T hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için bir yöntemi açıklar ve yüksek oranda saflaştırılmış spesifik ördek T hücrelerinin üretilmesine izin verir. Ek olarak, ördek T hücrelerinde IFN-γ sekresyonunu doğru bir şekilde ölçmek için hücre içi sitokin boyama (ICS) yöntemi oluşturulmuştur.

In Vitro H5N1'e Özgü Ördek T Hücreleri için Kültür ve İntrahücre İçi Sitokin Boyama Yöntemi ile İmmün Yanıtların Saptanması

Bu yöntem, tavuk embriyosunu, bakteriyel patojen L. monocytogenes'i yaşayabilir ancak kültürlenemeyen (VBNC) bir durumdan canlandırmak ve bakteri uyku hali mekanizmalarının anlaşılmasında potansiyel olarak daha fazla kullanım sağlamak için basit ve uygun maliyetli bir in vivo model olarak göstermektedir.

Canlı Ancak Kültürlenemeyen Patojenleri Canlandırmak için İn Vivo Model Olarak Tavuk Embriyosu

Keşfedin bulaşıcı bursal hastalık virüsü patogenezini tavuk birincil bursal hücre kültürü kullanarak. Bu yöntem, B hücreleriyle etkileşimleri inceleyerek aşı geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Daha fazla video keşfet