Name: Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Öğrenin fare kan-testis bariyeri bütünlüğünü inulin-FITC enjeksiyonu ile değerlendirme yöntemini. Bu teknik C57Black/6 erkek farelerde üreme biyolojisi ve toksikoloji araştırmaları için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser ayırt edici genç bilim adamları için (BK20150047), Doğa Bilimleri ulusal anahtar R & D Çin programı (2016YFA0500902), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31471228, 31771653), Jiangsu Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Jiangsu Eyaleti (BK20140897, 14KJA180005) ve Jiangsu Eyaleti K.Z. için yenilikçi ve girişimci Program temeli

Tüm gerçekleştirilen hayvan deneyleri Nanjing Tıp Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanmış olması. Erkek C57BL/6 fare kontrollü photoperiod koşullar altında tutuldu ve yiyecek ve su ile temin edildi.
1. hazırlıkları
<ol><li>
Mikroenjeksiyon kılcal
	<ol>
<li>Mikroenjeksiyon kılcal bir dış çap, iç dimeter ve 1.0 mm, 0.8 mm ve 10,0 cm, uzunluğu ile sırasıyla kullanın.</li>
		<li>Cam kılcal kapiller çektirme (Şekil 1A) ile çek. Test ve bağlı olarak kullanılıyor kapiller çektirme makine ayarlarını yapın.</li>
		<li>Pipet ipuçları 50 µm çapı uç kılcal almak için kullanılacak forseps ile bölünürler. Not: İpuçları testis nüfuz için çok uzun olabilir.</li>
		<li>30 ° açı ipucunda micropipette beveler (Şekil 1 c) kullanarak keskinleştirme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaktifler
	<ol>
<li>%1 Fentobarbital sodyum hazırlamak: Fentobarbital sodyum fosfat tamponlu tuz (PBS) (adım 2.3.3) 10 ml 100 mg geçiyoruz.</li>
		<li>10 mg/mL inulin-FITC hazırlamak: inulin-FITC PBS (adım 2.1.6) 100 μL 1 mg geçiyoruz.</li>
		<li>%4 paraformaldehyde hazır olun: paraformaldehyde (PFA) 4 g PBS (adım 2.3.3) 100 ml geçiyoruz.</li>
		<li>% 30 sükroz hazırlamak: PBS (adım 2.3.4) 10 ml 3 g sükroz geçiyoruz.</li>
		<li>% 0.1 kadmiyum klorür hazırlamak: kadmiyum klorür PBS (adım 2.1.1) 10 ml 10 mg geçiyoruz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yöntemleri
<ol><li>
Anestezi ve hastayabenzer hazırlık
	<ol>
<li>8-hafta-yaşlı C57BL/6 erkek fareler tartmak ve CdCl2gerekli doz hesaplayın. Bir grup farelerin tedavisinde (n = 3) CdCl2 (5 mg/kg c.a., IP) ameliyattan önce 3 d için. Başka bir grup 8 haftalık C57BL/6 erkek farelerin tedavisinde (n = 3) denetimi olarak PBS ile.</li>
		<li>Steril enjektör, iğne, makas ve forseps kullanarak aseptik koşullar altında ameliyat.</li>
		<li>Anestezi çalışma çözüm taze hazırlayın. Anestezi gerekli doz Fentobarbital sodyum/kg vücut ağırlığı 70 mg dır. Ortalama olarak, 8 hafta-in yaş, Yetişkin bir C57BL/6 fare 175 μL % 1 Fentobarbital sodyum (1,75 mg-fare de) karşılık gelen ~ 25 g ağırlığında. Not: Fentobarbital sodyum steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde (PBS) feshedilmiştir. Çözüm tarafından 0.22 um filtre kullanılan önce filtre ünitesi.</li>
		<li>% 75 etanol ile cerrahi alan temiz ve temiz doku havlu ile alanı kapsamaktadır.</li>
		<li>Termostatik ısıtıcıyı ve 37 ° c sıcaklık ayarlama</li>
		<li>İnulin-FITC çalışma çözüm (10 mg/mL) ameliyat günü hazırlamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cerrahi müdahale
	<ol>
<li>8-hafta-yaşlı C57BL/6 erkek fareler tartmak ve anestezi gerekli doz hesaplayın.</li>
		<li>Mayi iğne Fentobarbital sodyum 1 mL steril Ģırınga kullanarak gerçekleştirin. Fare temiz bir kafeste tutmak.</li>
		<li>Göz refleks tepki ve nefes desen tam anestezi altında olduğunu doğrulamak için fare gözlemlemek. Not: Genellikle, 10-15 dk ihtiyaç vardır fare derinden, ayak çimdik yanıt toplam eksikliği ve bakım yavaş, düzenli nefes alma ile anestezi kadar.</li>
		<li>Fare operasyon alanına taşıma ve onun göz çevresi kuruluğu (Şekil 2A) anestezi sırasında önlemek için nemli bir doku kağıt ile kaplayın.</li>
		<li>Karın onun saç tıraş makinesi ile tıraş ve cerrahi alan % 75 etanol ile dezenfekte.</li>
		<li>Keskin makas ile karın duvarı ortaya çıkarmak için Prepusyal bezleri üzerinde 1 cm cilt kesi yapmak. Karın duvarına küçük forseps ile Asansör ve periton boşluğu (Şekil 2B) ortaya çıkarmak için bir 0,5 cm kesi yapmak.</li>
		<li>Forseps testis ve epididim çevresinde yağ yastıkları aramak için kullanın. Dikkatli bir şekilde yağ yastıkları bağlı testis açıkça ortaya çıkarmak için çıkar (Şekil 2C ve 2D). Genellikle, bir testis teker teker çalışır. Not: Yağ yastıkları ve testis elleriyle dokunmaktan kaçının.</li>
		<li>Yağ yastıkları ve testis (Şekil 2C) altında bir kağıdı (9 cm çapında) yerleştirin.</li>
		<li>İnulin-FITC mikroenjeksiyon pipet enjekte ve micromanipulator birimi (Şekil 1 d) bağlayın. Yavaşça mikroenjeksiyon pipet tunica albuginea altında Ekle ve inulin-FITC 20 μL toplam (Şekil 2E ve 2F) testis interstitium yükleyin. Not: Dikkatli hareket önlemek için Mikroenjeksiyon pipet düşürmek.</li>
		<li>İnulin-FITC testis (Şekil 2 g) içinde hareketi izlemek.</li>
		<li>Hemen testis enjeksiyon tamamlanmasından sonra karın boşluğuna geri koymak.</li>
		<li>Kontralateral testis yordamı yineleyin. Bu testis bir denetim olarak PBS 20 μL ile enjekte edilir.</li>
		<li>Cerrahi sütür ile cilt kapatın ve termostatik ısıtıcı (Şekil 1B) ısı pad için fareyi hareket ettirin. Subkutan enjeksiyon yoluyla vücut ağırlığının 1 kg başına analjezik (buprenorfin) 1 mg doz yönetmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Testisler ve donmuş bölümleri hazırlık hasat
	<ol>
<li>40 dakika sonra enjeksiyon, hayvan bakımı göre servikal çıkığı tarafından alıcı fare ötenazi ve yönergeleri kullanın.</li>
		<li>Keskin makas testis toplamak için kullanın. Testis her türlü kan kirlilik buz gibi PBS 1 mL yerleştirin.</li>
		<li>4 12-24 h. atma için 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde (PFA) testis tamir % PFA ve yıkama doku 3 x 1.5 mL % 1 PBS oda sıcaklığında ile.</li>
		<li>% 30 sükroz dokusunda gecede kurutmak. Testis gömme çerçevede koymak ve doku en iyi kesim ısı bileşik (OCT) kapsar. OKT'yi dondurulur sonra tüm sınav-ebilmek var olmak örtülü OCT ile gömme çerçeve OCT ile doldurun.</li>
		<li>Bir cryostat-20 ° C'de 5 mikron kalınlığında, dondurulmuş kesitleri testisler, kesilmiş ve onlara mikroskop slaytlar için uygun. Not: Kuru buz içinde katıştırılmış doku Refreezing kesme için sertlik artabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Görüntü talep
	<ol>
<li>Slaytları oksijen bir kutuya koyun. Slaytlar, oda sıcaklığında 10 dakika sıcak.</li>
		<li>Bölüm 3 yıkama x Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) Oda sıcaklığında ile.</li>
		<li>Karanlıkta 5 min için kuruması. Herhangi bir kalıntı TBS tozsuz kağıt ile yok etmek.</li>
		<li>Kesitleri ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kapsar. Ters coverslip mikroskop slayttaki bir yer.</li>
		<li>Confocal mikroskop kullanarak görüntüleri elde etmek. Toplam 20 X büyütme parlak floresan sinyali algılamak için genellikle yeterli olur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
<li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).</li>
<li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+seamless+trespass%3A+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li>
<li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+testis+in+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li>
<li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Mechanisms+In+Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li>
<li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier%3A+Its+Biology+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Review%22%5BJournal%5D)">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li>
<li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li>
<li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li>
<li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li>
<li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li>
<li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+%27blood-testis+barrier%27+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li>
<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sperma seminifer epitel yer alır ve germ hücreleri ve somatik hücreler tarafından yönetilir son derece düzenli ve dinamik bir süreçtir (Örneğin, Sertoli hücreleri)13. Sertoli hücreleri tarafından oluşturulur, BTB yapısı bir bazal ve apikal bir bölme seminifer epitel ayırır. Segregasyonun ve haploit germ hücre gelişimi bir bağışıklık bariyer14oluşturan apikal kompartımanda oluşur.
BTB işlev tarafından toxicants veya hücre kavşakl...

Memeli sperma spermatogonial kendini yenileme ve spermatocytes aracılığıyla hangi dramatik sırasında farklılaşma yolu ile spermiogenesis, mitoz ve mayoz haploit sperm hücreleri içine kapsayan son derece yapılandırılmış bir süreç olarak kabul edilir biyokimyasal ve morfolojik değişiklikler oluşur. Gelişmekte olan germ hücreleri aşamalı olarak lümen doğru Seminifer tübül tabanından taşınmaktadır. Bu işlem germ hücreleri ve Sertoli hücreleri1,2arasında hücre-hücre kişiler tarafından düzenlenmiştir. Bitişik Sertoli hücreleri Seminifer tübül Bankası bulunan BTB oluştururlar. BTB fiziksel olarak bir bazal ve bir adluminal bölme epitel ayırır. VIII - IX epitel döngüsünün aşamaları sırasında bazal bölmeleri gelen preleptotene/leptotene spermatocytes adluminal bölmeleri3girme BTB karşıdan karşıya geçirin. Bu nedenle, BTB fonksiyonu mayoz ve spermiogenesis4,5,6tamamlanması için bir immunoprivileged microenvironment sağlamaktır. Sadece sıkı kavşak (TJs) oluşan diğer kan doku engelleri farklı olarak (Örneğin, kan - beyin bariyerini), BTB tarafından dört farklı kavşak (TJs, ektoplazmik Uzmanlıklar, gap kavşaklar ve ara filaman tabanlı oluşturulur desmosomes)1,7arasında Sertoli hücreleri.
Birçok çalışma mekanizmaları BTB bütünlük7,8,9araştırmak için genetik olarak değiştirilmiş fare, virüs enfeksiyonları ve çevre toxicants kullandık. BTB bozulma Engelli sperma ve subfertility ya da kısırlık neden olmaktadır. BTB oluşumu ve bütünlük kişiler arasında Sertoli hücreleri8etkilenmeye teyit edilmiştir beri izole Sertoli hücre birincil kültür temel bir vitro modeli kullanılan BTB çalışma için. Ancak, bu model doğru BTB dinamiği içinde vivotaklit edemez. Ayrıca, germ hücre Sertoli hücreleri ile eş böyle kültür yok yeteneğine sahip tüm ilgili yapısal ve işlevsel bileşenleri BTB10,11yansıtan olarak kurulmuştur.
Genel olarak, VIVO BTB bütünlük deneyleri genellikle küçük moleküllerin, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin ve FITC Birleşik inulin (inulin-FITC) dayanır. Normalde, biotin veya inulin-FITC bazal yuvası üzerinden difüzyon BTB yapısı tarafından engellenir. Bu nedenle, biz kontrol grubu ile karşılaştırıldığında BTB hasar ölçüde değerlendirmek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. BTB sonunda adluminal bölme göstergeleri olarak girin küçük moleküller için erişilebilir süre BTB uyaranlara, kadmiyum klorür (CdCl2)12, tedaviyle gibi belirli türleri ile tehlikeye girebilir.
Bir erken vivo içinde BTB bütünlük tahlil biotin veya inulin-FITC ameliyat içerir ve invaziv, karmaşık ve zaman alıcı juguler ven enjekte içerir. Ayrıca, muhabir maddeler kan dolaşımı yoluyla tüm vücuda diffüz olarak biotin veya inulin-FITC seminifer tübüllerin içinde yerel konsantrasyonu sınırlıdır. Ayrıca, sistemik pozlama bağışıklık tepkileri neden olabilir. Burada, inulin-FITC küçük bir aliquot bir testis interstitium içine direkt enjeksiyon etkinleştirme basit ve etkili içinde vivo BTB bütünlük tahlil mevcut. İkincil antikorlar gerekli değildir olarak etiketleme yöntemi floresan, boyama işlemi uygun, kullanmaktır. Burada, floresan boya testis girme sürecinin görüntülenir.

<table><tbody><tr><td>Kılcal çektirme&nbsp;</td><td>SUTTER INSTRUMENT (ABD)</td> <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (ABD)</td> <td>SH30258.01</td><td>1 ve kez seyreltme; ddH 2 O</td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma (ABD)</td> <td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Yapışma mikroskobu slaytları</td><td>CITOGLAS (Çin)</td> <td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Kadmiyum klorür</td><td>Sigma (ABD)</td> <td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss (Almanya)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Tozsuz kağıt</td><td>Kimberly-Clark (ABD)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inulin-FITC</td><td>Sigma (ABD)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon kılcal damarları</td><td>Zhengtianyi (Çin)</td><td>BJ-40</td><td>1,0 mm & kez; 0,8 mm & nbsp; & kez; 100 mm</td></tr><tr><td>Mikropipet beveler</td><td>NARISHIGE (JAPONYA)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>SAKURA (JAPONYA)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma (ABD)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodyum</td><td>Merck (Almanya)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş makinesi&nbsp;</td><td>Yashen (Çin)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Nikon (JAPONYA)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (Çin)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi aletler</td><td>Daha güçlü (Çin)</td><td></td> <td>makas, forseps, iğne tutucu</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>KDL (Çin) 20163150518</td><td></td> <td>0,45 mm ve kez; 0,16 mm RW LB</td></tr><tr><td>termostatik ısıtıcı</td><td>KELL (Nanjing, Çin)</td> <td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>10x TBS, pH 7.6</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M Tris</td><td>Sangon Biotech (Çin)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1.37 M Nacl</td><td>Sangon Biotech (Çin)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

fare kan-testis bariyeri bütünlük çalışma için in vivo yöntemi

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Sperma testis seminifer tübüllerin içinde olgun sperm hücreleri içine spermatogonia gelişmedir. Bu işlem Sertoli hücre kavşaklar, memeli vücuttaki dar doku engeldir ve iki bölmeleri, bir bazal ve bir adluminal seminifer epitel diğer kan-testis bariyeri (BTB), tarafından desteklenmektedir. BTB germ hücreleri için benzersiz bir microenvironment mayoz oluşturur ı / II ve sperm ile spermiogenesis içine postmeiotic spermatids gelişimi için. Burada, fare testis içinde vivobütünlüğünü BTB izlemek için güvenilir bir tahlil açıklayın. Sağlam bir BTB FITC Birleşik seminifer tübüllerin apikal bölmesinin inulin bazal üzerinden difüzyon engeller. Bu teknik gen adaylar, virüsler veya BTB işlevi veya kolay bir prosedür ve cerrahi becerileri alternatif yöntemlerine göre en az bir şartı ile bütünlüğü etkileyen çevresel toxicants çalışmak için uygundur.

BTB bütünlük tahlil gerçekleştirmek için deneysel set-up Şekil 1' de gösterilen. Çekin ve mikroenjeksiyon kılcal bir kılcal çektirmenin ve micropipette beveler, sırasıyla keskinleştirmek (Şekil 1A ve 1 C). Termostatik ısıtıcı ve mikroenjeksiyon donatımı Şekil 1B ve 1 Dgösterilmiştir.
Şe...

Burada, inulin-FITC testis enjekte edilerek kan-testis bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu genetik ve çevresel öğeleri tarafından tehlikeye girebilir kan-testis bariyer bütünlüğünü incelemek için bir verimli vivo içinde yöntemidir.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Bu yöntem, gen adayları, virüsler veya kan testis bariyer fonksiyonunu veya bütünlüğünü etkileyebilecek çevresel toksinler hakkında biyoloji alanlarının kan testibariyerindeki anahtar soruların yanıtlatılabilir. Ameliyattan üç gün önce, en az üç sekiz haftalık C57Black/6 erkek fareleri günlük olarak vücut ağırlığı kadmiyum klorür başına beş miligram intraperitoneal enjeksiyon ile tedavi edin. Ameliyat günü, %75 etanol sterilize edilmiş cerrahi alanın üzerine temiz bir doku yerleştirin ve termostatik ısıtıcıyı 37 santigrat dereceye ayarlayın.Doku üzerine bir anestezili fare yerleştirin, sonra parmak sıkışma yanıt eksikliği onaylamak. Bir tıraş makinesi ile karın saç tıraş ve% 75 etanol ile maruz kalan cilt dezenfekte. Karın duvarını ortaya çıkarmak için preputial bezlerin üzerinde bir santimetrelik deri kesi yapmak ve periton 0.5 santimetrelik bir kesi yapmak için cildi kaldırmak için küçük forsepskullanın.Epididim ve testis etrafında yağ pedleri aramak için forseps kullanın, dikkatle bir ekli testis ortaya çıkarmak için yağ yastıkları çekerek. Yağ pedleri ve testis altında dokuz santimetrelik bir kağıt parçası yerleştirin ve taze hazırlanmış inulin-FITC çözeltisi ile bir mikroenjeksiyon pipet yükleyin. Pipeti bir mikromanipülatör ünitesine bağlayın ve mikroenjeksiyon pipet ucunu tunica albuginea'nın altına hafifçe yerleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.Testisinterstitium içine inulin-FITC 20 mikrolitre teslim etmek için yavaş yavaş çalışma kolu döndürün. Teslimat başarılı olursa, testis parlak yeşil-sarı renk dönecektir. Hemen karın boşluğuna testis dönmek ve pbs 20 mikrolitre ile kontralateral testis enjekte, sonra cerrahi bir dikiş ile cilt kapatın.Ve fareyi termostatik ısıtıcının ısı yastığının üzerine yerleştirin. Enjeksiyondan 40 dakika sonra, her fareden testisleri toplamak için keskin makas kullanın ve dokuları bir mililitre buz gibi PBS'de yıkayın. Daha sonra, 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede %4 paraformaldehit testislerini düzeltin ve ardından yıkama başına %1 PBS'nin 1,5 mililitresinde üç yıkama yapın.Bir gecede %30 sakaroz dehidratasyonundan sonra, numuneleri tek tek gömme çerçevelere aktarın ve dokuları optimum kesme sıcaklığı bileşiğiyle kaplayın. Bir kriyostat'ın sıcaklığını negatif 20 santigrat dereceye ayarlayın ve kareleri OCT dondurulana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca kriyostatta yerleştirin. Daha sonra, tüm testis her kalıp kaplı olana kadar taze OCT ile her gömme çerçeve doldurun.OCT'nin ikinci katmanı donduğunda, her testisin beş mikrometre kalınlığındakesitlerini elde ederek doku kesitlerini cam mikroskop slaytlarına geçirin. Örnekleri görüntülemek için, önce slaytları oda sıcaklığında nemli bir kutuda ısıtın. 10 dakika sonra, slaytları her yıkama da taze Tris-tamponlu tuzlu üç kez yıkayın ve bölümlerin ışıktan korunan beş dakika kurumasını bekleyin.Artık tuzlu eti çıkarmak için tozsuz kağıt kullanın ve numuneleri DAPI destekli montaj ortamına monte edin. Daha sonra, her numuneyi ters bir kapak fişiyle kaplayın ve bir konfokal mikroskobun 20X hedefi altında örnekleri görüntüleyin. Kadmiyum klorür tedavisi üç gün kan-testis bariyerinde inulin-FITC difüzyon bazal bölmesi seminiferous epitel apikal bölmesi sağlayan hasara neden olur.Buna karşılık, bu difüzyon kontrol PBS tedavi testislerinde bloke edilir. Kan-testis bariyer hasarının boyutu, inulin-FITC difüzyonmesafesinin aynı seminiferous tübülün yarıçapına oranı hesaplanarak belirlenir. Ayrıca, heterozigot Rictor'daki sağlam kan testi bariyeri, nakavt farebloklarını bariyer boyunca apikal bölmeye doğru itmiyet emdirirken, koşullu Rictor nakavt farelerin inulin difüzyonuna izin veren kan testis bariyeri vardır.Bu prosedürü denerken, deney günü hazırlanan inulin-FITC'yi teslim etmeyi ve FITC ışığa duyarlı bir molekül olduğu için dokuyu ışıktan korumayı unutmamak önemlidir. Bu tekniğin etkileri bozulmuş spermatogenezin tedavisine kadar uzanır, çünkü kan-testis bariyerinin işlevi spermatogenezde meyyozisin tamamlanması için bağışıklık ayrıcalıklı bir mikroortam sağlamaktır. Gelişiminden sonra, bu teknik farelerde subfertilite ve kısırlık keşfetmek için üreme tıbbı alanında araştırmacılar için bir yol sağlar.Paraformaldehitlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken giysi ve yüz maskesi takmagibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

an-in-vivo-method-to-study-mouse-blood-testis-barrier-integrity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

An<em&gt; In vivo</emKan Gemi Geçirgenlik Test&gt; Test

Testis fare hücreleri için bir transfeksiyon tekniği Spermatogenezisin benzersiz süreçleri incelemek için bu makalede, in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis Elektroporasvon açıklar. Sunulan protokol, elektroporasyon ile cam kılcal hazırlanması götürücü kanalı yoluyla mikro-enjeksiyon, ve transfeksiyon adımlar içerir.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

Biz matris jel fiş anjiyogenez testinin bir varyasyon kullanarak fare insan endotel-pericyte etkileşimleri incelemek için bir protokol mevcut.

Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Burada, testis 'teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Bu protokol, seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarını temsil eden yetişkin fare seminifer tübüllerinin segmentlerinin transilluminasyon destekli mikroseksiyonunu ve buradaki hücre tiplerini ve daha sonra kabak preparatlarının ve bozulmamış tübül segmentlerinin immünostainasyonunu açıklar.

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Bu protokolde, submandibuler bezin (SMG) endotel bariyer fonksiyonu, iki fotonlu lazer taramalı mikroskop altında test hayvanı modellerinin açısal damarlarına in vivo olarak farklı moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler enjekte edilerek değerlendirilmiştir.

İn Vivo Fare Submandibuler Bezinde Vasküler Geçirgenlik Tespiti

Bu çalışmada, floresein-izotiyosiyanat etiketli (FITC) dekstran, hem in vivo hem de plazma ve dışkı örneklerinde bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için farelere oral gavaj yoluyla uygulanmaktadır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu birçok hastalık sürecinde etkilendiğinden, bu doğrudan ve nicel tahlil çeşitli araştırma alanlarında kullanılabilir.

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Öğrenin fare kan-testis bariyeri bütünlüğünü inulin-FITC enjeksiyonu ile değerlendirme yöntemini. Bu teknik C57Black/6 erkek farelerde üreme biyolojisi ve toksikoloji araştırmaları için değerli bir araç sunar.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Daha fazla video keşfet