Bir döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) tahlil hızlı teşhis edilmesi için kullanılan Bemisia tabaci
29 Ekim 2018
Bu kağıt için döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) teknolojisini temel alan Bemisia tabaci hızlı kimlik tahlil için protokol bildirir. En az laboratuvar eğitim gerektirir ve bu nedenle, Tesis içi giriş bitki ithalat liman ve Havaalanı gibi noktalarda uygulanabilir iletişim kuralı.
Bu yöntem, dünyanın birçok ülkesinde sebze ve süs bitkileri üretimini etkileyen bir istilacı böcek haşere olan Bemisia tabaci'nin tanımlanması için hızlı ve güvenilir bir tanı aracı sağlamaktadır. Kolaylığı nedeniyle, yöntem liman lar ve havaalanları gibi tesis ithalat ürünleri için giriş noktalarında doğrudan yerinde yapılabilir ve bu nedenle ticaret ağları boyunca Bemisia tabaci dağılımını azaltmak için potansiyele sahiptir. Başlamak için, iki, dört tüpLAMP şeritler halinde sekiz tüpLAMP şerit kesmek için makas kullanın.
Daha sonra, tüpleri metin protokolünün birinci yılında belirtilen şemaya göre etiketleyin. Bundan sonra, 80 reaksiyonlar için yeterli B.tabaci LAMP reaksiyon ana karışımı hazırlamak. Daha sonra, dört tüpLAMP şeritler tüplerin her içine ana karışımı 22,5 mikrolitre dağıtmak.
Nabız santrifüj, ve onları buza koy. Hızlı girdap ve darbe santrifüj B.tabaci LAMP PAC. Daha sonra, dört tüpLAMP şeritler her biri PAC etiketli tüp içine 2,5 mikrolitre ekleyin.
Ardından, kapakları kapatın ve kullanıma hazır B.tabaci LAMP kiti ünitelerini eksi 20 derecede saklayın. DNA ekstraksiyonuna başlamak için, böcek örneklerini 30 mikrolitre DNA çıkarma çözeltisi ile 0,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarmak için steril kürdanlar kullanın. Daha sonra, 300 rpm ayarlanmış bir ThermoMixer 95 santigrat derece beş dakika boyunca örnekleri kuluçka.
Kısaca girdap ve nabız santrifüj örnekleri. Kullanıma hazır B.tabaci LAMP kitlerinden birini eritin. Sonra, kiti hızlı calıstırın ve nabız santrifüj.
S-1 ve S-2 tüplerine 2,5 mikrolitre numune DNA ekstresi ekleyin. Daha sonra, NAC tüpüne 2,5 mikrolitre saf alkali DNA ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Kiti girdap ve darbe santrifüj ettikten sonra, kiti bir LAMP analiz cihazına yerleştirin ve 60 dakika boyunca 65 santigrat derecede isothermal DNA amplifikasyon analizi yapın.
Aynı koşuda, kiti ilk olarak 98 santigrat dereceye ısıtarak ve 75 santigrat dereceye kadar soğutarak DNA amplifikasyon ürünlerinin erime sıcaklık analizini yapın. Otomatik LAMP doğrulama uygulamasını kullanarak LAMP okumasını doğrulayın. İlk olarak, Rapor Oluştur düğmesini tıklatmadan önce hedef türleri ve test edilen örnek sayısını tanımlayın.
Son olarak, okumayı doğrulama uygulamasının uygun giriş alanlarına aktarın. Verileri girdikten hemen sonra, doğrulama nın sonucu görüntülenir. Bu protokolde, İsviçre'nin düzenli ithalat kontrol işlemi sürecinde ele geçirilen B.tabaci böcek örnekleri LAMP analizi ile analiz edilmiştir.
Analiz edilen toplam 80 örnekten 75 örneği doğru olarak doğru pozitif olarak tanımlanmış ve iki örnek doğru olarak gerçek negatif olarak tanımlanmıştır. Ancak üç örnek yanlış negatifti ve yanlış olarak B.tabaci olmadığı tespit edildi. Tahlillerin bir alt kümesi Zürih Havaalanı'nda bitki sağlık müfettişleri tarafından yerinde yapıldı.
Temsili sonuçlarda, 1 ve 2'lik örnekler, yaklaşık 82 santigrat derecelik beklenen sıcaklıkta yaklaşık 30 dakika sonra DNA amplifikasyonu ile B.tabaci olarak doğru bir şekilde tespit edildi. Bu yöntem, geliştirildikten sonra Bemisia tabaci'nin hızlı ve kolay yerinde tanımlanmasının önünü açmıştır. Protokol, sınırlı laboratuvar eğitimi ile bitki sağlığı müfettişleri tarafından yapılabilen şekilde tasarlanmıştır.
Bitki ithalat ürünleri için İsviçre giriş noktasında yöntemin başarılı yerinde doğrulama sonra, yöntem diğer bitki patojenleri için adapte edilebilir, aynı zamanda, gerekirse, diğer insan veya veteriner patojenler için.
Genel Bakış
Bu makale, loop-aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) teknolojisi kullanarak Bemisia tabaci için hızlı bir tanımlama testi sunmaktadır. Yöntem, minimum laboratuvar eğitimi gerektirerek, bitki ithalatlarının giriş noktalarında yerinde uygulanmak üzere tasarlanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki patolojisi
- İstilacı tür yönetimi
- Tanı teknolojisi
Arka Plan
- Bemisia tabaci, dünya genelinde mahsulleri etkileyen istilacı bir böcek zararlısıdır.
- Yayılımını önlemek için erken teşhis kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler, hızlı saha testleri için uygun olmayabilir.
- LAMP teknolojisi, hızlı tanılama için gelecek vaat eden bir çözüm sunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Bemisia tabaci'yi tanımlamak için hızlı ve güvenilir bir analiz yöntemi geliştirmek.
- Havalimanları ve limanlar gibi ithalat noktalarında yerinde test imkanı sağlamak.
- Ticaret yoluyla zararlı yayılımı riskini azaltmak.
Kullanılan Yöntemler
- LAMP reaksiyon ana karışımının hazırlanması ve DNA ekstraksiyonu.
- 65 °C'de izotermal DNA amplifikasyonu.
- Amplifikasyon ürünlerinin erime sıcaklığı analizi.
- Sonuçların otomatik bir uygulama kullanılarak doğrulanması.
Temel Sonuçlar
- 80 örneğin 75'i gerçek pozitif olarak doğru şekilde tanımlanmıştır.
- İki örnek gerçek negatif olarak doğru şekilde tanımlanmıştır.
- Üç örnek yanlış negatiftir.
- Yöntem, müfettişler tarafından sahada başarıyla valide edilmiştir.
Sonuçlar
- LAMP analizi, zararlıların tanımlanması için hızlı ve etkili bir yöntem sunar.
- Sınırlı laboratuvar eğitimine sahip kişiler tarafından gerçekleştirilebilir.
- Yöntem, diğer patojenlere uyarlanma potansiyeline sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bemisia tabaci gibi istilacı zararlıların hızlı moleküler tanımlanması, tarımsal kayıpların önlenmesi ve küresel tedarik zincirlerinin korunması açısından kritik öneme sahiptir. LAMP analizi, giriş noktalarında yerinde tespite olanak tanıyarak merkezi laboratuvarlara olan bağımlılığı azaltır ve yanıt sürelerini hızlandırır. Bu durum, tarımsal biyoteknolojide proaktif risk yönetimini ve uluslararası ticaret uyumluluğunu desteklemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bemisia tabaci tür kompleksiyle spesifik tespit yapılmasını sağlayarak, vektör-patojen etkileşim çalışmalarındaki hipotez testlerini destekler.
- Operasyonel Değer: Preklinik modellerde böcek vektör yetkinliğinin doğrulanması için standardize edilmiş bir moleküler hedef sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: 60 dakika içinde kantitatif amplifikasyon sinyalleri üreterek böcek örneklerinin yüksek kapasiteli taranmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Minimum örnek girişi ve stabil liyofilize reaktifler kullanarak analizin ölçeklenebilirliğini ve saha uygulamalarını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilgili sistemlerde vektör varlığı ile virüs bulaşma riski arasındaki korelasyonun kurulmasını kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Kontrollü ortam çalışmalarında zararlı popülasyonlarının boylamsal izlenmesini destekler.
İş Akışı ve Süreç Entegrasyonu
Bu analiz, patojen iletim çalışmaları öncesinde hızlı vektör tanımlaması sağlayarak erken keşif iş akışlarına uyum sağlar ve sonraki analizler için bilinçli örnek seçimini mümkün kılar.
- Keşif Biyolojisi: Vektör-virüs etkileşim deneylerindeki yanlış ilişkilendirmeleri azaltmak için vektör kimliğini doğrular.
- Tarama: Dahili kontrollerle birlikte ikili okuma (pozitif/negatif) sağlayarak analiz hazırlığını ve tekrarlanabilirliği garanti eder.
- Analitik: Standardize edilmiş veri yorumlaması ve laboratuvarlar arası tutarlılık için otomatik doğrulama yazılımlarıyla entegre olur.
- Translasyonel Araştırma: Yeni ortaya çıkan bitki virüsü tehditleri açısından ilgili coğrafi bölgelerde vektör yaygınlığının izlenmesini sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kit tabanlı tasarım, birden fazla denetim sahasında yeniden kullanıma ve diğer vektör türlerine adaptasyona olanak tanır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Biyolojik çalışmalarda böcek vektörlerin yanlış tanımlanmasını azaltarak hedef güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: DNA saflaştırma ve termal döngü ihtiyacını ortadan kaldırarak teknik engelleri ve eğitim gereksinimlerini düşürür.
- Stratejik Değer: Zararlı risk değerlendirmelerinde karar alma süreçlerini hızlandırarak potansiyel ürün kaybını ve ekonomik etkiyi azaltır.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış vektör tespit verilerine dayalı olarak gözetim kaynaklarının risk ayarlı önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Reaktiflerin kullanımı ve örnek hazırlama için temel moleküler biyoloji eğitimi.
- LAMP uyumlu floresan veya türbüidite (bulanıklık) tespit cihazına erişim.
- Örnek taşıma ve kontaminasyon kontrolü için standart çalışma prosedürleri.
- Farklı böcek türleri veya gelişim aşamaları için adaptasyon değerlendirmeleri.
- Saha uygulamaları ve depolama sırasında reaktiflerin çevresel stabilitesi.
